巨型引物PCR法对抗CD3改型单链抗体

亲和力是影响改型单链抗体应用于临床的重要因素之一.利用巨型引物PCR定点诱变方法,设计并化学合成出两组含多个突变位点的简并引物,在第一轮PCR中使用简并引物分别扩增出含突变碱基的两条特异性的DNA片段,即巨型引物,将其经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后,作为3′和5′的两端引物应用于第二轮PCR反应中.通过改变标准PCR反应条件,调整引物与模板的浓度,扩增出特异性较强的目的DNA条带.PCR产物经回收后,进行DNA测序.测序结果表明利用该方法扩增得到特异的抗CD3改型单链抗体的突变体库.     

用一个简单快速的RT-PCR技术筛选白细胞介素-6作用相关基因

为了研究白细胞介素-6(IL-6)作用相关基因以及一些可能受IL-6调控的基因,利用一个简单快速的以PCR为基础的方案,检测了IL-6处理和未处理的Sko007细胞中基因表达的差异,克隆并鉴定了差异表达基因的cDNA片段.首先用6-mer寡核苷酸引物进行反转录从而最大限度地将mRNA编码区序列生成cDNA;然后用2或3个较长的随机引物进行PCR扩增,并以不同引物组合重复PCR增扩;扩增产物在2%琼脂糖凝胶上电泳分离,回收差异片段并直接用于克隆、测序及进一步分析.在此研究中,获得了3个表达序列标签(EST),其中一个为新的基因片段,反向RNA杂交有力证实了它们与IL-6作用的相关性.进一步的生物信息学分析表明,新基因片段STRF17在多种组织中表达.     

用PCR法快速半定量阴道分泌物中的乳酸杆菌

目的 通过对PCR引物、反应条件及样本处理条件的摸索,建立一种不经过分离培养和DNA提取纯化步骤,直接用乳酸杆菌特异性引物快速定性、半定量妇女阴道分泌物标本中乳酸杆菌的方法.方法 设计乳酸杆菌属特异性引物;对样本处理方法和PCR反应条件进行摸索;比较用PCR法定量阴道分泌物中乳酸杆菌的结果和稀释滴种法定量结果的相关性.结果 （1）用浓度为2%的Tritonx-100处理阴道标本后可在220 bp的位置得到最佳的特异性扩增区带;（2）将MgCl2在PCR反应体系中的终浓度调节至2.5 mmol/L时,可以产生最强的特异性反应扩增带;（3）用PCR法分析阴道分泌物所得菌数与培养所得菌数之间明显相关（P＜0.05）;用PCR法分析阴道分泌物所得灰度值与培养所得菌数之间明显相关（P＜0.05）.结论 将阴道分泌物标本经过简单的离心、洗涤处理后,直接应用PCR法,就可以快速地定性和半定量妇女阴道分泌物标本中的乳酸杆菌.     

DNA聚合酶与引物/模板的相互作用对PCR效率的影响

PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。传统的PCR引物设计软件基本上忽略了DNA聚合酶与引物/模板的亲和性对PCR效率的影响。为揭示DNA聚合酶与引物/模板的相互作用是否对PCR的效率有影响,通过构建Taq DNA 聚合酶与不同序列引物/模板DNA相互作用的三维结构模型,采用MM/GBSA方法计算复合物的结合自由能,以结合自由能为参数,为人血清白蛋白基因(Human Serum Albumin gene,HSA gene)和结核杆菌pyrF基因(Mycobacterium tuberculosis pyrF gene)设计了PCR引物。PCR实验结果表明,引物的PCR效率与结合自由能相关：引物与聚合酶的结合自由能越低,PCR实验的效率相对越高。这说明DNA聚合酶与引物/模板的相互作用对PCR效率有重要影响。因此,引物/模板DNA与聚合酶的结合自由能可以作为PCR引物设计的新参数。     

