麻疹病毒F基因测序及其进化关系的初步分析

研究麻疹病毒疫苗株S191毒种及其传代的病毒溶血素F(Haemolysin,HL)基因稳定性;对该序列一些重要位点的氨基酸进行比较,推测其功能结构及生物学活性变化;同时对该基因与M蛋白基因之间的非编码序列进行比对分析。利用RT-PCR方法扩增S191减毒株MeV23、26、27代及一株流行株YunnanLC-10的F基因,测序后进行比对分析。S191传代病毒F基因序列之间核苷酸同源性为99.8%,氨基酸同源性为99.5%～99.6%;S191疫苗株与流行株之间核苷酸序列同源性达95.2%;疫苗株与流行株1003nt的非编码区序列同源性为85.0%。S191传代病毒F基因具有较高遗传稳定性,关键功能位点氨基酸未发生传代改变;1003nt非编码区序列变异速度较快。     

麻疹病毒S191疫苗株N基因稳定性研究及免疫细胞表位分析

研究麻疹病毒(Measles virus,MeV)疫苗株S191毒种和传代病毒核蛋白(Nucleoprotein,N)基因稳定性及其遗传与变异特点;对该序列一些重要位点的氨基酸进行比较,探讨其功能结构及生物学活性变化以及S191疫苗株的保护效果。利用RT-PCR方法扩增S191减毒株23、26、27、29、32、37不同代次N基因,测序进行比对分析。S191传代病毒N基因序列之间核苷酸同源性99.7%~100%,氨基酸同源性为99.6%~100%;S191株与7个疫苗株之间核苷酸序列同源性达99.1%~99.4%;S191和中国流行代表株序列同源性在95.0%~95.4%;S191与世界流行代表株同源性达94.7%~99.4%;S191疫苗株和中国流行代表株CHN93/7(H1a)的4个重要T细胞表位氨基酸保持一致。S191各传代病毒基因具有较高稳定性,该疫苗有一定的保护作用。     

重组CHO细胞C_(28)株S基因序列的测定及分析

目的测定重组CHO细胞C28株S基因序列,研究其遗传稳定性,并与已全基因序列测定的乙型肝炎病毒的S基因序列进行比较分析,预测和揭示现有疫苗株对当前疾病流行株的防病效果。方法从C28株中选取第22代、24代2、5代2、7代、28代2、9代3、0代、31代3、2代3、3代和34代细胞,根据GenBank中C基因型adr亚型乙型肝炎病毒的全基因序列设计引物。采用酚-氯仿法抽提CHO细胞基因组DNA,用PCR法扩增各代次细胞的S基因,回收700 bp左右的目的片段,克隆至pMD18-T载体上进行序列测定。利用生物学软件MEGA4.1和BioEdit进行S基因序列同源性分析,绘制系统进化树,分析与其他HBV病毒株S基因的同源性。应用实验动物测定C28株生产的重组乙型肝炎疫苗的效价。结果 C28株十一个代次之间S基因序列核苷酸和氨基酸同源性均为100%;C28株十一个代次S基因与其他病毒株S基因比较,与C基因型乙型肝炎病毒同源性最高,与其他基因型乙型肝炎病毒的核苷酸同源性达91.4%～95.1%,氨基酸同源性达84.5%～93.3%。免疫NIH小鼠结果显示5批重组乙型肝炎疫苗的效价均符合标准。结论 C28株S基因在传代及保存过程中具有较高的稳定性,对当前疾病流行株有较好的防病效果。     

