在大肠杆菌中分别表达汉滩病毒素膜糖蛋白G1和G2

利用PCR方法扩增了汉滩病毒76－118株囊膜糖蛋白G1和G2的编码区基因,并将PCR产物克隆到T-载体中,用限制性内切酶将G1和G2的编码区基因切下,并克隆到表达载体pBV220中构建G1和G2的表达质粒。诱导表达后在SDS－PAGE凝胶中未见表达产物带,表达的G1和G2能与部分抗G1和G2的单克隆抗体发生反应,但用Western－blot方法不能检测到表达产物。用表达的G1和G2免疫小白鼠能刺激小白鼠产生特异性抗汉摊病毒的抗体,间接免疫荧光抗体的滴度可分别达到1:160和1：320。     

用不同载体在大肠杆菌中表达汉滩病毒囊膜糖蛋白G1和G2

为提高汉瘫病毒囊膜糖蛋白G1和G2的表达水平,利用两种不同的表达载体pKK223－3和pGEX－4T－1构建G1和G2的表达质粒,其中PGEX－4T－1为融合蛋白表达载体。诱导所构建的G1和G2表达质粒表达G1和G2,用表达的G1和G2免疫小白鼠诱导产生的抗汉瘫病毒特异性的间接免疫荧光抗体摘度无明显差别,从而说明表达载体对汉瘫病毒G1和G2在大肠杆菌中的表达水平影响不大,表达水平都较低。同时,利用PGEX－4T－1构建G1和G2的部分多肽的表达质粒,但表达水平较完整的G1和G2无明显提高。     

汉滩病毒囊膜糖蛋白G1、G2腺病毒载体的表达及免疫分析

为了研究利用腺病毒载体表达汉滩病毒囊膜糖蛋白G1、G2的可行性及免疫原性。通过克隆76-118株G1、G2基因至腺病毒表达载体pAdTrackCMV,得到阳性克隆padTrackCMV-G1、G2。PmeI线性化的阳性克隆与腺病毒骨架载体pAdeasy-1共转化BJ5183宿主菌,经同源重组后得到重组病毒rAdeasy-G1、rAdeasy-G2。重组病毒经PacI线性化后,脂质体介导转染293细胞,使重组病毒得到扩增。将重组病毒免疫Balb／c小鼠,并通过ELISA和间接免疫荧光对免疫小鼠血清进行了分析。结果表明,rAdeasy—G1组六只免疫小鼠、rAdeasy—G2组4只免疫小鼠均产生了能与汉滩病毒抗原发生反应的特异抗体。该研究为进一步研制以腺病毒为活载体的汉坦病毒工程疫苗奠定了基础。     

汉滩病毒囊膜糖蛋白G1、G2腺病毒载体的表达及免疫分析

为了研究利用腺病毒载体表达汉滩病毒囊膜糖蛋白G1、G2的可行性及免疫原性.通过克隆76-118株G1、G2基因至腺病毒表达载体pAdTrackCMV,得到阳性克隆pAdTrackCMV-G1、G2.PmeI线性化的阳性克隆与腺病毒骨架载体pAdeasy-1共转化BJ5183宿主菌,经同源重组后得到重组病毒rAdeasy-G1、rAdeasy-G2.重组病毒经PacI线性化后,脂质体介导转染293细胞,使重组病毒得到扩增.将重组病毒免疫Balb/c小鼠,并通过ELISA和间接免疫荧光对免疫小鼠血清进行了分析.结果表明,rAdeasy-G1组六只免疫小鼠、rAdeasy-G2组4只免疫小鼠均产生了能与汉滩病毒抗原发生反应的特异抗体.该研究为进一步研制以腺病毒为活载体的汉坦病毒工程疫苗奠定了基础.     

庚型肝炎病毒包膜糖蛋白E2基因在昆虫细胞中的表达

用ＰＣＲ扩增出ＨＧＶＥ２全基因,克隆进杆状病毒表达载体ｐＦＡＳＴＢＡＣＨＴａ中,构建成重组转座载体ｐＦＡＳＴＢＡＣＥ２,转化ＤＨ１０ＢＡＣ大肠杆菌感受态细胞,筛选阳性菌落,抽提大分子质粒ＤＮＡ,获得含ＨＧＶＥ２基因的重组杆状病毒穿梭载体,转染昆虫草地夜蛾Ｓｆ９细胞,出现细胞病变后,收集含有重组病毒颗粒的培养上清,重新感染草地夜蛾Ｓｆ９单层细胞及甜菜夜蛾幼虫,分别收集Ｓｆ９细胞和甜菜夜蛾幼虫体内的血淋巴细胞,进行１２％ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳,可见表达的融合蛋白带,经亲和层析进行蛋白纯化,用ＥＬＩＳＡ方法检测各类血清标本,初步研究ＨＧＶＥ２糖蛋白的抗原性     