基于PCR的染色体步移中单引物扩增的克服与非特异引物的利用

基于PCR的染色体步移(PCR-Walking)方法已有许多种,包括反向PCR、连接介导的PCR、随机引物PCR等.在众多的方法中,经常存在由通用引物引起的单引物非特异扩增现象.本文综述了连接介导的PCR-Walking中单引物扩增的形成原理及克服方法.克服单引物扩增主要是使接头引物在DNA两端的接头上只有1个结合位点,从而避开单引物扩增.常用的方法有3′端加氨基修饰的不对称接头、泡泡状接头或Y字型接头及单寡核苷酸接头等方法.还介绍了2种利用通用引物非特异扩增克隆目的序列的方法:引物错配法及基于RAPD原理的单引物PCR法.     

一种简单快速克隆IL-6信号转导相关基因的方法

细胞因子作用于受体时的一个重要结果是诱导基因表达。为了克隆与IL-6诱导相关的基因,我们利用一个快速的改良DD-PCR方法,分离并检测了IL-6诱导和未诱导的U937细胞的差异表达基因。用三个完全变性的6—mer引物进行反转录,用2或3个较长的随机引物进行PCR扩增,扩增产物很在2%琼脂糖凝胶电泳上分离,之后回收差异片段并直接用于克隆和测序。在研究中,获得了7个不同的EST,序列分析表明其中2个EST可能是与细胞信号转导相关的新基因片段;反向Northern杂交证实它们是与IL-6作用相关的差异表达基因。     

PCR 芯片及其应用研究进展

PCR芯片实质上就是固定有与研究对象有关的许多已知基因的引物阵列并可用于PCR检测的固相载体,其制作时最关键的是目的基因的引物设计。与基于杂交的芯片技术不同,PCR芯片技术是一种高通量的,准确、灵敏的定量检测基因表达的技术,它将待测基因的引物固定于固相载体上,通过简单的、经过优化的定量PCR体系和荧光定量PCR仪,实现待检样品中已知基因的扩增,用于定量检测待检样品中已知基因的表达情况。PCR芯片由于其操作简单、结果准确、数据产出快而多等特点,已应用于疾病发病机制、药物作用机理和细菌分型等研究领域,并将在生命科学研究领域得到更为广泛的应用。     

松江湿地沉积物细菌T-RFLP分析中PCR体系的建立与优化

细菌是微生物的重要组成部分,其对保持湿地生态系统平衡起着重要作用,在沉积物细菌T-RFLP(terminal restriction fragment length polymorphism)分析中建立与优化PCR体系对进一步研究沉积物细菌群落组成具有重要意义。此次研究以松江湿地沉积物细菌基因组DNA为模板,采用正交和单因素试验对PCR体系中各因素(模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物、Taq酶)进行优化,系统分析各因素对PCR扩增结果的影响,建立最佳PCR反应体系。在20μL反应体系中,DNA模板30 ng、Mg2+2.0 mmol/L、dNTPs 0.2 mmol/L、引物0.2μmol/L、Taq酶0.5 U。该优化体系确保了沉积物细菌T-RFLP分析过程中PCR产物的质量与效果。     

油茶白绢病原菌齐整小核菌分子检测的研究

目的：设计特异性引物建立油茶白绢病齐整小核菌的快速分子检测体系。方法：扩增齐整小核菌核糖体DNA ITS区并测定其序列,比较该序列与GenBank中近似种的ITS序列差异,设计了特异性引物BF1和BR2。结果：该引物可以从齐整小核菌中扩增得到约540bp特异性条带,而扩增其它近似或相关菌株时没有相应的特异性条带。在25μL PCR反应体系中,引物BF1和BR2检测灵敏度为1pg浓度DNA。结论：利用设计的BF1和BR2特异性引物结合PCR方法可快速的扩增出齐整小核菌DNA,检测灵敏度为1pg.但在生产实践中诊断油茶白绢病发病前组织中的齐整小核菌还需要进一步研究。     