狂犬病病毒aG株全基因组序列测定及遗传稳定性分析

目的探究狂犬病病毒(Rabies virus,RV)aG株全基因组序列特征及遗传稳定性。方法严格按疫苗生产工艺进行传代,提取主种子批、工作种子批及疫苗原液病毒RNA,通过RT-PCR技术扩增全基因组各片段基因,然后分别将其克隆到p GEM-T载体中,并进行序列测定;采用DNAStar软件包对aG株与Gen Bank中4aGV参考株(JN234411)以及18株基因1型RV参考株进行同源性分析。结果 aG株全基因组由11 925个核苷酸组成,共编码3 600个氨基酸。疫苗原液与主种子批全基因组核苷酸和氨基酸同源性均为100%,而工作种子批与主种子批的核苷酸与氨基酸同源性分别为99.97%和99.92%;aG株与4aGV参考株全基因组核苷酸与推导的氨基酸同源性均为99.9%,其与18株基因1型参考株核苷酸与氨基酸序列同源性分别为84.2%~97.6%和93.7%~98.3%;aG株传代病毒与4aGV参考株全基因组氨基酸序列高度保守,且各主要功能区未发生变异。结论狂犬病病毒aG株在实验室长期生产传代过程中,全基因组遗传特性稳定。     

轮状病毒的LLR疫苗株全基因组克隆及结构蛋白VP6基因遗传特征

目的了解轮状病毒(RV)的LLR疫苗株全基因组基因和蛋白特征、完善关键基因遗传稳定性研究,为疫苗的质量控制和研发提供依据。方法将LLR株毒种第38代在原代牛肾细胞上连续传至49代,提取第38、43、44、49代病毒RNA。通过RT-PCR方法扩增LLR株(38代)全基因组11个dsRNA片段和传代病毒VP6基因,分别将其克隆到p GEM-T载体中,进行序列测定与分析。结果 LLR株全基因组11条RNA,由18 498个核苷酸组成,共编码5 796个氨基酸;全基因组研究表明,所克隆的LLR株属于G10P[15]/NSP4[A]/SGⅠ基因型。LLR株VP6基因全长1 356 bp,含编码397个氨基酸的单一的开放读码框架(ORF)。各代次病毒的VP6基因核苷酸与推导的氨基酸变化完全一致,与Gen Bank中LLR参考株(L11595)同源性分别为99.9%和99.7%。与16株SGⅠ亚群RV代表株之间,核苷酸与推导的氨基酸序列同源性分别为84.0%~99.7%和97.0%~99.2%;与不同亚群RV代表株之间,VP6基因核苷酸与推导的氨基酸同源性分别为77.7%~82.2%和92.2%~93.5%;LLR株各代病毒VP6基因核苷酸、氨基酸序列高度保守,各关键功能区未发生变异。结论 LLR疫苗株关键基因遗传特性稳定,为在分子水平保证LLR株毒种及其生产疫苗的安全性提供了依据;其全基因组克隆,为进一步研究RV生物学、免疫学和确定该病毒的分类学地位提供了科学依据。     

乙脑病毒持续感染株preM区序列分析

为了研究乙型脑炎病毒持续感染株preM区域基因序列变异及其意义,我们将两种乙脑病毒野生株(JaGAr-01株和Nakayama株)分别感染人肝癌KN73细胞,经过多次细胞传代后建立乙脑病毒持续感染模型,收集感染细胞经反复冻融获取变异病毒。利用preM区特异引物进行RT-PCR法得到两种病毒的preM区基因片段,应用基因测序反应进行序列分析,并对两种病毒株preM区序列进行比较。preM区基因测序结果显示,与JaGAr-01野生株比较,JaGAr-01持续感染变异株(JaG-per)有1个核苷酸上碱基发生变异(第26位U→G)并导致相应氨基酸发生置换(第9位亮氨酸→精氨酸);Nakayama持续感染变异株(Nak-per)与其野生株相比则有11个核苷酸上碱基存在差异(第26位U→G,第37位G→A,第39位C→U,第45位U→C,第51位U→C,第99位U→C,第126位U→C,第165位C→U,第189位C→U,第195位C→U,第198位U→C),但仅有其中第26位、第37位、第39位的碱基变异引起相应编码的氨基酸发生置换(第9位亮氨酸→精氨酸及第13位缬氨酸→异亮氨酸)。对比还发现变异后的JaGAr-01持续感染株与Nakayama持续感染株的基因序列相同。认为乙脑病毒持续感染变异株preM区存在基因变异,这种变异可能与该区参与病毒持续感染及维持病毒生物学特性有关。     

