小鼠8细胞期胚胎超低温（一1960G)冷冻保存

1972年W hittingham 和W ilmut在超低 温条件下冷冻保存小鼠早期胚胎分别取得成 功。由于这项工作的理论意义和实用价值,国 际上一些实验室相继开展了研究工作。迄今, 家兔、羊和牛早期胚胎冷冻保存都已成功,其中 牛的胚胎冷冻已发展到商业规模。用胚胎冷冻 保存技术保存小鼠近交系、突变系等遗传资源 有其特殊意义,因而受到普遍重视。用这一方 法维持重要品系可以避免因意外事件造成遗传 资源丢失和遗传污染,可减轻由于日益增加的 近交系、突变系数量给繁育管理工作带来的沉 重负担。国外有些实验室已建立小鼠冷冻胚胎 库,证明这是稳定、经济和安全地保存遗传资源 的行之有效的方法。     

小鼠冷冻胚胎库

1972年惠廷厄姆(Whittingham)等和威尔马特(Wilmut)分別报告在超低温(-196℃)条件下冷冻保存小鼠早期胚胎获得成功。此后,这项技术又成功地用于保存大鼠、家兔、羊和牛早期胚胎。目前在国外牛早期胚胎冷冻保存已发展到商业规模,在实验室小鼠方面有些国家已经建立了相当规模的冷冻胚胎库。 小鼠是医学和生物学研究中广泛使用的实验动物,长期以来培育出大量近交系和突变系,     

猪胚胎常规冷冻及其去脂冷冻研究

1.引言 自1972年小鼠胚胎冷冻首次取得成功以来,胚胎的冷冻技术已逐渐应用到很多种哺乳动物。现在包括牛、绵羊在内的多种家畜物种的胚胎冷冻保存已经成为一种常规的技术。然而利用冷冻保存的胚胎生产出活的仔猪仍然处在摸索阶段,并且仅仅是孵出囊胚的冷冻保存获得成功。这种局限性以及胚胎移植后很低的存活率严重阻碍了猪胚胎冷冻保存技术的发展。     

昆明小鼠精子冷冻的研究(简报)

胚胎工程技术是动物品种、品系培育,种质资源保存及转基因动物制备、保种的重要手段。配子的冷冻保存技术目前广泛应用于胚胎工程。和胚胎冷冻相比小鼠精子冷冻技术方便、高效尤其适用于转基因及突变系小鼠的保种。成功的精子冷冻要求复苏后通过体外受精(IVF)获得胚胎,再移植入受体,生长发育并产出幼仔。胚胎体外培养获得足够的晚桑葚胚和早期囊胚是胚胎干细胞建立与制备嵌合体小鼠的成功关键,暂时不用的胚胎应仍能耐受冷冻保存,待复苏移植,建立新的繁殖群。但小鼠精子冷冻研究在我国开展的十分有限,缺乏相关资料数据。本实验对不同周龄SPF级昆明(KM)小鼠进行精子冷冻及冻融精子IVF,并将IVF获得的2-细胞胚胎分别进行胚胎移植、体外培养、胚胎冷冻及复苏后移植,应用冻融小鼠精子进行胚胎工程实践。     

Lats1基因敲除小鼠保种的研究

目的　以Lats1基因敲除小鼠为例 ,研究国家遗传工程小鼠资源库遗传小鼠的保种技术路线及方法。方法　采用了胚胎移植 ,目的基因检测 ,胚胎冷冻等技术。结果　在库内得到 2 4只Lats+ -小鼠 ,扩群后 ,冷冻保存 110枚胚胎。结论　上述方法能确保Lats1基因敲除小鼠资源库保种成功。     

昆明小鼠精子冷冻的研究（简报）

胚胎工程技术是动物品种、品系培育,种质资源保存及转基因动物制备、保种的重要手段。配子的冷冻保存技术目前广泛应用于胚胎工程。和胚胎冷冻相比小鼠精子冷冻技术方便、高效尤其适用于转基因及突变系小鼠的保种。成功的精子冷冻要求复苏后通过体外受精(IVF)获得胚胎,再移植入受     