汉坦病毒包膜糖蛋白G2重组腺病毒的构建及其在Hela细胞中的表达

本研究旨在构建可表达汉坦病毒(HTNV)糖蛋白G2的重组腺病毒。应用PCR方法扩增G2编码基因,经T/A克隆、测序鉴定后再亚克隆到腺病毒shuttle载体pAd5-CMV中并用磷酸钙沉淀法分别将携带G2编码基因的重组腺病毒shuttle载体与携带报告基因eGFP的腺病毒骨架质粒共转染HEK293细胞,包装、扩增、纯化后得到携带HTNV糖蛋白G2编码基因的重组腺病毒;用重组腺病毒感染Hela细胞并收获蛋白,间接免疫荧光、Western blotting检测蛋白表达。经酶切鉴定表明已成功构建了携带G2基因的重组腺病毒载体;RT-PCR鉴定表明目的基因能够在感染重组腺病毒的Hela细胞中转录;荧光显微镜观察重组腺病毒感染的Hela细胞,可见报告基因eGFP的表达;间接免疫荧光法和Western blotting均证实表达产物可被抗G2单克隆抗体所识别,表明糖蛋白G2在感染细胞中得到了表达。本研究成功构建了可表达HTNV包膜糖蛋白G2的重组腺病毒,转染宿主细胞可稳定表达目的蛋白,为HTNV糖蛋白G2的结晶、结构解析研究以及新型汉坦病毒疫苗的研制奠定了基础。     

引入CpG基序的汉滩病毒G2糖蛋白基因的克隆及表达

构建汉滩病毒G2糖蛋白的真核表达载体,并加入可增强小鼠免疫刺激作用的CpG基序,检测其可否在真核细胞中表达。参照Genebank中汉滩病毒M的全基因序列设计引物,引物两端引入可增强小鼠免疫刺激作用的CpG基序及双酶切位点,通过聚合酶链反应(PCR)获得含CpG基序的G2片段,并将其与T载体pMD18-T相连,测序后克隆至真核表达载体pcDNA3.1 上,将此真核表达载体以脂质体法转染至真核细胞Vero-E6中,利用间接免疫荧光法(IFA)检测发现转染后的Vero-E6中出现特异性的绿色荧光。结果表明本实验成功构建了汉滩病毒包膜糖蛋白G2的重组体。     

汉坦病毒陈株S基因编码区的克隆,序列分析及表达

从汉坦病毒陈株感染的ＶｅｒｏＥ６细胞裂解液中提取病毒ＲＮＡ,经逆转录ＰＣＲ获得病毒Ｓ基因编码区约１．３ｋｂｃＤＮＡ片段,克隆该片段后进行核苷酸序列测定,并与汉坦病毒７６１１８株进行同源性比较,结果二者核苷酸序列同源性为８６％,推导的氨基酸序列同源性为９７％。将该基因片段插入原核表达载体ｐＧＥＸ４Ｔ１,在大肠杆菌中获得高效表达。表达产物为ＧＳＴＮＰ融合蛋白。ＳＤＳＰＡＧＥ检测表达蛋白分子约７２ｋＤ左右。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ和ＥＬＩＳＡ试验结果表明,表达产物可与多株抗汉坦病毒核蛋白的ＭｃＡｂ发生反应,其抗原表位及ＭｃＡｂ反应谱与７６１１８株相比存在某些差异。     

汉坦病毒囊膜糖蛋白G1基因重组腺病毒载体的构建及其在Vero E6细胞中的表达

拟构建汉坦病毒Gl基因重组腺病毒载体并在VeroE6细胞中表达,为汉坦病毒基因疫苗的研究提供实验基础。PCR法从含汉坦病毒-76118株M基因的M56质粒扩增糖蛋白G1基因片段,利用穿梭质粒pShuttle,将其克隆入Adeno—X病毒DNA,获得重组腺病毒DNA,转染HEK293细胞,包装、扩增后得到汉坦病毒Gl基因重组腺病毒原种,感染VetoE6细胞,用IFA法和ELISA法检测表达产物。得到了含汉坦病毒G1基因的重组腺病毒,其滴度约为10^11pfu／ml,感染VeroE6细胞后检测到汉坦病毒糖蛋白G1的表达。     

