人白细胞介素—18基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

利用反转录ＰＣＲ（ＲＴＰＣＲ）法从人肝组织中分离人白介素１８（ｈＩＬ１８）基因。克隆到Ｔｖｅｃｔｏｒｅａｓｙ载体中,经酶切初步鉴定后进行ＤＮＡ序列分析,结果表明与文献报道完全一致。以ｐＢＶ２２０为表达载体,在大肠杆菌中高效表达了ｈＩＬ１８基因,重组蛋白占菌体总蛋白的２７．２％。为进一步研究其生物活性奠定了重要基础。     

人源CPP32基因的表达及其对大肠杆菌生长抑制作用的研究

将人源ＣＰＰ３２基因分别克隆到载体ｐＢＶ３２１和ｐＥＸ３１Ｂ中,得到ｐＢＶ３２１／ＣＰＰ和ｐＥＸ３１Ｂ／ＣＰＰ两种重组质粒。将它们分别转化到大肠杆菌中的结果显示,诱导真核细胞程序性死亡的ＣＰＰ３２基因对大肠杆菌的生长也有明显的抑制作用。ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ显示ＣＰＰ３２基因在转录水平上得到了表达。这表明人源ＣＰＰ３２功能上的保守性     

3α-羟类固醇脱氢酶基因的质粒载体构建和表达

目的 实现3α-羟类固醇脱氢酶基因在大肠埃希菌中的高可溶性表达.方法 从土壤中分离睾丸酮丛毛单胞菌,提取其基因组DNA,PCR扩增3α-羟类固醇脱氢酶(3α-HSD)基因,将它克隆到原核表达载体上进行诱导表达.提取细菌总蛋白进行SDS-PAGE分析并测定酶活性.结果 经核苷酸序列测定和酶切鉴定结果表明,成功地构建了重组质粒,IPTG诱导表达后,获得融合蛋白,SDS-PAGE初步测定目的蛋白的相对分子量约为29kDa,与预期理论值一致;酶活性测定结果表明菌体可溶性总蛋白HSD酶比活性为142.81 U/mg,是对照BL21的12.97倍.结论 该研究成功地构建了3α-羟类固醇脱氢酶基因高效原核表达系统,为利用基因工程手段大量制备3α-HSD的工作奠定了基础.     

α1,2-岩藻糖基转移酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

利用PCR方法从幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,HP)基因组DNA中获得α1,2-岩藻糖基转移酶(α1,2-fuco-syltransferase,α1,2-fuct)基因,得到大小为906 bp的目的基因,将其定向插入到原核表达载体pET-22b(+)中,得到重组表达载体pET-fuct。将重组表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,25℃,0.1 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达4 h,并用SDS-PAGE分析目的蛋白的表达情况。结果表明,可表达出相对分子质量为33 kD的蛋白,与预期分子量一致,说明α1,2-岩藻糖基转移酶在大肠杆菌BL21中实现表达,应用HPLC法进行酶活检验,酶活达到了13.21 pmol/(mgPr.h)。     

Bacillus licheniformis6816碱性蛋白酶基因在E.coli中的克隆和表达

用PCR方法从地衣芽孢杆菌6816中扩增了碱性蛋白酶基因（apr),扩增的1.14kb的DNA片段插入到大肠杆菌载体pET-20b中,构建成重组分泌型表达载体pAPR1。pAPR1中碱性蛋白酶基因在大肠杆菌宿主JM109（DE3）中得到表达,SDS-PAGE分析显示融合表达产物的分子量为30kD,同核酸序列测定所推导的值相符,表达产物占细胞总蛋白的7.5%,重组菌的酶活比出发菌株提高了3.3倍,研究发现,重组的碱性蛋白酶在进入大肠杆菌周质空间时存在前肽自动脱落的现象。     

E.coli木糖异构酶基因的克隆及表达条件的优化

采用PCR技术以大肠杆菌JM109基因组DNA为模板扩增得到木糖异构酶基因xylA,连接到载体pET-22b( ),得到重组质粒pET-22b( )-xylA。将此重组质粒转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中,重组菌株经IPTG诱导后,通过半胱氨酸-咔唑法测得木糖异构酶活力。每mL发酵液中重组菌株显示出酶活力约为0.84 U。SDS-PAGE电泳结果显示出明显的5×104(相对分子质量)特异性蛋白质条带。     