哺乳动物卵母细胞的冷冻保存方法

卵母细胞的冷冻保存与精子和胚胎的冷冻保存一样,具有许多潜在的应用价值。八十年代以后,卵母细胞体外成熟、体外受精、核移植,基因转移等相继研究成功。把优良品种动物废弃卵巢中的大量卵母细胞冷冻保存,可为这些生物技术提供充足的材料。卵母细胞的冷冻保存也为稀有动物,濒危动物和其它有价值的雌性个体(如基因工程个体)的遗传资源的长距离国际间运输及长期保存提供了可能。在人,卵母细胞冷冻保存可以克服胚胎冷冻保存所引起的一系列伦理道德及法律问题。     

影响哺乳动物卵母细胞玻璃化冷冻保存效果的因素

从屠宰场收集具有高遗传价值的卵母细胞进行冷冻保存,生产可移植胚胎,这为补充宝贵的种质资源以及物种遗传改良提供机会。虽然玻璃化冷冻技术已经成功保存了几种动物的卵母细胞,但由于卵母细胞对低温极其敏感,导致其进展十分缓慢。本文主要综述了卵母细胞脂质含量、卵丘细胞层、冷冻卵母细胞阶段、冷冻保护剂等因素对哺乳动物卵母细胞玻璃化冷冻保存效果的影响,为改善卵母细胞冷冻效果指引方向。     

胚胎分割的研究进展

近二十年来 ,通过分割哺乳动物的早期胚胎来人工产生遗传上完全相同的同卵双胎或多胎动物 ,在绵羊、牛、小鼠、大鼠、马、兔、猪等哺乳动物中已广为开展〔１～１４〕。为生产上提供了具有优良品种（产肉、产奶量高等）的动物 ,同时 ,还给发育遗传学、生理学等领域提供了进行科学研究的宝贵材料。所谓胚胎分割系指用人工方法将一个植入前胚胎分割成两个或多个部分 ,每一部分移植后可发育成一个正常个体。早在１９５９年,Ｔａｒｋｏｗｓｋｉ〔１５〕发现一半卵裂球已被破坏的２ -细胞小鼠胚胎可以发育成囊胚 ,并出生了小鼠。其研究结果表明 :…     

非人灵长类动物种质冷冻保存研究进展和展望

非人灵长类动物是生物多样性的重要组成部分,也是生物医学研究的珍贵实验动物,然而,由于人类活动、栖息地破坏、狩猎和遗传隔离等原因,许多非人灵长类动物的野生种群数量急剧下降,甚至处于灭绝的边缘。种质冷冻保存对拯救非人灵长类动物和保存遗传物质资源具有重要意义。本文综述了新大陆猴、旧大陆猴和巨猿等类群动物精子、卵子、胚胎和性腺组织等种质冷冻保存的研究进展,介绍了狨猴、松鼠猴、恒河猴、食蟹猴和黑猩猩等种质冷冻保存的主要方法,并对未来种质冷冻保存的研究方向进行了讨论。     

