水稻cDNA文库的构建以及100种随机挑取克隆部分结构的分析

以水稻 (Oryza sativa)“广陆矮 4号”黄化苗为材料 ,用 λZAP 为载体构建了 c DNA文库。对随机挑取的 1 0 0个 c DNA进行部分顺序测定后 ,与水稻和其它植物已知的基因结构作同源性比较分析 ,表明1 3%的 c DNA克隆可以确定功能 ,1 2 %的 c DNA克隆与其它植物中未知功能的基因片段有同源性 ,其余75%的克隆则表现出极少相似性或无任何同源性 ,从中可能发现新的基因。结果表明这个 c DNA文库适宜于进行大量顺序分析。由此将会获得更多功能性基因的信息。     

水稻农林8号m cDNA文库的构建与分析

用农林 8号m萌发 15天左右幼苗抽提总RNA ,然后分离mRNA ,构建农林 8号mcDNA文库。经测定原始文库滴度达到 1.4× 10 6,14个随机抽取的重组子 ,通过PCR测得插入片断的 0 .4kb～ 2kb ,平均约 1kb。重组率在 99%以上。完全符合cDNA文库构建要求     

Partial cDNA Cloning and Nucleotide Sequence of Rice Dwarf Virus Genome

Rice dwarf virus (RDV) was isolated and purified from infected rice leaves with chloro form extraction, PEG precipitation and sucrose gradient centrifugation. Total RDV RNA ge nome was separated in the agarose gel and segments of RDV RNA genome were purified. The cDNAs of several segments were synthesized with oligo dT as primer. Through cDNA mapping, subcloning and sequencing, we have obtained partial DNA sequence of those segments. Here we report the cloning and partial DNA sequence of segment 8 from RDV RNA genome.     

新疆荒漠昆虫光滑鳖甲cDNA文库的构建及功能基因筛选

以过冬后早春的新疆荒漠拟步甲属昆虫光滑鳖甲(Anatolica Polita borealis)成虫为研究材料,应用SMARTTM cDNA Library Construction技术,通过总RNA提取,反转录合成cDNA,定向构建至噬菌体载体λTripEx2,经体外包装构建了光滑鳖甲的cDNA表达文库。测试结果表明库容量为2.2×106,重组率为84.8%。通过对cDNA文库克隆的序列测定和初步生物信息学分析,获得28个光滑鳖甲表达序列标签(ESTs),包括17个EST(60.7%)与NCBI中已注册的已知功能基因相似性较高,另外的11个EST(39.3%)则没有发现与之相似的序列,推测可能是功能未知的新基因。同时,利用PCR扩增文库技术从cDNA文库中克隆获得了光滑鳖甲的抗冻蛋白基因,初步表明光滑鳖甲cDNA表达文库构建的成功,为深入研究新疆荒漠昆虫的抗冻机理及发现新的昆虫功能基因奠定了基础。     

江苏水稻黑条矮缩病毒S10的cDNA克隆序列分析

从来自江苏连云港并在本实验室保存的水稻黑条矮缩病毒接种的病株玉米中提取dsRNA ,采用改进的单引物扩增技术获得了病毒基因组片段S10的cDNA克隆并测定了其全序列。结果表明S10全长 180 1bp ,含有一个ORF ,组织结构与日本报道的RBSDV基本一致 ,核苷酸和推导的氨基酸序列与MRDV的相似性分别为 87.5 %和92 .6 % ,与RBSDV的相似性分别为 93.3%和 96 .4%。该研究也为病毒dsRNA克隆和序列分析奠定了基础     

一株中华绒螯蟹呼肠孤病毒RNA1 cDNA文库构建及其RNA聚合酶基因部分序列分析

在中华绒螯蟹体内分离一株呼肠孤病毒（命名为EsRV905株）,采用Trizol试剂提取病毒核酸,经聚丙烯酰胺凝胶电泳,碎胶法回收基因组各节段。随机引物法合成第一节段的cDNA文库,胶回收试剂盒去除小片段,平端连接于载体,化学转化,利用蓝白斑筛选阳性克隆子,酶切鉴定重组质粒。从基因组第一节段的重组质粒中选择2个插入片段为1.5kb的质粒测序,结果得到包括RNA聚合酶主要特征性结构的一段序列。结果说明,这株蟹呼肠孤病毒的RNA聚合酶定位于基因组第一节段。     

木榄幼苗叶片cDNA文库的构建及其表达序列标签分析

应用SMART技术构建了25‰盐度下生长4个月的木榄叶片的cDNA文库,文库滴度为10~6 cfu mL~(-1),重组率为94.4%,插入片断长度为1～2 kb.从cDNA文库中随机挑选了96个重组克隆进行序列分析,共获得94个表达序列标签(ESTs),经质量控制和聚类拼接后得到81个unigenes,包括5个片断聚合群和76个单一序列.Blastx分析结果表明这些unigencs与GenBank的Nr数据库中已报道的基因具有较高的同源性(E<10~(-5)),它们参与呼吸代谢、光合作用、糖代谢、氨基酸代谢、脂肪酸代谢以及不饱和脂肪酸生物合成等重要的生理过程,并与机体的损伤修复、胞吞作用以及PPAR信号途径等相关.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒cDNA文库的构建及基因组序列的测定