大肠埃希菌Mn-SOD基因的克隆、表达及多克隆抗体制备

目的实现Mn-SOD基因在大肠埃希菌中的高可溶性表达,制备Mn-SOD的多克隆抗体。方法用PCR方法从一株野生型大肠埃希菌（E.coli）基因组中扩增Mn-SOD基因编码区．将它克隆到原核表达载体上进行大量表达和纯化,再用纯化的蛋白对新西兰大白兔进行背部多点注射,40d后取其血清,用Western-blot印迹实验测定抗体效果。结果SDS-PAGE分析表明SOD的表达量约为细菌总蛋白的50％;黄嘌呤氧化酶法测定表达蛋白活性,结果表明每毫克菌体可溶性总蛋白中表达产物酶比活为3921．77U／mg,是对照BL21的276．77倍;并制备了高效价的多克隆抗体。结论该研究成功地构建了大肠埃希菌Mn-SOD基因高效原核表达系统,所表达的Mn-SOD具有良好的免疫原性和免疫反应性。     

大肠杆菌trpBA基因的克隆表达

目的:提高大肠杆菌中色氨酸合成酶的表达量和表达活性。方法:利用PCR方法从大肠杆菌K-12的基因组中直接克隆出紧密连锁trpB和trpA基因(简称trpBA),并将其连接到原核表达载体pet22b( )中,得到重组质粒pet22b( )-trp-BA,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导重组蛋白表达,表达产物经SDS-PAGE分析并用比色法测定其活性。结果:凝胶电泳可见PCR扩增产物大小约为2kb,SDS-PAGE鉴定目的蛋白的Mr分别约为29000和44000,色氨酸合成酶α、β亚基分别得到了高效表达,色氨酸合成酶活性提高到对照菌的3.7倍。结论:成功构建了重组质粒pet22b( )-trpBA,色氨酸合成酶的表达量和表达活性在大肠杆菌中得到了提高,为高产色氨酸基因工程菌的构建奠定基础。     

人APRIL105-250基因的克隆与表达

目的 :克隆并表达人可溶性增殖诱导配体 (sAPRIL ,即人APRIL_105-250) ,为探索其在多种肿瘤细胞的增殖和存活以及促肿瘤形成中的作用奠定基础。方法 :从GENBANK中查找人APRIL蛋白 (编号:07588)序列 ,取其部分胞外 (APRIL_105-250)序列设计引物 ,用RT PCR从扁桃体总RNA中扩增出人APRIL_105-250基因 ,测序后将克隆载体经酶切并构建表达载体 ,在大肠杆菌中表达 ,并纯化蛋白。结果 :经克隆测序后进行同源比较 ,证实所克隆的基因即为人APRIL_105-250 基因。在大肠杆菌中表达量达 43.6% ,获得纯化蛋白。结论 :成功克隆与表达、纯化了人APRIL_105-250基因 ,为深入研究其功能奠定了基础 。     

人白细胞介素1受体拮抗剂cDNA克隆及其表达影响因素

采用ＰＣＲ技术成功地从人胎盘ｃＤＮＡ文库中扩增出人白细胞介素１受体拮抗剂（ｈＩＬ １ｒａ）成熟蛋白编码区基因,并以此为模板突变其ｃＤＮＡ５;其克隆产物经物理图谱证实与文献报道完全一致,利用含不同ＳＤ的同一表达质粒分别表达含不同５的ｃＤＮＡ,结合文献分析其表达影响因素,同时对ｈＩＬ １ｒａＥ．ｃｏｌｉ表达产物的可能存在形式进行了推论。     

