噬菌体抗体库技术的研究进展

从显示在丝状噬菌体表面的重组抗体库中选择抗体的方法已成为获得试剂、诊断及治疗的重要手段。本文介绍该技术的原理、发展及运用,但着重描述如何利用细胞筛选、改进洗脱条件、增加库容及进一步筛选以获得高亲和力抗体的方法。     

噬菌体展示抗体库筛选技术研究进展

噬菌体展示技术已成为制备高亲和力抗体的强有力的工具。而噬菌体抗体库的筛选是在获得高亲和力抗体过程中很关键的一个环节。总结了针对不同复杂程度的抗原所须采用的不同筛选方法,并简单介绍了高通量筛选的优势。     

利用重组系统构建大容量噬菌体抗体库

噬菌体抗体库技术是获得人源抗体的重要方法,此文探讨大容量天然噬菌体抗体库在筛选人源抗体中的实际应用价值。从正常人外周血分离淋巴细胞,通过基因工程方法获得抗体基因并且构建到含有重组位点的载体pDF中获得初级噬菌体抗体库,初级库在重组系统中重组之后获得了容量为9×1010的天然Fab噬菌体抗体库,通过序列测定和重组蛋白筛选来对抗体库的质量进行初步鉴定。对随机挑取的96个克隆测序序列分析表明各种型别比例基本合适;用四种抗原筛选有明显的富集,并且获得了针对其中一种抗原的阳性抗体克隆。     

噬菌体抗体库筛选技术

噬菌体展示技术（Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）为制备高亲和性抗体提供了有力的工具。噬菌体抗体库的筛选是其中关键的环节,为了提高筛选效率,用包被在固体表面的抗原进行筛选的传统方法不断地被改进,如宿主菌直接洗脱和双层膜筛选系统和抗抗体替代抗原筛选系统。将噬菌体感染宿主菌的过程与筛选过程相关联,产生了选择性感染筛选系统。     

噬菌体抗体库技术在肿瘤抗体药物研究中的进展及应用

目的:综述噬菌体抗体库技术的研究进展,介绍该技术的原理,构建,筛选和应用,为抗肿瘤抗体药物研发提供参考。方法:采用文献综述的方法,筛选近5年来噬菌体抗体库技术试验论文,对噬菌体抗体库技术的原理,构建,筛选和应用进行总结。结果:噬菌体抗体库主要分为免疫抗体库和非免疫抗体库两大类;噬菌体抗体库筛选技术包括亲和筛选、细胞筛选和生物体内筛选三种;噬菌体抗体库技术主要应用于肿瘤标志物的识别和肿瘤诊断,抗肿瘤抗体药物的筛选和制备。结论:噬菌体抗体库技术方便、快速、高效,可以在体外环境下培养,这些特点决定了其在肿瘤标志物的发现和肿瘤抗体药物研发中的广泛应用。目前噬菌体抗体库技术还存在一定缺陷,但技术的不断发展和革新必然使噬菌体抗体库技术成为研制抗体药物的新思路,极大促进了肿瘤抗体药物的研发。     

β淀粉样蛋白人源性抗体的制备

目的:应用噬菌体展示及抗体库技术,制备并鉴定β淀粉样蛋白(Aβ)人源性抗体。方法:应用固相筛选方法,以人工合成的Aβ1-15肽为靶标分子,在大容量全合成人源性噬菌体抗体库中筛选抗Aβ人源性抗体,并进行特异性鉴定。结果:经过3轮筛选,单克隆鉴定获得噬菌体抗体F11,竞争性ELISA表明抗体对Aβ1-42的结合位点位于1～15氨基酸残基内,ELISA结果证实抗体特异性良好。结论:以Aβ1-15肽为靶标分子获得了特异性良好的人源性抗体。     

基于细胞的噬菌体抗体库筛选技术

肿瘤细胞表面抗原的表达量低,免疫原性弱,因抗原构象改变的原因,用传统的固定化抗原方法很难获得有价值的噬菌体抗体。这类抗原大多具有复杂的结构,且其转运、定位与细胞类型及所处的微环境有关。在基于细胞的筛选中,靶抗原以天然状态存在,不需纯化,甚至可以对未知抗原进行筛选,因此广泛用于对内化抗体和血管内皮抗原表位抗体的筛选。基于细胞的抗体筛选中的主要问题是因非特异结合造成的选择背景过高,迄今,已有许多旨在改善选择灵敏度和特异性的研究开展起来。随高通量流式细胞术、组合化学及蛋白质组学研究技术在细胞筛选中的运用,必将使其日趋实用和成熟。我们拟以细胞和组织筛选的技术做一概括,为了解基于细胞的筛选和优化设计提供参考。     