我国四株狂犬病毒M和P基因序列分析和所编码蛋白的分析

为了解我国狂犬病毒M、P基因序列和结构特点,用RT-PCR方法获得目的基因片段,测定核苷酸序列后,计算机分析核苷酸和氨基酸序列及其功能区位点结构。结果显示四株病毒M基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为83.9%～99.5%和93.1%～99%,四株狂犬病毒M蛋白上调节病毒RNA转录和复制功能的第58位氨基酸残基均为谷氨酰胺残基(E),与特异性细胞蛋白WW区域作用的PPxY结构序列均为PPEY保守序列;四株病毒P基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为83.6%～99.8%和87.2%～99%,P蛋白与胞浆动力蛋白轻链LC8相互作用的序列位于143～148位氨基酸残基,均为DKSTQT,四株病毒P基因与L蛋白、N蛋白作用位点序列显示未发生影响其生物学功能的变异。研究结果证实了这两种蛋白结构在病毒致病性中起重要作用的推论。     

乙脑病毒持续感染株preM区序列分析

为了研究乙型脑炎病毒持续感染株preM区域基因序列变异及其意义,我们将两种乙脑病毒野生株(JaGAr-01株和Nakayama株)分别感染人肝癌KN73细胞,经过多次细胞传代后建立乙脑病毒持续感染模型,收集感染细胞经反复冻融获取变异病毒.利用preM区特异引物进行RT-PCR法得到两种病毒的preM区基因片段,应用基因测序反应进行序列分析,并对两种病毒株preM区序列进行比较.preM区基因测序结果显示,与JaGAr-01野生株比较,JaGAr-01持续感染变异株(JaG-per)有1个核苷酸上碱基发生变异(第26位U→G)并导致相应氨基酸发生置换(第9位亮氨酸→精氨酸);Nakayama持续感染变异株(Nak-per)与其野生株相比则有11个核苷酸上碱基存在差异(第26位U→G,第37位G→A,第39位C→U,第45位U→C,第51位U→C,第99位U→C,第126位U→C,第165位C→U,第189位C→U,第195位C→U,第198位U→C),但仅有其中第26位、第37位、第39位的碱基变异引起相应编码的氨基酸发生置换(第9位亮氨酸→精氨酸及第13位缬氨酸→异亮氨酸).对比还发现变异后的JaGAr-01持续感染株与Nakayama持续感染株的基因序列相同.认为乙脑病毒持续感染变异株preM区存在基因变异,这种变异可能与该区参与病毒持续感染及维持病毒生物学特性有关.     

风疹病毒JR23株包膜糖蛋白E2的遗传与变异分析

为了探讨风疹病毒(rubella virus,RV)包膜糖蛋白E2的基因与蛋白的遗传与变异特点,利用DNAstar软件比较JR23株与GenBank中各参考株E2的基因与多肽序列,分析不同RV株E2基因之间的同源性及E2蛋白功能关键区的氨基酸变异。结果表明,RV E2基因序列比较保守,但JR23株E2基因序列与其它9个分离株之间有明显差异,变异主要集中在484nt-554nt。同源性为90．3％-92．6％之间,与美国疫苗株RA27／3同源性最高,与美国疫苗株HPV77同源性最低,GendBank中的参考株间同源性较高,在96．3％-100．0％之间。E2多肽变异集中于161aa—185aa,但在E2功能关键区,如N端序列、N联糖基化位点、胞质区等则无明显变异。表明RVK2基因序列相对保守,虽然JR23株与GenBank中各参考株的E2基因序列有明显差异,但JR23株E2蛋白在功能关键区表现出遗传稳定性。此结果为阐明RV分子流行病学特征提供了理论依据,也为研究RV分子进化特征及病毒与宿主细胞的相互作用奠定了坚实基础。     