系统低温生物学技术在实验小鼠资源保存中的建立与应用

目的建立小鼠胚胎与配子冷冻库,以安全、有效地保存小鼠资源。方法选择不同遗传背景（近交系、远交群、免疫缺陷、疾病模型和基因改变等）的实验小鼠,系统进行了超数排卵、体外受精（IVF）率、胚胎与精子的冷冻复苏效果、卵巢冷冻与移植、辅助体外受精等比较研究。结果①小鼠年龄和遗传背景的不同,其超数排卵的结果也不同（P〈0．01）。三个日龄段中,28日龄最好,其次为112日龄,56日龄最差;不同遗传背景小鼠的超数排卵结果显示,封闭群和大部分近交系小鼠优于转基因小鼠（P〈0．05）,自发性疾病小鼠和基因剔除小鼠的结果最差;②不同品系小鼠的新鲜精子和冻融精子的体外受精率差异有显著性（P〈0．05）,特别是C57BL／6J小鼠冻融精子的IVF率（10．3±4．2％）与新鲜精子（89．8±4.8％）相比,差异极显著（P〈0．01）;③不同品系小鼠的胚胎复苏率,除MRL／mp小鼠的复苏率略低外,其他小鼠品系均有较高的冷冻胚胎复苏率（58．2％～83．9％）,表明,不同遗传背景小鼠之间差异有显著性（P〈0．05）,但均可以达到有效保存小鼠资源的目的。④小鼠的遗传背景、年龄等对小鼠精子的冷冻效果都有影响,采用改良的FERTIUP冷冻保护剂和细胞质内单精注射（ICSI）技术可有效提高以C57BL／6J为背景的基因改变小鼠的精子冷冻复苏率。⑤卵巢冷冻保存可以改善雌性小鼠的繁殖困难或不孕。结论小鼠资源的安全保存,除了长期连续繁殖保种外,最好的或最保险的方法是低温保存。通过将胚胎、配子、卵巢等长期保存在液氮（-196℃）中避免遗传性状的改变,并在将来复苏后获得正常的小鼠后代,以用于生物学和医学等研究。     

干细胞技术在地方猪种质资源保护中的应用前景

我国是养猪大国,拥有全球1/3猪种质资源。但近年来,我国地方品种猪养殖量急剧减少,部分品种几近灭绝,地方猪种遗传资源多样性遭受严重破坏,优质基因不断流失。如何有效保护和保存这些优良种质资源是非常紧迫和关键的问题。目前猪种质资源保护包括原位保存、精液和胚胎冷冻保存、DNA文库保种和体细胞冷冻保存等,但都存在一定局限性。干细胞是一类可以自我更新并具有分化潜能的细胞群体,它不仅能分化成不同类型的细胞,还可以通过分裂维持自身群体稳定。在小鼠和猪等动物上,利用干细胞已成功获得健康后代。最近,以干细胞研究为引领的种质资源保护新浪潮正在兴起,干细胞技术将成为我国地方猪种质资源保护的新手段。     

应用乙二醇冷冻小鼠胚胎：优化和简化程序的探索

提高解冻胚胎的发育能力和简化冷冻解冻程序是胚胎冷冻研究的两大永恒的主题。尽管乙二醇（EG）广泛用于家畜胚胎冷冻,但很少用于冷冻小鼠和人胚胎。为数很少的以EG慢冻小鼠或人胚胎的研究均采用较为复杂的人胚冷冻程序,未见简化程序和用EG冷冻小鼠桑椹胚的报道。采用简单的牛胚胎冷冻程序研究了发育时期、EG浓度、平衡方法、添加蔗糖以及解冻后脱除EG等对小鼠胚胎冻后发育能力的影响。结果显示：（1）致密晚期桑椹胚冻后体外培养囊胚发育率（81.92%±2.24%）和孵出率（68.56％±2.43%）显著（P＜0.05)高于4-细胞、8-细胞胚胎和致密早期桑椹胚胎;（2）1.8mol/L EG冷冻小鼠致密晚期桑椹胚的囊胚发育和孵出率显著高于其它浓度;（3）在EG中平衡10min的冻后囊胚发育显著好于平衡5、20或30min;（4）两步平衡冷冻胚胎的囊胚发育率和孵出率显著高于一步平衡;（5）用EG冷冻小鼠胚胎无需添加蔗糖;（6）解冻后可不脱除EG;（7）冻后发育的早期囊胚和囊胚细胞数明显少于体内发育胚胎。因此,用EG冷冻小鼠胚胎的最佳方案为：致密晚期桑椹胚用1.8mol/L EG不添加蔗糖、两步平衡15min、以简单的牛胚胎冷冻程序冷冻解冻、解冻后不脱除EG直接培养或移植。     