从混合的噬菌体抗体库中直接筛选高亲和性的抗肿瘤坏死因子-α人源单克隆抗体

采用噬菌体抗体库技术,从未经免疫的混合人噬菌体抗体库直接筛选抗ＴＮＦα的人源单克隆抗体,３种不同的检测手段表明,经过５轮的筛选,能够与ＴＮＦα结合的噬菌体抗体得到了有效的富集。对所获得的噬菌体抗体克隆进行的初步鉴定表明,７个噬菌体抗体克隆能有效地与人重组ＴＮＦα结合,并且这种结合具有特异性,由这７个噬菌体抗体克隆制备的抗体Ｆａｂ片段也能有效地与ＴＮＦα结合。由此,我们通过噬菌体抗体技术直接获得了ＴＮＦα的人源单克隆抗体,这为进一步制备具有临床应用前景的人源抗ＴＮＦα单克隆抗体打下了基础。     

基于细胞的抗单增李斯特菌单域重链抗体的筛选及鉴定

【目的】获得针对单增李斯特菌的特异性单域重链抗体,并对筛选过程中特异性克隆的富集规律进行分析,为筛选具有种属特异性的噬菌体展示抗体提供参考。【方法】采用固相筛选技术,以热灭活的单增李斯特菌菌体为抗原,通过四轮常规筛选和一轮消减筛选,从驼源天然噬菌体展示文库中筛选针对单增李斯特菌的单域重链抗体。采用Phage-ELISA法,对后四轮筛选洗脱物中随机挑选的噬菌体进行鉴定,阳性克隆进行基因测序及结合特异性分析。通过多序列比对分析将获得的基因序列进行分组和统计。【结果】成功筛选到2株单增李斯特菌特异性的单域重链抗体。【结论】在优化的筛选条件下,基于全细胞的筛选方法能够获得特异性识别单增李斯特菌的单域重链抗体,消减筛选对于去除非特异性克隆是有效的和必要的。     

人源天然ScFv噬菌体抗体库的构建及鉴定

噬菌体抗体库技术是获得治疗性抗体的一条重要途径。以20份健康人外周血为样本,通过提取淋巴细胞、逆转录－PCR（RT PCR）、抗体可变区基因的扩增、重叠PCR获得单链抗体（ScFv）基因,将ScFv克隆入噬粒载体,通过近300次的电转化获得了库容量为1.3×109的全人源天然ScFv噬菌体抗体库。通过随机挑克隆测序和用5种不同抗原筛选对抗体库进行了初步验证。随机测序表明抗体库具有较好的多样性,用5种不同抗原对其进行筛选,均获得了特异性噬菌体抗体的不同富集,表明成功构建了一个多样性良好的人源天然ScFv噬菌体抗体库。     

噬菌体展示技术研究进展

噬菌体表面展示技术是一种将外源蛋白或抗体可变区与噬菌体表面特定蛋白质融合并展示于其表面,构建蛋白质或抗体库,并从中筛选特异蛋白质或抗体的基因工程技术。介绍这一技术的原理、相关展示系统以及在蛋白质相互作用的研究,抗体及疫苗的制备、多肽药物的研制等方面的应用潜力和独特的优点。     

噬菌体展示技术发展

噬菌体表面展示技术是一种将外源蛋白或抗体可变区与噬菌体表面特定蛋白质融合并展示于其表面,构建蛋白质或抗体库,并从中筛选特异蛋白质或抗体的基因工程技术。随着该项技术的不断完善和发展,噬菌体展示技术已被广泛应用于生命科学研究的不同领域,并显示了良好的应用前景。     

噬菌体展示技术发展

噬菌体表面展示技术是一种将外源蛋白或抗体可变区与噬菌体表面特定蛋白质融合并展示于其表面,构建蛋白质或抗体库,并从中筛选特异蛋白质或抗体的基因工程技术。随着该项技术的不断完善和发展,噬菌体展示技术已被广泛应用于生命科学研究的不同领域,并显示了良好的应用前景。     

噬菌体抗体库构建技术在疾病防治中的应用

噬菌体抗体库技术(phage antibody library)是近年发展的一项分子生物学新技术,近年来越来越多的学者利用这项技术获得目标抗体以应用于医疗制药及安全检测等多个领域.噬菌体抗体库技术的发展和应用,为抗体技术领域带来了巨大的变化,极大地推动了各种性能优良基因工程抗体的开发和应用.针对噬菌体抗体库构建的原理、方法、构建过程中所需考虑的因素以及在不同领域的应用作了综述.     

Therapeutic antibodies: Discovery and development using the ProteOn XPR36 biosensor interaction array system

Therapeutic monoclonal antibodies are becoming a significant and rapidly growing class of therapeutic pharmaceuticals. Their discovery and development requires fast and high-throughput methodologies for screening and selecting appropriate candidate antibodies having high affinity for the target as well as high specificity and low cross-reactivity. This study demonstrates the use of the ProteOn XPR36 protein interaction array system and its novel approach, termed One-Shot Kinetics, for the rapid screening and selection of high-affinity antibodies. This approach allows multiple quantitative protein binding analyses in parallel, providing association, dissociation, and affinity constants for several antibodies or supernatants simultaneously in one experiment. We show that the ProteOn XPR36 system is a valuable tool for use across multiple stages of the therapeutic antibody discovery and development process, enabling efficient and rapid screening after panning, affinity maturation, assay validation, and clone selection.     