流行性乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2E基因稳定性研究

为研究乙脑病毒减毒株SA14-14-2 E蛋白基因稳定性,将乙脑病毒减毒株SA14-14-2在原代地鼠肾细胞(PHK)上传至18代,应用RT-PCR分别扩增PHK6代、PHK7代、PHK8代、PHK13代、PHK18代E蛋白基因并测序后,与Genebank中乙脑病毒减毒株SA14-14-2(D90195)进行比较分析。PHK6、PHK7、PHK8代病毒与D90195 E蛋白核苷酸和氨基酸序列完全相同。PHK13、PHK18代病毒与D90195E蛋白核苷酸序列同源性分别为99.8%、99.7%,与D90195E蛋白氨基酸序列同源性分别为99.6%、99.4%。各代次病毒E蛋白与减毒相关氨基酸未发生改变,同时所有突变的氨基酸均非SA14原有的,故不是恢复性突变。结果表明乙脑病毒减毒株SA14-14-2的遗传学特性稳定,从分子水平证明乙脑病毒减毒株SA14-14-2及其生产的疫苗具有安全性。     

Molecular and biologic characteristics of attenuated rubella viruses

AIM: To study stability/variability of rubella virus vaccine strain "Orlov-B" during its adaptation to other tissue substrate. MATERIALS AND METHODS: Vaccine strains of rubella virus Wistar 27/3 and "Orlov-B" as well as wild type strains "Orlov-D" and "Lebedev" were used. Rhesus monkeys were used as laboratory animals. Standard virological, molecular and statistical methods were applied. RESULTS: Obtained as a result of adaptation to other tissue substrate - diploid human cell line M-22 - strain "Orlov-D" demonstrated stability on RCT40 sign in in vitro experiments. Comparative genotyping of "Orlov-B" and "Orlov-D" strains on gene E1 showed identity of nucleotide sequences of both variants. Genetic stability of virus on the gene coding the most immunogenic protein E1 was confirmed in vivo: the stable high immunogenic and protective activity of both "Orlov-B" and "Orlov- D" strains was demonstrated in experiments on rhesus macaques. CONCLUSION: New data on stability of attenuated rubella virus vaccine strains have practical significance for the development of new vaccines.     

2001～2011年上海市风疹病毒分子流行病学研究

本研究对2001～2011年本实验室保存的血清标本检测结果为麻疹IgM阴性,风疹IgM阳性病例相对应的咽拭子标本进行风疹病毒（Rubella virus,RV）分离,用RT-PCR方法对细胞培养产物鉴定后扩增病毒E1基因,扩增产物用于核苷酸序列测定,并进行分子流行病学分析。结果表明,60份咽拭子标本共分离到31株RV,获得27株RV的739nt（nt8 731～nt9 469）核苷酸序列,系统同源性分析表明,27株RV分离株分别属于两个不同的基因型,除分离自2011年的11009株、11052株和11106株为2B基因型外,其他分离株均为1E基因型。27株RV分离株大部分的核苷酸突变为无义突变,氨基酸序列高度保守。24株1E基因型分离株中大部分毒株氨基酸序列完全一致,自2001年以来可能有来自同一传播链的RV在持续传播。本研究首次监测到2B基因型RV2011年开始在上海流行,经GenBank核苷酸序列比对发现,其与越南、日本、阿根廷等国家近几年的RV分离株核苷酸序列同源性达99%。由于以前对风疹的监测较少,尚不能证明其来源。     

乙型脑炎病毒结构蛋白C＋pre M和E基因的克隆与序列分析

目的对乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）结构蛋白基因进行扩增、克隆和序列测定。方法根据GenBank中发表的乙脑病毒结构蛋白基因C＋pre M基因和E序列,设计合成两对引物,以JEV Nakayama-NIH株RNA为模板,反转录并扩增目的cDNA,然后与pGEM-T easy载体连接并转化大肠杆菌DH5α菌株,提取的重组质粒用电泳、PCR和酶切鉴定后并进行测序。将JEV Nakayama-NIH与GenBank中报道的多株JEV结构蛋白C＋pre M基因和E基因序列进行了比较。结果Nakayama-NIH与其他参考株C＋pre M和E基因的核苷酸同源性为99%,证实扩增克隆的是JEV的结构蛋白C＋pre M和E基因。结论对JEV分子生物学特征进行了分析,为JEV特异性核酸探针的研制奠定了基础。     