远交系小鼠胚胎干细胞系的建立及嵌合鼠的获得

ES细胞（Embryonic Stcm Cells)是来源小鼠早期胚胎的多潜能干细胞,它可以在体外大量培养,并以单细胞的形式注射到早期胚胎里,发育为嵌合体,到目前为止,通常使用的129小鼠品系是来源于近交系（inbrcd)小鼠的胚胎。与之相比,远交系小鼠应当具有较强的生命力和抗病能力。曾有人报道过建成了远交系小鼠胚胎干细胞系,但是尚没有见到获得嵌合鼠的报道。有人甚至认为：由于不同品系小鼠所具有的遗传背景不同,有的小鼠不能建成ES细胞系。最近,本实验室在这方面做了有益的探索,成功地建成了远交系小鼠胚胎干细胞系,并在这里报导首例用远交小鼠胚胎干细胞系培育成功嵌合体小鼠。采用源于Swiss小鼠远交群的昆明（KM）品系小鼠囊胚建成了三个小鼠胚胎干细胞系（KE1,KE2,KE5)。核型正常率均达到70％以上。自第八代起分批存。复苏后,培养至第12代,消化成单细胞,通过囊胚显微注射,将其注射到615品系小鼠胚胎。在幸存的幼鼠中获得了一只来源于KE1细胞的嵌合鼠（Table1)。其毛色表现为受体鼠（615）的白色中嵌合有供体鼠（KM)黑褐色（Platc I-A）。嵌合鼠与受体鼠的杂交后代鼠中仍然出现了受体鼠的毛色类型（PlateI-B)。证明：ES细胞能嵌合到生殖腺并形成具有正常功能的配子,从而产生种系嵌合鼠。     

远交系小鼠胚胎干细胞系的建立及嵌合鼠的获得

ＥＳ细胞（ＥｍｂｒｙｏｎｉｃＳｔｅｍＣｅｌｌｓ）是来源于小鼠早期胚胎的多潜能干细胞,它可以在体外大量培养。并以单细胞的形式注射到早期胚胎里,发育为嵌合体。到目前为止,通常使用的１２９小鼠品系是来源于近交系（ｉｎｂｒｅｄ）小鼠的胚胎．与之相比,远交系小鼠应当具有较强的生命力和抗病能力。曾有人报道过建成了远交系小鼠胚胎干细胞系,但是尚没有见到获得嵌合鼠的报道。有人甚至认为：由于不同品系小鼠所具有的遗传背景不同,有的小鼠不能建成ＥＳ细胞系。最近,本实验室在这方面做了有益的探索,成功地建成了远交系小鼠胚胎干细胞系,并在这里报导首例用远交系小鼠胚胎干细胞系培育成功嵌合体小鼠。采用源于Ｓｗｉｓｓ小鼠远交群的昆明（ＫＭ）品系小鼠囊胚建成了三个小鼠胚胎干细胞系（ＫＥ１．ＫＥ２．ＫＥ５）。核型正常率均达到７０％以上。自第八代起分批冻存,复苏后,培养至第１２代,消化成单细胞,通过囊胚显微注射,将其注射到６１５品系小鼠胚胎。在幸存的幼鼠中获得了一只来源于ＫＥ１细胞的嵌合鼠（Ｔａｂｌｅ１）．其毛色表现为受体鼠（６１５）的白色中嵌合有供体鼠（ＫＭ）的黑褐色（ＰｌａｔｅＩ－Ａ）．嵌合鼠与受体鼠的杂交后代鼠中仍然出现了受体鼠的毛色类型（     