猪繁殖与呼吸综合征自1987年首次在美国发现以来,几年之内便席卷了北美洲和欧洲大陆,后蔓延至许多亚太国家和地区 .我国1995年首次暴发此病,该病在我国普遍存在,给我国养猪业的健康发展造成巨大障碍.目前国内外尚无理想防疫疫苗.当前用于预防的猪繁殖与呼吸综合征的主要疫苗是弱毒苗和灭活疫苗.灭活疫苗免疫效果差,弱毒苗能提供较好的免疫保护,但毒力返强的几率相当高,这一点已在几年前丹麦等国因广泛使用弱毒苗而导致该病大暴发中得以证实.     

高山植物黄管秦艽cDNA文库构建与表达序列标签（EST）分析

黄管秦艽（Gentiana officinalis）是一种重要的藏药高山植物,本研究构建了该物种开花期的eDNA文库。经检测达到中等cDNA文库水平,文库滴度为1．2×10^7pfu／ml,重组率95．9％,插入片段平均长度大于500bp。对343个随机挑选的重组克隆进行部分测序,获得的ESTs经编辑后共有181条有效序列。经生物信息学方法分析181条表达序列标签（EST）代表144个单克隆序列,其中55个与已鉴定的基因同源,35个序列与未鉴定的EST匹配,54个未找到同源序列;后两者共有89个EST序列未发现功能相似的蛋白。对已鉴定的EST进行功能分析发现,相关基因主要编码以下蛋白：与蛋白表达相关的占35％;光合作用相关的占笠％;新陈代谢相关的占18％;抗性相关的占11％;质膜运输和细胞分裂相关的分别占5％;染色体变化和细胞信号转导的分别占2％。根据有效EST序列设计引物,通过RT-PCR进一验证了所得EST的准确性。这些研究结果为将来研究黄管秦艽的功能基因以及该物种与相关物种的群体遗传学、进化生物学等方面提供了基础。     

鸡下丘脑cDNA文库的构建及部分克隆ESTs序列初步分析

以鸡下丘脑为实验材料,以λgt10为载体,构建了鸡下丘脑cDNA文库。结果表明,文库的滴度为3.8×10     

青杄均一化cDNA文库构建及EST序列分析

以青杄花粉和针叶为材料,将青杄全长cDNA与Gateway供体载体pDONR222重组,构建了其非剪切型全长cDNA原始文库,利用基因组DNA饱和杂交技术对原始cDNA文库进行均一化处理,构建青杄的均一化全长cDNA文库。文库的总库容量为1.1×106CFU/mL,平均插入片段长度大于1.0 kb,重组率大于95%。定量RT-PCR检测表明,青杄高丰度表达基因EF1-α在均一化cDNA文库中的表达量下降了约41倍。接着对文库中随机的5 144个克隆进行了测序,获得高质量的有效EST(expressedsequence tag)序列为5 144条,经拼接共获得单一基因(unigene)为2 717个,其中包括片段重叠群(contig)628个和单一EST序列(singlet)2 089个。NCBI同源比对分析表明,其中1 887个序列unigenes获得分子功能注释,这些EST涉及细胞生长、信号转导、转录、抗逆、能量代谢等功能。这些数据有助于对青杄的相关功能蛋白及分子机制开展进一步的研究。     

cDNA文库的构建策略及其应用

cDNA文库在基因分离和克隆中具有重要的作用。从cDNA文库中能筛选出所需要的目的基因,并直接用于该目的基因的表达。cDNA文库是发现新基因和研究基因功能的基础工具。随着分子生物学技术的发展。cDNA文库构建方法有了很大改进和提高,就cDNA文库的构建方法及其应用进行综述。     

羊种布鲁氏菌侵染HPT-8细胞cDNA文库的构建及EST序列分析

拟建立羊种布鲁氏菌侵染HPT-8细胞的cDNA文库。分别提取布鲁氏菌侵染20min、1h、2h、3h、4h后HPT-8细胞总RNA,逆转录合成cDNA,同源重组法构建布鲁氏菌侵染HPT-8细胞的cDNA文库,测定其库容量和重组率,对文库63个克隆进行测序分析,采用BLASTx和BLASTn进行序列同源性比对,并将63个基因进行了功能分类。结果得到的羊种布鲁氏菌侵染人胚胎滋养层细胞HPT-8cDNA文库的库容为1.43×106,重组率是96.92%,插入片段大小为0.2-5.0kb。在63个基因中,与转录、能量代谢、运输及细胞因子相关的基因所占比例较高。构建的羊种布鲁氏菌侵染HPT-8细胞的cDNA文库,为研究宿主细胞受体和布鲁氏菌入侵途径,进一步了解布鲁氏菌的致病机理奠定了基础。     

铁皮石斛cDNA文库的构建及分析

首次报道铁皮石斛cDNA文库的构建及其分析.以Trizol一步法从4年生的铁皮石斛叶片中提取总RNA,分离纯化mRNA,LD-PCR法反转录合成双链cDNA,以λTripEX2为载体,构建铁皮石斛cDNA文库.原始文库的滴度为4.3×105 pfu/mL,总克隆数为3.1×105,重组率为97.6%,扩增后文库总滴度为6.8×109pfu/mL,对随机挑取的噬菌斑进行PCR鉴定,结果插入片段多分布在0.5～2.0kb之间,绝大部分在1.2～1.7kb左右,文库质量鉴定结果表明,构建的铁皮石斛cDNA文库具有较好的库容量、较高的重组率以及较大的插入片段.cDNA文库的构建为铁皮石斛药用成分相关功能基因的研究奠定了基础.     