A亚群禽白血病病毒囊膜基因gp85片段在大肠杆菌中的表达

将RAV－1囊膜基因gp85片段来克隆到表达质粒pET-21d( )中得到重组表达质粒pET-21d-RAV-1env(BelⅡ/SalⅠ）序列分析表明该插入片段的核苷酸序列和阅读框都与RAV－1囊膜基因相应序列相同。用其转化大肠杆菌BL21（DE）3并经IPTG诱导,SDS－PAGE分析表明RAV－1囊膜基因融合蛋白表达产物约20kD,与理论值相符;IPTG诱导起始时间比诱持续时间对表达量的影响更大。     

丙型肝炎病毒包膜蛋白E2可溶性单链可变区抗体在大肠杆菌中的表达

利用分子生物学技术,构建表达丙型肝炎病毒（HCV）包膜蛋白E2的人源单链可变区抗体（ScFv)的原核表达载体,并在大肠杆菌JM109中表达可溶性的HCV－E2－ScFv。以重组的HCV E2蛋白为包被抗原,利用噬菌体抗体库的表面展示技术,筛选含有HCV－E2－ScFv基因的噬菌体克隆,从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒,经Ncol/NotⅠ酶切鉴定后,该ScFv基因由750bp组成,将菜亚克隆到pCANTAB5E载体中,转化大肠杆菌JM109,在其培养上清中获得了可溶性HCV E2单链可变区抗体的表达。酶联免疫吸附法（ELISA）证实表达的HCV－E2－ScFv进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）,证实表达的HCV－E2－ScFv的分子量为28KD,为应用HCV－E2－ScFv进行肝组织免疫组织化学和细胞内免疫基因治疗研究奠定了基础。     

汉滩病毒S片段基因编码区在Vero—E6细胞中的表达

汉滩病毒属于布尼亚病毒科汉坦病毒属,主要引起人类肾综合征出血热［１］。我国是肾综合征出血热发生和流行的主要疫区,该病起病急、病死率高,流行范围广,因此寻找安全有效、低廉的疫苗是控制本病流行和发生的关键。基因免疫是近年来微生物学和免疫学研究的新热点［２...     

汉滩病毒感染诱导热休克蛋白70表达

为了解汉滩病毒感染后细胞的应激反应及ＨＳＰ７０的表达与病毒复制的关系,在汉滩病毒Ａ９株感染Ｖｅｒｏ－Ｅ６细胞后,用免疫组织化学及核酸分子原位杂交法,对细胞ＨＳＰ７０基因的表达进行了检测。结果表明,汉滩病毒感染细胞４ｈｙ后即可诱导Ｖｅｒｐ－Ｅ６细胞表达ＨＳＰ７０,表达可持续至感染后５ｄ且ＨＳＰ７０在细胞内的分布也有改变。提示汉滩病毒可直接诱导ＨＳＰ７０的高表达。     

我国猪瘟病毒兔化弱毒株囊膜糖蛋白E0基因的克隆及序列测定

采用异硫氰酸胍一步法从４８０代猪瘟病毒兔化弱毒株（ＨＣＬＶ）脾毒中提取总ＲＮＡ,以该ＲＮＡ为模板,进行反转录,然后采用套式ＰＣＲ扩增出ＨＣＬＶ的囊膜糖蛋白Ｅ０基因,琼脂糖凝胶电泳表明其大小与预计相符。将扩增出的Ｅ０基因克隆到ｐＧＥＭＴ载体中,用自动序列分析仪对其进行序列测定。将测得的序列及推导的氨基酸序列与国外测得的Ｃ株相应序列进行比较,结果发现,它们之间核苷酸序列同源性为９９．０８％,氨基酸序列同源性为９８．４２％。     