猪源肠出血性大肠杆菌CD18株fedA基因的克隆及表达

目的:获得重庆猪源肠出血性大肠杆菌(EHEC)强毒株CD18株fedA基因表达产物。方法:根据GenBank中的fedA基因序列设计引物,从重庆猪源EHEC强毒株CD18株基因组中经PCR扩增目的片段,克隆到pUC19质粒,亚克隆到表达载体pET28b( )的SalⅠ-HindⅢ位点后转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,Ni柱法纯化,SDS-PAGE及Western印迹检验表达产物。结果:CD18株fedA与文献报道的fedA的序列同源性为99.3%,推导的氨基酸序列的同源性为98.7%,表达产物在50～100mmol/L咪唑洗脱时出峰,SDS-PAGE显示其相对分子质量20000,Western印迹证明该蛋白条带能与分子标记蛋白His6抗体发生特异反应。结论:克隆到猪源EHECCD18株fedA基因,并在大肠杆菌中得到表达。     

E．coli分泌表达载体的构建和人表皮生长因子在E．coli中的分泌性表达

采用ＰＣＲ技术从Ｅ．ｃｏｌｉ基因组片段中克隆出碱性磷酸酯酶（ＰｈｏＡ）的启动子和信号肽序列．在ＰｈｏＡ启动予５＇端设计了ＥｃｏＲⅠ酶切位点,在信号肽编码序列３＇端设计了ＨｉｎｄⅢ酶切位点．将ＰＣＲ产物酶切后ＥｃｏＲⅠ－ＨｉｎｄⅢ片段克隆至ｐＢＲ３２２的ＥｃｏＲⅠ－ＨｉｎｄⅢ位点,组构出含有ＰｈｏＡ启动子和信号肽序列的分泌表达载体ｐＢＭ－Ｐｈｏ－１．之后将人表皮生长因子的成熟肽基因克隆至该载体,使之在Ｅ．ｃｏｌｉ中获得分泌表达,另采用ｐＩＮⅢ载体系统以分泌方式表达了人表皮生长因子。     

人成骨蛋白-1成熟肽基因在大肠杆菌中的克隆与表达

本实验报告了人成骨蛋白 - 1成熟肽基因在大肠杆菌中的克隆与高效表达。通过计算机软件分析 ,采用大肠杆菌偏爱密码子设计并分段合成了人成骨蛋白 - 1成熟肽编码基因片段。用 PCR技术扩增目的基因片段 ,先克隆到 p UC1 9载体上 ,测序正确后再将其克隆到 p BV2 2 0表达载体上 ,以DH5α为宿主菌 ,42℃ ,6 h诱导表达。经 SDS- PAGE鉴定分析 ,在约 1 6× 1 0 3处有一新的蛋白质条带 ,扫描分析表明 ,该条带占菌体总蛋白含量的 40 %左右。     

在大肠杆菌中表达人防御素-1

构建了一组HNP-1原核表达载体,其中有几个含SD或序列的载体,在表达产物中检测到了HNP-1的存在,说明宿主菌是否在任何情况下都降解外源小分子多肽是一个值得考虑的问题．另外从表达载体在大肠杆菌JM109和JM109（DE3）中蛋白表达量的差异也可推测HNP-1发生了低水平的表达,HNP-1对细菌的作用与HNP-1浓度和细菌本身的生理状况密切相关.     

重组人载脂蛋白AI米兰突变体在大肠杆菌中的高表达

用RT-PCR法从人肝总RNA库中克隆出人载脂蛋白Al的cDNA序列,再通过重叠PCR将载脂蛋白AI的第179位精氨酸密码子突变成半胱氨酸密码子,即载胎蛋白AI米兰突变体基因。将此目的基因克隆至表达载体pQE30,重组质粒转化JMl09宿主菌,经表达试验筛选出高表达克隆;工程菌经诱导后表达出含6个氨基酸前肽的载脂蛋白AI米兰突变体。表达产物主要以可溶形式存在,但也有部分为包涵体。     