中国人HIV辅助受体CXCR4基因的克隆及序列测定

为了获得ＨＩＶ辅助受体ＣＸＣＲ４基因,进一步探索艾滋病（ＡＩＤＳ）的诊断、防治方法,采用逆转录巢式聚合酶链式反应（ＲＴ－ｎＰＣＲ）从中国人外周血淋巴细胞中克隆了ＣＸＣＲ４　ｃＤＮＡ基因,得到了预期的１　１００ｂｐ左右的片段。将ＰＣＲ产物与Ｔ载体连接,并进行了酶切反应鉴定,获得与Ｔ载体正向连接的克隆。测序结果表明：克隆的片段含有一个开放性阅读框架,编码３５２个氨基酸残基。搜索ＧｅｎＢａｎｋ,目标片段与Ｍ９９２９３、ＸＭ０５１２２３、ＸＭ０５１２２４、　ＸＭ０５１２２５有很高的同源性,比较结果显示：克隆的片段包括完整的编码序列,含两个碱基的差异。     

两个枣树扩展蛋白基因cDNA全序列的克隆及分析

用定向克隆法构建了枣树(Ziziphus jujubaMill.)快速生长初期结果枝的cDNA文库,经过重组质粒的筛选,克隆获得两个扩展蛋白基因cDNA全序列,分别命名为ZjEXP1(GenBank登录号:FJ449891)和ZjEXP2(GenBank登录号:FJ449892)。ZjEXP1全长1 037 bp,包含编码254个氨基酸的完整开放阅读框;ZjEXP2全长905 bp,包含编码251个氨基酸的完整开放阅读框。两个序列有共同的结构特征,即在N-末端有8个保守的半胱氨酸残基的丰富域,C-末端有4个保守的色氨酸残基的丰富域,中间有一个组氨酸(His-Phe-Asp,HFD)功能域。两者之间的氨基酸同源性为74.0%。从已知的扩展蛋白基因家族的进化分析表明,ZjEXP1和ZjEXP2由一个祖先进化而来,又分别属于两个不同的分支。     

鸡含锰超氧化物歧化酶cDNA克隆及序列分析

 为弄清鸡含锰超氧化物歧化酶 (manganese containingsuperoxidedismutase ,MnSOD)的cDNA序列 ,以开展动物锰营养学的深入研究 ,根据已知鸡MnSOD的N端氨基酸序列设计简并引物 ,应用 3′RACE(rapidamplificationofcDNAends)技术 ,扩增克隆了鸡心肌MnSOD 990bp的 3′cDNA片段 .再根据 3′RACE片段测序结果设计引物进行 5′RACE ,结果获取了一个与 3′RACE片段相互重叠的鸡心肌MnSOD 52 1bp的 5′RACE片段 ,并对其进行了克隆测序 .最后根据 3′RACE片段和 5′RACE片段序列信息进行拼接 ,从而获取鸡MnSODcDNA的全序列信息 .研究结果表明 :鸡MnSODcDNA全长为 110 8个核苷酸 ,其中 5′非翻译区 2 5个核苷酸 ,编码区 675个核苷酸 ,3′非翻译区 4 0 8个核苷酸 ,编码一个长 2 2 4个氨基酸残基的蛋白质前体 .其中信号肽长 2 6个氨基酸残基 ,成熟肽长 198个氨基酸残基 ,分子量为 2 2kD .与人、大鼠、线虫、果蝇等真核生物MnSOD氨基酸序列的同源性分别为82 4 %、84 .7%、62 .4 %、59.3% .     

刺参管足SMART cDNA文库构建及EST分析

以大连广鹿岛野生刺参的管足mRNA为材料,利用SMART cDNA Construction Kit构建了表达型cDNA文库.初始文库的滴度为1.3 × 106PFU/mL,蓝白斑估测量组率合格.扩增后获得96 mL文库,滴度为1.8 × 1010PFU/mL,从扩增文库中随机挑取200个噬菌斑进行PCR检测,电泳检测结果表明重组率大于90％,片段大小在0.25 -2.0 kb之间的插入片段占80.4％,文库构建成功.随机选择122个噬菌斑转化为质拉pTriplEx2并测序,测序成功率83.6％,软件处理后100 bp以上的clean ESTs有72条,测通的为65条,占成功测序样品的63.7％.72条序列经SeqMan软件拼接,获得48条conting/singletons,在线Blast比对发现其中26条具有同源序列并获得注释,另外20条可能为新基因,其功能和结构有待进一步利用生物信息学的方法进行分析和研究.