貂、狐、貉源犬瘟热病毒的分离鉴定与序列分析（英文）

采用能稳定表达犬信号淋巴细胞活性分子（SLAM）的Vero-DST细胞从发病貉、狐狸和水貂病料,分离获得5株病毒,经电镜形态观察、RT-PCR检测、理化特性测定和人工感染发病试验鉴定,均为犬瘟热病毒（CDV）,分别命名为HT-P（貉源）、THD1（貉源）、HD（貂源）、LN（貂源）和HB（狐源）。5个分离毒株TCID50为10-5.2～-7.3/ml;除鸡、鹅红细胞呈微弱阳性外,其余均未见血凝作用;对乳鼠的LD50分别为2×10-3.8～-4.8/ml,对实验兔无致病性,对貉有明显致病性作用。5株CDV H和N基因序列分析结果为5个分离株之间H基因nt序列同源性均达到97.5%以上,HT-P（貉源,山东青岛）与THD1（貉源,山东潍坊）的aa同源性为100%,二者与其他分离株间aa序列同源性为87.9%～99.1%;与chn等疫苗株基因nt序列和推导aa序列同源性普遍较低,分别为90.5～91.8和89.%～91.8%。5个分离株之间N基因nt序列同源性均≥94.5%,HT-P与THD1同源性最高（99.8%）,分离株之间aa序列除HT-P、THD1与HD（貂源,山东青岛）同源性较高（99.0%以上）外,其他．分离株之间同源性低。与chn等疫苗株nt序列同源性较低（90．9～93．5％）。此外,HD和LN（貂源,辽宁大连）发病区域相距较远,但具有较高的同源性,但与HB（狐源,河北沦州）具有相对较低的nt同源性,提示野毒株在易感动物上可能存在种属差异。分离毒株与疫苗株之间H和N蛋白基因差异,可能与CD免疫失败有关。     

应用不同代次兔肾细胞培养风疹病毒松叶株的研究

目的为提高兔肾细胞产量用于增加风疹病毒生产。方法 SPF级家兔肾细胞经传代培养10代,对不同代次兔肾细胞进行遗传稳定性、外源因子及兔脑原虫检测后接种风疹病毒松叶株(Matsuba strain)的试验。结果兔肾细胞产量得到提高,由1对兔肾平均生产1瓶细胞增加为8瓶,细胞核型检查传至第10代的细胞染色体数目与初代细胞一致,细胞培养物均一性提高。第0～第3代细胞病毒培养物滴度间无显著性差异,χ2检验返回相关性的P值均大于0.95。结论第1～第3代细胞培养风疹病毒与第0代相比,可获得相同滴度的病毒培养物,p3代兔肾细胞应用于疫苗生产可显著提高细胞及病毒产量。     

感染CDV的犬病料N、H、F基因的克隆与序列分析

目的了解病料中犬瘟热病毒（CDV）的变异情况,为犬瘟热的预防与治疗提供理论依据。方法采用RT-PCR方法对犬病料中CDV的血凝素蛋白（H）、融合蛋白（F）和核衣壳蛋白（N）基因进行扩增,将扩增产物克隆到pGEM-T-easy载体中测序,并进行序列分析。结果测定一株CDV的H、F和N基因大小分别为1863 bp、1653 bp和2235 bp。同源性分析表明,未发现碱基的插入和缺失。该病毒的H、F和N基因分别与国内强毒株BJ080127株的H基因、GN株的F基因和HL株的N基因亲缘关系最近,氨基酸同源性分别为97.3%、97.7%和99.3%。与国外标准野毒株A75-17在核苷酸水平上同源性依次为94.4%、93.8%和97.2%,与疫苗株CDV3在核苷酸水平上同源性分别为88.5%、88.8%和93.9%。系统进化树表明该病毒与国内强毒株在同一谱系。糖基化分析显示,该病毒在F基因3～5位氨基酸处多出1个糖基化位点。结论本研究从犬病料中成功克隆了犬瘟热病毒血凝素蛋白、融合蛋白和核衣壳蛋白,在F基因中新增了一个糖基化位点,为犬瘟热的遗传变异和流行学研究提供了分子生物学依据。     