分割兔胚获得半胚发育的小兔

哺乳动物胚胎分割的研究,近十年来有很大进展。继小鼠(1970年)首次分割成功后,大鼠、猪、牛、山羊和绵羊等胚胎分割亦已成功,得到由半胚发育的后代。至今已有人工制造的同卵双胎、三胎及四胎,分割方法亦由复杂到简单。特别是最近一些研究结果证实,多种动物的晚桑椹或囊胚期胚胎分割后,半胚不需要再     

牛卵母细胞玻璃化冷冻保存影响因素的研究

采用毛细玻璃管法对牛卵母细胞进行玻璃化冷冻保存,解冻后再进行体外受精（IVF）和早期胚胎的体外培养（IVC）。在此技术的基础上,分别对冷冻前平衡时间、解冻处理、卵丘细胞层数以及卵母细胞所处的减数分裂阶段等影响卵母细胞冷冻保存的因素进行研究,以期筛选出适合牛卵母细胞冷冻保存的方法。结果发现,处于MⅡ期卵母细胞在10％二甲基亚砜（DMSO）＋10％乙二醇（EG）液（VSl）中平衡1～3min,然后进行玻璃化冷冻保存。解冻时将卵母细胞先移入VS1液中处理15s,然后移入蔗糖稀释液中。另外发现,冷冻保存时部分卵丘细胞对卵母细胞有保护作用。而减数分裂阶段不影响解冻后卵母细胞形态正常率,但对胚胎发育率有严重影响。     

自制载体冷冻小鼠原核期胚胎效果分析

目的探讨自制冷冻载体冷冻保存昆明小鼠体内原核期胚胎的可行性。方法首先,比较了两种流行的商业化载体:开放式拉长麦管(open pulled straw,OPS)和冷冻帽(cryotop)开展小鼠原核胚玻璃化冷冻保存效果。其次,以cryotop为对照,利用自制简易载体(cryotip)开展小鼠原核期胚胎的玻璃化冷冻保存。之后,利用ANOVA对各组胚胎在复苏后的体外培养卵裂率、囊胚率进行统计分析。结果 OPS和cryotop两组之间,胚胎在玻璃化冷冻/复苏后发育的2-细胞率、4-细胞率和囊胚率差异均无显著性(P0.05),但cryotop冷冻效果更接近对照组;cryotip玻璃化冷冻载体与cryotop相比,胚胎复苏后各组差异均无显著性(P0.05),数值上除了2-细胞发育率外,cryotip其他几项结果都稍微高于cryotop组。结论 OPS,cryotop,cryotip冷冻保存昆明小鼠体内原核期胚胎均是可行的;cryotop在冷冻效果上要优于OPS,笔者自制的cryotip因其成本低,制作简单,操作安全可靠,在实验中替代昂贵的商业化载体OPS和cryotop是可行的。     

小鼠2-细胞胚胎单个卵裂球体外培养及其发育形成囊胚的玻璃化冷冻保存技术的研究

单个卵裂球分离和培养是生产同卵双胎或一卵多胎动物的一种有效方法。在羊和牛已经获得了来源于2-细胞和4-细胞期胚胎的单个卵裂球的活体后代;在兔也获得来源于4-细胞胚胎的单个卵裂球后代;在猪已获得8-细胞单个卵裂球的后代。但多数的研究者发现,小鼠单个卵裂球培养后的体外发育率、移植妊娠率和产仔率都很低。上述均为新鲜胚移植结果,至于分离后卵裂球发育成的囊胚再进行玻璃化冷冻保存尚未见报道。本实     

哺乳动物早期胚胎体外发育阻滞的研究进展

哺乳动物胚胎在体外培养中普遍存在早期发育阻滞的现象。对此,人们用形态学、生物化学、分子生物学、显微操作等手段开展了磷酸、葡萄糖、次黄嘌呤和细胞质因素对早期胚胎发育阻滞的影响的研究。本综合分析了共培养系统的优缺点。说明了采用完全成分已知的培养液对进行有关研究的必要性。列出了有效运用于克服小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猪、羊、牛、猴等动物早期胚胎阻滞的成分知的培养液的名称。