Cell Growth and Flavonoids Production in Suspension Culture of Saussurea medusa

Cell suspension cultures were established from Saussurea medusa Maxim. callus cultures. The effects of different rotation speeds of the gyratory shaker, different inoeulum sizes and different pH values of the medium on cell growth and flavonoid formation were studied. The result showed that the optimum rotation speed, inoeulum size and initial pH value of the medium were 90–120 r/min,50– 80 g FW/L and 5.5–6.0 respectively for cell growth and flavonoids formation in the suspension cultures. Sucrose was better than glucose and fructose for the suspension cultures. The optimum concentration of sucrose for cell growth and flavonoid production was 40 g/L, and the concentration of flavonoids could be as high as 1 423.25 mg/L. High performance liquid chromatographic analysis of cell suspension culture extracts showed that the concentrations of jaceosidin and hispidulin in the flavonoids were 22.11% and 0. 15% respectively.     

水母雪莲细胞生物反应器悬浮培养

Cell suspension culture of Saussurea medusa Maxim. was established in a 2 L stirred bioreactor for flavonoids production. After 12 days of culture, the biomass was 10.35 g DW·L-1, containing 428.6 mg/L flavonoids, which was 4.14% of the biomass (dry weight) under the condition of 25 ℃ and light intensity lower than 5 μmol·m-2·s-1. The utility pattern of sugar, change of dissolved oxygen and oxygen uptake rate were also studied.     

水母雪莲愈伤组织培养和黄酮类化合物的形成

８种基本培养基对水母雪莲（Ｓａｕｓｓｕｒｅａ ｍｅｄｕｓａ Ｍａｘｉｍ）愈伤组织生长和黄酮类形成影响不同,ＭＳ培养基较有利于愈伤组织生长和黄酮类形成。碳源、氮源、植物激素对愈伤组织生长和黄酮类形成影响较为显著。从ＭＳ培养基修饰得到的Ｍ－１３培养基培养的愈伤组织生长量和黄酮类产量比原培养基分别提高３３％和８２％,达到２１．００ｇＤＷ／Ｌ和１．８９ｇ／Ｌ。通过ＴＬＣ和ＨＰＬＣ初步分析和鉴定,证明Ｍ－１     

水母雪莲细胞培养物调血脂作用的初步研究

为研究水母雪莲细胞培养物对高脂大鼠的调血脂作用,将雄性SD大鼠分为4组：正常对照组(A组)、高脂模型组(B组)、高剂量组(C组)和低剂量组(D组)。A组喂基础饲料,B组喂高脂饲料,C组喂高脂饲料的同时饲以大剂量水母雪莲细胞培养物,D组喂高脂饲料的同时饲以小剂量水母雪莲细胞培养物。给药1/d,3周后采血,测定血脂水平及肝肾功能。C组较B组各项血脂指标均有改善,各组间肝肾功能未见显性差异。初步研究表明,水母雪莲细胞培养物对高脂大鼠具有调血脂的作用。本实验用药剂量安全。     

分光光度法测定水母雪莲细胞培养物中的总黄酮

建立了测定水母雪莲细胞培养物中的总黄酮含量的分光光度法,该法操作简便,结果准确可靠。     

水母雪莲细胞悬浮培养合成黄酮及抗氧化活性

对水母雪莲细胞悬浮培养过程中细胞生长、黄酮积累和底物消耗的动力学过程进行了研究.经15 d液体培养可获得最大生物量干重和黄酮产量分别为17.2 g·L-1和607.8 mg·L-1,通过调控基本培养基种类和有机添加物可提高雪莲细胞的生长和黄酮积累.获得的水母雪莲细胞培养物具有明显的抗氧化活性,其抗氧化活性与雪莲细胞中的黄酮含量相关.     

钙、磷、镁和钾对雪莲细胞悬浮培养的影响

考察了钙、磷、镁和钾等大量营养元素对雪莲细胞TUIP-8悬浮培养的影响,确定了培养雪莲细胞的钙、磷、镁、钾的最佳浓度范围。低于以上4种大量营养元素的最适浓度范围,TUIP-8细胞的生长和黄酮合成都将明显受到抑制。该细胞对Ca^2 和Mg^2 具有较好的浓度耐受性,而对PO4^3-和K^ 的耐受性较差。     

培养基及其组成对水母雪莲悬浮培养细胞生长及黄酮形成的影响

8种不同的基本培养基对水母雪莲(Saussurea medusa)细胞生长和黄酮形成的影响不同。实验结果表明,MS培养基较有利于细胞生长和黄酮形成。从MS培养基修饰得到的MG和MP培养基比前者细胞生长量与黄酮产量分别提高32%和70%。碳源、氮源、植物激素对细胞生长及黄酮形成的影响较为明显。用HPLC对细胞培养物中两种有效黄酮(Jaceosidin和Hispidulin)作了定性定量分析。     