磁珠富集法分离小黄李基因组微卫星DNA片段

将微卫星探针5′端生物素化后与链亲和素磁珠特异结合,用磁珠和探针的结合物与两端连接已知序列人工接头的中国李品种小黄李(Prunus salicinacv.Xiaohuangli)基因组DNA酶切片段杂交,以此杂交片段为模板用人工接头序列为引物进行PCR扩增,根据PCR产物测序结果设计引物作为微卫星DNA的标记引物.结果在随机挑选的36个克隆进行菌落PCR检测时,从31个阳性克隆中挑选18个克隆进行测序后获得了12条特异序列,设计的8对SSR引物均在5个中国李受试品种上获得了预期的扩增产物,其中4对引物在受试品种上表现出多态性.     

寡核苷酸探针悬浮芯片在病原体检测中的应用

悬浮芯片与固体芯片、荧光定量PCR并列成为核酸序列鉴定中的重要的分子生物学工具,并在病原菌检测方面显示出不同的应用领域.悬浮芯片能同时检测多种病原菌,具有处理多样本能力、使用灵活、低成本等特点,适合对未知样本检测及环境监控.能够在生物安全、公共卫生、工农业生产中发挥重要作用;而固体芯片能耦联成千上百个探针,但由于在多样本处理、成本方面欠缺,因此适合于对重要的未知病原体的鉴定;荧光定量PCR具较好特异性、灵敏度,以及多样本处理能力,但在高通量方面欠缺.适合有目的地检测已知病原体.目前已建立三种基于悬浮芯片的检测方法:多重PCR扩增、通用引物扩增16S/23S rDNA、直接对实际样本杂交检测.多重PCR具较好特异性,但其多重能力还难以满足悬浮芯片的高通量的需要;通用引物具较好灵敏度及扩增多靶分子能力,但也存在交叉反应等缺陷.同时,采用PCR扩增方法,悬浮芯片检测的是PCR产物,不能客观反应实际样本中存在病原菌数量及是否具生命力.直接杂交环境样本尽管避免了PCR的缺陷,但在灵敏度方面非常欠缺.目前,在环境样本处理上,仍然缺乏有效的、高通量、自动化的方法,不能满足PCR与悬浮芯片多样本检测的需要.     

检测肠道细菌Feacalibacterium prausnitzii的三对PCR引物的特异性比较

【目的】比较3对基于16S rRNA基因、用于检测人肠道中重要细菌Feacalibacterium prausnitzii的引物(FPR-1/FPR-2、FPR-2F/Fprau645R和Fprau223F/Fprau420R)的特异性。【方法】用Clustal X比对每个引物与F.prausnitzii和其他细菌的16S rRNA基因的序列。在Ribosomal Database Project(RDP)数据库中使用Probe Match工具比较每个引物匹配的Faecalibacterium spp.序列数目。利用本课题组建立的中国人粪便菌群的16S rRNA基因全长文库的7255个克隆序列,用Simulated PCR(SPCR)预测每对引物检测到的F.prausnitzii和其他细菌的克隆数;用3对引物分别对代表克隆进行PCR扩增。用3对引物分别对14个健康人的粪便样品进行实时定量PCR。【结果】引物Fprau645R的3端最后一个碱基与非F.prausnitzii序列的错配度高于其它引物,它在RDP中匹配的Faecalibacterium spp.序列数占其匹配的细菌序列数的百分比(97.6%)显著高于其他引物。SPCR预测,3对引物检测到的F.prausnitzii克隆数均为1171左右;在检测到的非Faecalibacterium spp.克隆中,FPR-2F/Fprau645R主要是Subdoligranulum spp.,而FPR-1/FPR-2和Fprau223F/Fprau420R还有Oscillibacter spp.、Ruminococcus spp.和unclassified Ruminococcaceae等。真实PCR与SPCR的结果吻合。实时定量PCR中,FPR-1/FPR-2和Fprau223F/Fprau420R检测到的细菌数量高于FPR-2F/Fprau645R。【结论】3对引物能检测到F.prausnitzii和Subdoligranulum spp.,FPR-2F/Fprau645R的特异性优于FPR-1/FPR-2和Fprau223F/Fprau420R。     