从大容量噬菌体抗体库中筛选抗Acr蛋白人源单链抗体

目的:从天然的大容量噬菌体抗体库中筛选特异的抗结核分枝杆菌晶体蛋白( alpha-crystallin Acr)的人源抗体.方法:以结核分枝杆菌Acr蛋白包被免疫管,通过对噬菌体抗体库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”的过程从大容量抗体库中筛选特异性抗结核分枝杆菌Acr蛋白的抗体,并对可变区序列进行了测序分析.将特异性的噬菌体抗体感染HB2151菌,经IPTG诱导表达,制备了抗结核分枝杆菌Acr蛋白的可溶性单链抗体;对其序列和抗原结合活性进行分析鉴定.结果:经过4轮筛选,获得了43个与结核分枝杆菌Acr蛋白结合的阳性克隆,其中29个特异结合的克隆;测序分析有26不同的可变区片段;通过可溶性单链抗体(scFv)表达筛选到14株特异性结合Acr蛋白的可溶性单链抗体克隆;经过基因测序,分析了可变区基因的亚群.成功制备了可溶性单链抗体.Westren blotting分析证实筛选的人源单链抗体能与天然蛋白结合.结论:利用单链大容量抗体库获得抗结核分枝杆菌Acr蛋白的噬菌体抗体并且成功制备抗结核分枝杆菌Acr天然蛋白的可溶性单链抗体,为今后的研究和应用奠定基础.     

从噬菌体抗体库中淘选血纤维蛋白特异的单链抗体

为构建小鼠噬菌体抗体库 ,以获得对人血纤维蛋白特异的抗体 ,由小鼠脾脏提取 m RNA,经反转录 PCR扩增出抗体重链、轻链可变区基因片段 ,将二者和一段编码十五肽 (Gly4 Ser) 3的 DNA接头借助重组 PCR组装成为单链抗体 (single- chain antibody,Sc Ab)基因 .将单链抗体基因插入噬菌体展示载体 p CANTAB- 5E,通过电击法转化大肠杆菌 TG1细胞 ,用辅助噬菌体 M1 3K0 7超感染 ,构建了库容量在 1 0 8以上的噬菌体单链抗体库 .利用亲和选择方法 (淘选 ) ,从噬菌体抗体库中选得血纤维蛋白特异的单链抗体 .模拟抗体成熟过程 ,用 DNA改组 (DNA shuffling)技术使抗体基因重新组合 ,构建新的改组抗体库 ,并从中选择到提高了亲和力的噬菌体单链抗体 .抗体基因在大肠杆菌中表达 ,表达蛋白经 Sephadex G- 75柱层析分离 ,得到初步纯化的单链抗体蛋白 .     

中国医学科学院北京协和医学院放射医学研究所天津市分子核医学重点实验室

血液肿瘤即造血系统的恶性肿瘤,是一种严重危害公共健康的疾病。目前,血液肿瘤诊断治疗的最理想方法就是分子特异性诊断和靶向治疗,但该方法面临的最大困难就是分子靶点的选择。噬菌体展示技术是近十年发展起来的一种新的生物学技术,具有高通量筛选、模拟天然表位、易于纯化、将蛋白功能与编码基因相统一等优点,广泛应用于功能性蛋白质和多肽的筛选、蛋白质间的识别与相互作用、抗原表位的鉴定、基因工程抗体的筛选等多个分子生物学领域,非常适于理想靶点的选择。目前,噬菌体文库技术在血液肿瘤诊治中的应用主要集中在噬菌体抗体文库和噬菌体随机肽库上。本文就噬菌体展示技术在血液肿瘤诊断治疗中的研究成果做一总结分析,并对该技术在这一领域的应用前景进行展望。     

用于筛选人工结合蛋白的骨架蛋白

抗体作为最著名的天然结合蛋白,因其具有与抗原特异结合的特性,近100多年以来无论在生物技术领域,还是在疾病的诊断及治疗方面,都发挥着广泛而重要的作用。但是抗体自身固有的局限性也在很大程度上限制了它的应用,而人工结合蛋白既具有抗体的特点,又兼具更多优势:分子更小;稳定性更高;能在大肠杆菌中高产量、高可溶性表达;易于修饰;能够达到高亲合力和高特异性;并且与抗体没有知识产权的冲突,因此被称为理想的"新一代抗体"。人工结合蛋白是从基因改造构建而成的骨架蛋白库中针对特定的靶分子筛选而得的。从骨架蛋白的概念和设计,骨架蛋白的分类,应用骨架蛋白筛选人工结合蛋白的技术以及人工结合蛋白的应用和前景等方面进行总结概述。