2003～2007年中国风疹病毒基因特征分析

本研究用Vero细胞或Vero/SLAM细胞从我国10个省(直辖市、自治区,下同)2003～2007年风疹暴发和散发病例的咽拭子标本中分离到57株风疹病毒,用RT-PCR方法扩增了57株风疹病毒E1基因1 107个核苷酸的片段,并对该PCR产物进行序列测定和分析.结果提示,在基于WHO基因定型靶序列739个核苷酸片段构建的基因亲缘关系树上,其中55株风疹病毒株属于1E基因型,相对于其他国家的1E基因型,形成一个独立分支;另外2株风疹病毒属于2B基因型.57株风疹病毒大部分核苷酸的突变为无义突变,氨基酸序列高度保守,除了2株风疹病毒在E1蛋白血凝抑制和中和位点区域第212位氨基酸由Thr变为Ser,其他病毒株均无重要抗原位点的改变;所有我国已分离到的1E基因型风疹病毒在E1蛋白第338位氨基酸共享突变位点(Leu338→Phe338),而其他基因型以及其他国家的1E基因型风疹病毒在该位点均未发生突变,提示该氨基酸(Phe338)可能是我国1E基因型风疹病毒所特有.2003～2007年在我国10个省均分离到1E基因型,而2B基因型只在2006年从四川省的越南输入病例中分离到,提示1E为绝对优势基因型,2B基因型为输入基因型.与1979～1984年和1999～2002年我国流行的风疹基因型不同,发生了基因型的更替,近年我国风疹的流行是由1E基因型为主的风疹野病毒的多个传播链引起.     

梅花鹿源BVDV基因E0克隆与序列分析

对梅花鹿源BVDV基因E0进行了克隆和序列分析。结果表明,梅花鹿源BVDV基因E0的大小为681bp,与报道9株BVDV（VEDEVAC、Bega、C24V、ILLC、NADL、OSLOSS、R1935、SD-1、Y546）和7株猪瘟病毒（ALD、Bres-cia、c、GPE、JL、LN9912、SM）及3株羊边界病毒（BD31、C413、BDVX818）相比,核苷酸序列的同源性依次为98.6%～84.8%、76.1%～74.7%、77.0%～76.7%。梅花鹿源BVDV为Ιb基因亚型。     

小鼠Lrh-1基因与排卵数间相关性分析

目的 探讨肝受体类似物-1( liver receptor homolog-1,Lrh-1;NR5A2)基因序列差异与小鼠排卵数性状间关系.方法 根据GenBank中NM_001159769序列设计了5对引物扩增Lrh-1基因CDS区,用单链构象多态性(Single-strand conformation polymorphism,SSCP)分析小鼠Lrh-1基因序列差异,分析Lrh-1基因与小鼠排卵数间关系.结果 ①在5对引物中只有引物P2和P5扩增产物存在多态性,引物P2扩增产物存在两种基因型AA和AB型,其中AB型发生(C674A)突变,这种突变导致编码的140位氨基酸由谷氨酰胺变为赖氨酸.②引物P5扩增产物存在三种多态类型SSCP-1、SSCP-2和SSCP-3,SSCP-1和SSCP-3型核酸序列比SSCP-2型少25个碱基,SSCP-3型除缺失区段外,其他区域碱基序列与SSCP-2型有5处碱基突变,而与SSCP-1型核酸序列有34处碱基差异,经BLAST分析,SSCP-2型与NM_001159769序列相似,SSCP-1型与NM_001159769序列相差较多,而与NG_012313.1序列相似,通过氨基酸序列比对分析,SSCP-3型1652处的A→G的突变导致氨基酸由丙氨酸变为苏氨酸,1678位G→C的突变使原密码子TAC(酪氨酸Y)变为TAG(终止子).③引物P2 AA型(27.27±8.52)与AB型小鼠的平均排卵数(25.92±11.73)间差异无显著性(P＞0.05);引物P5 SSCP-2型平均排卵数(35.00±14.58)显著高于SSCP-3型平均排卵数(19.50±7.94) (P ＜0.05),SSCP-1型(26.2±8.18)与SSCP-2型、SSCP-3型平均排卵数间差异无显著性(P＞0.05).结论 明确了Lrh-1基因序列差异与小鼠排卵数性状间关系,为深入研究Lrh-1基因对动物生殖调控机理提供依据.