大鼠及小鼠微卫星引物在社鼠中的跨种扩增

利用微卫星引物在同一属、科、目不同种之间具有通用性的特点,通过PCR扩增、聚丙烯凝胶电泳和银染技术对社鼠(Niviventer confucianus)近缘物种大鼠(Rattus norvegicus)、小鼠(Mus musculus)中已知的70个微卫星位点引物进行跨种扩增,筛选适合社鼠相关研究的多态微卫星引物.结果发现,40个位点引物出现扩增条带,21个位点引物能够稳定扩增,其中15个位点杂合,13个位点具有多态性;PCR扩增的Mg2+浓度主要集中在1.5及2.0 mmol/L,退火温度在50～60℃之间不等.虽然部分扩增产物有影子带的存在,但并不影响等位基因的判读.总体来看,利用大、小鼠的微卫星引物扩增社鼠的微卫星位点是可行的.     

聚合酶链反应检测宫颈癌中HPV16E6／E7相关序列

本文报告了采用聚合酶链反应(即PCR技术)检测人宫颈癌中人乳头瘤病毒16型(HPV16)的E_6/E_7相关序列。在正链引物(SP)和反链引物(ASP)的诱导下,以二步温控法聚合酶链反应对34例人宫颈癌组织DNA进行检测,发现宫颈癌中HPV16E_6/E_7相关序列存在的阳性率达67.6％(23/34)。本研究结果提示:HPV16可能在宫颈癌的发生发展过程中起重要作用,采用PCR技术选择性地检测HPV16的转化基因(E_6、E_7)对深入探讨宫颈癌发生的机理、早期发现宫颈癌患者等有重要意义。     

四引物扩增受阻突变体系PCR快速测定绵羊 BMPR-IB基因型方法的建立

四引物ARMS PCR是检测SNP有效、快速、简便的方法.绵羊BMPR-lB基因是控制Booroola绵羊多胎性状的主效基因,此研究目的在于建立一种对BMPR-IB基因四引物ARMS PCR检测方法.根据四引物ARMS PCR技术原理,在绵羊BMPR-IB基因突变位点(A746G)设计一对特异性引物,并在突变点两侧设计一对参照引物,用来扩增含有突变点的DNA片段,可在一步PCR反应中根据电泳图谱准确判断绵羊个体的BMPR-IB基因型,对比PCR-RFLP检测结果表明,所建立的方法简单,操作简便,大大提高了检测效率.     

TP-M13自动荧光检测法在高粱SSR基因型鉴定中的应用

研究利用TP-M13自动荧光检测法对48份高粱材料进行了简单序列重复(SSR)标记的基因型鉴定.在这个方法中,需要合成一个普适性的用荧光(如FAM)标记的M13引物,并把M13的正向引物和一个SSR反向引物相连(称为TP-M13引物),利用3条引物序列进行PCR扩增,其PCR产物在DNA测序仪(如ABI3700仪)上进行自动荧光检测.结果表明,这种方法和其他的传统方法相比,具有经济、灵敏、高效的优点.建议在利用数量很多的SSR标记对数量有限的基因组较小的材料进行基因型鉴定时,使用TP-M13自动荧光检测系统.     

甜瓜乙烯应答因子基因在果实发育成熟过程中的表达特性

根据已报道的甜瓜CMe-ERF1和CMe-ERF2基因cDNA序列设计合成特异性引物,应用RT-PCR技术从甜瓜品种‘河套蜜瓜’成熟果实中克隆得到CMe-ERF1和CMe-ERF2基因cDNA全长编码区序列,分别为498bp和822bp.序列比对分析表明,得到的cDNA序列与已报道的Andes甜瓜相应基因的cDNA序列完全一致.果实不同发育时期实时定量PCR检测结果表明,CMe-ERF1、CMe-ERF2基因表达与甜瓜果实成熟及乙烯生成量显著相关,表明该基因可能对果实成熟起重要作用.     