霍乱毒素B亚单位基因（CtxB）的克隆及其表达

从霍乱弧菌中抽提基因组ＤＮＡ,用ＰＣＥＲ方法获取霍乱毒素Ｂ亚单位基因（ＣｔｘＢ）。序列分析结果表明,ＣｔｘＢ基因编码１２４个氨基酸,其中编码６２位Ｔｈｒ的密码子与文献报道有差异。将ＣｔｘＢ基因插入质粒ｐＧＥＸ－４Ｔ－２,构建ｐＧＥＸ－ＣＴＸＢ表达质粒,转化大肠相菌ＢＬ２１（ＤＥ３０,筛选表达菌株ＣＴＸＢ／ＢＬ２１。工程株经ＩＰＴＧ诱导表达,可产生大量的表达蛋白,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,融合蛋白分子     

Streptomyces hygroscopicus谷氨酰胺转胺酶酶原基因的鉴定及在大肠杆菌中的表达

[目的]鉴定来源于吸水链霉菌的谷氨酰胺转胺酶基因;研究其在大肠杆菌系统的克隆与表达;分析该酶与其同源酶的活性中心氨基酸序列.[方法]从本实验室筛选的吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus;CCTCC M203062)发酵液中,分离纯化得到谷氨酰胺转胺酶酶原(pro-MTGase),测得N-端前十个氨基酸序列并与其它链霉菌来源的相应基因序列比较设计引物,扩增得到pro-MTGase 基因,将该基因插入到表达载体pET-20b( )信号肽pelB下游,构建分泌型表达载体pET/pro-MTG,并转化不同的大肠杆菌宿主BL21(DE3)和Rosetta(DE3)pLysS.[结果]获得了pro-MTGase的完整基因序列,多重碱基序列比对表明其与S.platensis和S.caniferus的pro-MTGase基因同源性高达92%.利用Rosetta(DE3)pLysS通过降温至24℃诱导策略,获得部分胞外表达的酶原.SDS-PAGE显示,胞外表达重组蛋白的分子量约为44kDa,与吸水链霉菌表达的天然酶原相符.诱导4 h后发酵液中的重组酶原经胰蛋白酶活化为成熟酶后测得最高酶活为0.24U/mL.[结论]该研究是对吸水链霉菌的谷氨酰胺转胺酶基因的首次报道,也是国内首次利用大肠杆菌实现pro-MTGase的胞外可溶性表达.     

Luciferase cDNA from Japanese firefly,Luciola cruciata: Cloning,structure and expression in Escherichia coli

We have cloned the cDNA for luciferase from lantern poly(A)⁺ RNA of a Japanese firefly, Luciola cruciata (Genji botaru in Japanese). This cDNA directed the synthesis of enzymatically active luciferase under the control of the lac promoter in Escherichia coli. The amino acid sequence predicted from the cDNA sequence shows that Genji firefly luciferase consists of 548 amino acids and has a molecular weight of 60,024. Considerable sequence homology was found upon the comparison of the Genji and North American firefly luciferases.     

Fusion expression of mutated cecropin CMIV in E. coli

A cDNA coding mutated cecropin CMIV from Bombyx mori was synthesized according to its amino acid sequense using E .coli biased codons .The gene was cloned into the fusion expression vector pEZZ318 and was expressed in E .coli HB101.The fusion protein produced was purified by affinity chromatography to yield 26 mg/L fusion product .The anti-bacterial activities of recombinant cecropin CMIV were recovered after cleavage by chemical method.     

小鼠canstatin C端片段基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

为了构建小鼠canstatinC端片段的原核表达载体并在大肠杆菌中表达。以小鼠肝脏组织总RNA为模板,通过RT-PCR扩增小鼠canstatinC端片段(mCan-C)基因,克隆到pMD18-T载体中并进行序列分析。将mCan-C基因定向克隆于原核表达载体pET30a(+)中,构建表达载体pET／mCan-C,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。结果表明,小鼠canstatinC端片段的cDNA长度为399bp,含有1个终止密码,编码132个氨基酸,与已知的人canstatinC端片段氨基酸的同源性为61％。IPTG诱导mCan-C在大肠杆菌E．coliBL21中表达,表达量约占菌体总蛋白量的28％,重组蛋白主要以包涵体形式存在。首次克隆了小鼠canstatinC端片段的cDNA,IPTG诱导mCan-C在大肠杆菌E．coliBL21中高效表达。小鼠canstatinC端片段的cDNA序列已收入GenBank,接受号为:AY502947。