水母雪莲体细胞胚胎发生及其植株再生

水母雪莲（Saussurea medusa Maxim.)茎和叶片的切段接种于MS＋2mg/L NAA 0.5mmg/L 6-BA的培养基上,20d后产生黄褐色的愈伤组织,经过几个月的继代培养,愈伤组织仍保持旺盛的增殖能力,但部分由黄褐色逐渐变为红色,将红色愈伤组织转到MS＋0．1mg/L NAA＋0．2mg/L 6-BA 5mg/L GA3的培养基上,30d后可分化出大量的体细胞胚,体细胞胚成熟后转到1／2MS＋0．2mg/L IAA 0.5%活性炭的培养基上,30d后可长出2－4cm的根,带根的小苗经锻炼后移栽到土壤中,成活率达76％,细胞组织学观察表明,发育成熟的体细胞胚具有胚根,胚轴和胚芽的完整结构,具有独立的维管系统。     

前体对水母雪莲悬浮培养细胞黄酮合成的影响

在水母雪莲（Saussurea medusa Maxim)细胞悬浮体系中加入苯丙氨酸、肉桂酸和乙酸钠3种前体。结果显示,3种前体均能促进细胞内黄酮的生物合成,但它们对细胞的生长也有一定的抑制作用。实验表明,3种前体的添加时间均以第6天为宜。苯丙氨酸的最佳添加浓度为0.05mmol/L,肉桂酸、乙酸钠的最佳添加浓度都是0.1mmol/L。3种前体中,难溶于水的肉桂酸对黄酮合成的促进作用最强,它可使培养物的黄酮产量高达1801mg/L,是对照1．98倍。苯丙氨酸、乙酸钠两种前体协同添加,比它们单独加入更能促进细胞的黄酮合成。     

光质、光强和光期对水母雪莲愈伤组织生长和黄酮生物合成的影响

白光、蓝光、红光和远红光等不同光质照射及不同的白光强度对水母雪莲愈伤组织生长、苯丙氨酸氨基裂解酶（ＰＡＬ） 活性及黄酮合成有不同的影响。红光明显促进愈伤组织的生长,但强烈抑制ＰＡＬ活性和黄酮的合成。蓝光对愈伤组织生长无明显影响,但显著提高ＰＡＬ 活性和黄酮的合成。白光的作用介于红光和蓝光之间。远红光的作用与蓝光相似,但作用比较弱。每天１６ ｈ 蓝光加８ ｈ 白光和８ ｈ 蓝光加１６ ｈ 白光的组合产生最高的黄酮含量和黄酮生产率。     

水母雪莲两种再生系统的建立

Two kinds of regeneration system on Saussurea medusa Maxim. have been established. The shoots can be induced from cotyledons, leaf segments and somatic embryos at 25℃. The regeneration system by organic have advantages such as shorter period, higher efficiency, better synchronism and bigger average number of shoot than the others.The content of total flavonoids in shoots is 4%, which is 3-4 times of it in wild type.     

光照对水母雪莲愈伤组织合成生物碱的影响

以水母雪莲（Saussurea medusa Maxin.)无菌幼苗的根作外植体,诱导获得的愈伤组织为材料,研究光照对生物碱合成的影响。结果表明：尽管在水母雪莲的愈伤组织培养物中,总生物碱的含量比原植株中的含量低,但其组成成分比原植物丰富。并且秋水仙碱的含量也比原植物高,尤其是在光照培养的愈伤组织中秋水仙碱大大增加。     

水母雪莲查尔酮合酶基因的克隆、表达及酶活分析

从水母雪莲Saussurea medusa Maxim. cDNA文库中得到一段查尔酮合酶基因 (SmCHS) 片段,然后通过RT-PCR得到完整的查尔酮合酶基因cDNA。序列分析表明SmCHS全长1 313 bp,其开放阅读框为1 170 bp,编码389个氨基酸,预测表达蛋白的分子量为43 kDa。构建原核表达质粒pET28a(+)-SmCHS,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),获得表达菌株。经IPTG诱导表达后,对表达产物进行SDS-PAGE分析,结果显示,表达的融合蛋白以部分可溶的形式存在。用Ni-NTA预装柱对融合蛋白进行亲和纯化,对纯化蛋白进行酶活检测,结果表明融合蛋白具有查尔酮合酶活性,可催化底物4-香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A缩合生成产物柚皮素查尔酮。     

不同理化因子对雪莲培养细胞中黄酮类形成的影响

研究了不同理化因子对水母雪莲(Saussurea medusa Maxim)愈伤组织生长及黄酮类化合物生物合成的影响。结果表明,有利于细胞生长及黄酮形成的合适温度为25℃。白光对愈伤组织生长无促进作用,但有利于黄酮的形成。培养基中添加1mg／L NAA和O．2mg／L的KT组合对细胞的生长较有促进作用。5％蔗糖和1％葡萄糖的组合有利于细胞的生长和黄酮的形成。用⁶⁰C0-γ射线辐照愈伤组织,在剂量为4000Gy的条件下,获得一个合成黄酮能力高于原愈伤组织70％的细胞系。用高效液相和紫外分光光度法,测定离体培养光照条件下干细胞总黄酮的含量为3．2％,是暗培养的4．4倍。培养温度25℃时干细胞黄酮的含量为2．02％,分别为20℃,35℃时的5倍和3．2倍。     