应用改进的通用荧光PCR引物进行多重STR分型

通过设计通用荧光PCR引物并结合DNA测序系统建立了小鼠的多重STR分型方案.实验针对小鼠基因组设计了两对不同的通用引物序列,标记了FAM荧光的通用序列和"加尾"的位点特异性引物共同用于小鼠的多重PCR的STR基因分型.本研究优化了通用引物和特异性引物间的比例,优化了多重STR-PCR的反应条件,并最终利用该技术方案实现了五重STR分型.实验验证了该方案在多重STR分型中的可行性.与传统的荧光检测PCR产物方案相比,应用通用方案完成多重PCR反应大大节省了实验时间与经费.     

MethyScan：一种甲基化特异性PCR引物设计及评估工具

DNA甲基化是重要的表观遗传现象,对基因表达发挥重要调控功能.大量研究表明,基因DNA甲基化是重要的临床诊断生物标志物.在临床上,实施快速、准确的DNA甲基化状态检测是诊断应用的前提和关键.甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,MSP)通过将两种引物与甲基化、非甲基化模板各自特异性结合和扩增,实现基因甲基化状态的区分,是切实可行、简单便捷的临床诊断实验技术.但是,不同于常规PCR,MSP主要存在如何强化引物-甲基化/非甲基化模板特异性结合、降低引物序列Tm值差异、去除假阳性扩增及提高敏感性等四大难点.尽管大多数MSP引物设计软件对上述难题都提出了各自解决办法,但在引物设计影响因素考虑、设计与评估并行处理及特异性扩增预测等方面仍然存在较大缺陷.为此,本研究通过对MethPrimer、MSPPrimer、MethBlast、BiSearch等现有MSP引物设计软件原理的深入探究,以及对Bowtie、SAMtools和BEDTools等工具的有效综合整合,基于图形库Matplotlib和第三方Python功能库BioPython与Primer3-py实现了具有系列优点的甲基化特异性PCR引物设计与评估可视化工具MethyScan.它具有引物设计、基因组索引、引物评估等三大完整功能模块,不仅可快速进行MSP引物设计,实现巢式(Nested)引物适配,还可基于4种基因组碱基转换模板分析引物结合信息,图形化展示非特异性扩增与目的片段差异,从而综合评估引物特异性-非特异性扩增.同时,对食管癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤中6个潜在生物标志物TFPI-2、NDRG4、CDKN2A、CD44、CASP8和SDHD的甲基化引物设计对比结果表明,MethyScan不仅可获得更多CpG位点的检测引物,而且所获得MSP引物位置与其他软件结果相同或相近,且引物间Tm值差值更小.总之,作为首个图形化展示特异性-非特异性扩增差异MSP引物设计工具,MethyScan可有效提高甲基化引物设计准确性,为临床DNA甲基化检测项目开展、检测试验实施及诊断试剂盒研发提供有力支撑.MethyScan工具下载地址:https://github.com/bioinfo-ibms-pumc/MethyScan.     

高梁与苏丹草EST—SSR标记的开发

从769条含SSR位点的高粱EST序列中设计了103对EST-SSR引物.用设计出的103对EST-SSR引物,对高粱品种TX623A和苏丹草品种S722进行了PCR扩增和多态性检测.结果表明:80对引物同时在两品种中扩出了条带,占引物总数的77.7%,20对引物在两品种中表现出多态性,占引物总数的19.4%,占能在两品种中扩出带引物的25.0%.研究结果表明根据高粱EST建立高粱与苏丹草EST-SSR标记是有效、可行的.