猪瘟兔化弱毒株E2基因的原核表达及间接ELISA的初步建立

猪瘟病毒E2蛋白C端含有一段30多个疏水性氨基酸组成的跨膜区域(Transmembraneregion,TMR),用RTPCR和巢式PCR分别扩增了含不同长度TMR的猪瘟兔化弱毒E2基因,并克隆入pGEX4T1的MCS中,构建了原核表达载体pGEXTE2339(无TMR)、pGEXTE2355(1TMR)、pGEXTE2375(3TMR)。因E2基因含有大量大肠杆菌稀有密码子,选择了BL21CodonPlus(DE3)RP作为表达受体菌,结果表明pGEXTE2339、pGEXTE2355以包涵体的形式正确表达了目的蛋白,而pGEXTE2375没有明显表达。并利用pGEXTE2339、pGEXTE2355表达的融合蛋白初步建立了间接ELISA方法。     

插入CpG序列的汉坦病毒S基因真核表达载体的构建及表达

To improve the effect of the gene immunization against Hantaan virus, we constructed the eukaryotic expression vector pTARGET-hans(ISS) containing Hantaan Virus S gene coding region and CpG motif by cloning S gene segment with CpG motif into eukaryotic expression vector pTARGET^TM.After conformed by enzyme analysis, the recombinant expression vector pTARGET-hans(ISS) was transferred into Vero-E6 cells by electroporation and the transient expression of Hantaan virus nucleocapsid protein was detected by indirect immunofluorescence assay(IFA). In some transferred Vero-E6, the green fluorescence was showed, thus we can conclude that the eukaryotic expression vector pTARGET-hans(ISS) was successfully constructed and expressed in vitro,which will lay a foundation for further animal vaccination.     

猪瘟兔化弱毒株E2基因的原核表达及间接ELISA的初步建立

猪瘟病毒E2蛋白C端含有一段30多个疏水性氨基酸组成的跨膜区域(Transmembrane region,TMR),用RT-PCR和巢式PCR分别扩增了含不同长度TMR的猪瘟兔化弱毒E2基因,并克隆入pGEX-4T-1的MCS中,构建了原核表达载体pGEXTE2-339(无TMR)、pGEXTE2-355(1TMR)、pGEXTE2-375(3TMR).因E2基因含有大量大肠杆菌稀有密码子,选择了BL21-CodonPlus(DE3)-RP作为表达受体菌,结果表明pGEXTE2-339、pGEXTE2-355以包涵体的形式正确表达了目的蛋白,而pGEXTE2-375没有明显表达.并利用pGEXTE2-339、pGEXTE2-355表达的融合蛋白初步建立了间接ELISA方法.     

插入CpG序列的汉坦病毒S基因真核表达载体的构建及表达

肾综合征出血热(HFRS)是一类由汉坦病毒引起的以发热、出血和急性肾功能损伤为特征的急性病毒性传染病.     

禽流感病毒H7N2血凝素HA1基因在大肠杆菌中的表达

目的　表达H7N2亚型禽流感病毒 (AIV)HA1基因 ,用于感染H7亚型禽流感病毒抗体的检测和HA1蛋白功能研究。方法　采用RT PCR方法对H7N2亚型AIVHA1基因进行扩增 ,将PCR产物克隆于pGEM T Easy载体 ,将该基因插入pGEX 4T 2中构建HA1基因原核表达载体 ,转化BL2 1大肠杆菌后 ,在IPTG诱导下表达HA1蛋白 ,Westernblot鉴定表达HA1蛋白。电洗脱方法纯化表达HA1蛋白 ,建立间接ELISA方法 ,对感染AIVH7、H9、H5亚型AIV阳性血清进行检测。结果　成功克隆H7N2亚型AIV的HA1基因 ,其核苷酸序列长度 96 6bp ,编码 32 2个氨基酸残基。构建HA1基因原核表达载体在大肠杆菌内表达出约 6 1× 10 3的HA1融合蛋白。Westernblot和ELISA方法鉴定表明 :表达HA1蛋白与感染H7亚型AIV鸡血清有反应 ,与H5、H9亚型AIV阳性血清没有反应。结论　本研究在大肠杆菌中成功表达了H7N2亚型AIVHA1基因蛋白 ,具有与感染H7亚型AIV阳性血清反应原性 ,不与H5和H9亚型AIV感染阳性血清发生反应。     

马动脉炎病毒核蛋白基因的克隆与表达

马病毒性动脉炎是危害世界养马业的重要传染病之一,是由动脉炎病毒科动脉炎病毒属的马动脉炎病毒(Equinearteritisvirus,EAV)引起的一种以病马发热,步态僵直,躯干及眼周围水肿,并出现粘液脓性鼻炎、结膜炎,外生殖道水肿为特征的传染病,对妊马能引起流产,使易感怀孕母马的流产率