水母雪莲红色细胞系类黄酮含量和相关基因表达

水母雪莲为中国传统名贵中药,具有散寒除湿、活血通经、抗炎、镇痛等功效,其主要药用成分为类黄酮化合物。以水母雪莲白色系愈伤组织和经低温、高糖、强光诱导得到的红色系为材料,比较不同细胞系中类黄酮活性成分、结构基因和转录因子表达的差异。结果表明,红色系中总黄酮含量为白色系的3.60倍;重要的药用成分为芦丁,其含量达到干重的0.25%,是白色系的2.40倍;红色系中花青苷含量极高,矢车菊素3-O-己糖苷和矢车菊素3-O-琥珀酰己糖苷的含量分别达到干重的0.12%和0.19%;红色系中CHS、F3'H、FNS、FLS、DFR和ANS基因的表达均明显高于白色系;红色系中转录因子MYB、bHLH和WD40的表达也均明显高于白色系,其中MYB的表达量为白色系的19.70倍,说明红色系中转录因子的高水平表达增强了结构基因的表达,进而提高了类黄酮的合成。红色系中bHLH和WD40表达水平相似,而与MYB的表达水平相差很大,推测可能在水母雪莲中bHLH和WD40两种转录因子形成二元复合体后,和MYB共同调控类黄酮合成途径中结构基因的表达。     

水母雪莲黄酮合成酶FNSII基因克隆及其在3种细胞系中的表达

水母雪莲是中国传统珍稀药材,其主要活性成分之一木犀草素具有预防和治疗癌症的功效。以水母雪莲绿色细胞系为试材,采用RT-PCR和RACE-PCR方法获得1个水母雪莲FNSII基因cDNA全长,命名为SmFNSII(GenBank登录号为KF170286)。序列分析结果表明:SmFNSII全长1 710 bp,包含34 bp的5?非编码区、125 bp的3?非编码区和1个长度为1 551 bp编码516个氨基酸的开放阅读框。氨基酸序列分析表明SmFNSII属于细胞色素P450 CYP93B亚家族单氧化酶。序列比对和系统进化分析表明,SmFNSII氨基酸序列与同科植物毛山柳菊的亲缘关系最近,相似性达87%以上。实时荧光定量PCR分析表明,SmFNSII在白色、绿色和红色细胞系均有表达,红色系中的表达量最高,白色系中表达量最低,此结果与高效液相色谱分析3种颜色细胞系中木犀草素含量结果一致。构建pET-SmFNSII原核表达重组质粒,并在大肠杆菌中诱导表达,诱导蛋白大小与预期一致。通过筛选FNSII基因表达水平高、高产木犀草素的水母雪莲细胞系和植株,可培育抗炎抗癌活性较高、具有高保健功能的雪莲生药新品种。     

搅拌式生物反应器悬浮培养水母雪莲细胞的研究

应用 2L通气搅拌式生物反应器一步批式培养水母雪莲细胞。采用倾斜式搅拌桨代替透平桨 ,研究了搅拌转速、通气量和接种量对细胞生长和黄酮合成的影响 ,发现在 75r min、70 0～1000L min和 4.0～ 5.0gDCW L接种量下细胞生长和黄酮合成比较好。经过 12d培养细胞干重达 13.8gDCW L ,黄酮产量 416mg L ,黄酮含量占细胞干重的 30%。水母雪莲细胞生长及黄酮合成的进程表明 ,黄酮积累与细胞生长呈正相关。对细胞聚集体分布的研究发现 ,流变压力使细胞聚集体分裂 ,使反应器中细胞生长受到影响 ,黄酮产量较摇瓶中降低     

不同理化因子对雪莲毛状根生长和总黄酮生物合成的影响

在 1 2MS液体培养基上研究了不同理化因子对水母雪莲毛状根生长和总黄酮生物合成的影响。实验结果表明 :氮源总浓度 (包括NH+4和NO-3)为 30mmol L ;NH⁺₄ NO^-₃比例为 5∶2 5 ;2 %蔗糖和 3%葡萄糖组合 ;0.5mg LGA₃和 0.5mg LIBA ;pH5.8;18h d的光照 (光强为 35.0.0lx) ;2.4℃ ;摇床转速为 100rmin有利于毛状根生长及总黄酮的生物合成。在此培养条件下 ,经过21d的培养毛状根生长量达到 12.8g L(DW) ,总黄酮合成量为 192.2mg L ,即总黄酮含量占毛状根干重的 15 % ,约为干重野生水母雪莲植株总黄酮含量的 2.5倍。