AP-1与STAT5相互作用协同调节血管紧张素原基因表达

为研究AP-1和STAT5协同调节血管紧张素原基因表达的作用机制,用凝胶电泳迁移率改变分析（EMSA）和染色质免疫沉淀分析（ChIP assay）检测血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的AP-1和STAT5的DNA结合活性;用凝胶超迁移分析和免疫共沉淀方法观察AP-1和STAT5的相互作用. 结果显示,AngⅡ可分别促进AP-1和STAT5与血管紧张素原基因调控区顺式元件的结合以及二者之间的相互作用;核蛋白与含AP-1结合位点的寡核苷酸探针结合形成的复合物可与抗c-Jun抗体和抗STAT5抗体形成超迁移电泳区带;而用抗c-Jun抗体也可从STAT5 染色质免疫沉淀复合物洗脱液中检测到AP-1的存在. 而且,AP-1和STAT5的相互作用程度及其二者与DNA的结合活性与血管紧张素原表达活性具有一致关系,该效应可被JAK2特异抑制剂AG490所抑制. 上述结果提示,与顺式元件结合的AP-1和STAT5通过相互作用而形成四元复合物协同调节血管紧张素原基因的表达,JAK2对该过程具有诱导活化作用.     

血管舒-缩肽在血管平滑肌细胞中的表达与调控

为探讨血管舒 缩肽表达的调控机制及血管平滑肌细胞 (VSMC)在该网络平衡中的地位 ,以血管紧张素Ⅱ (AngⅡ )为诱发因素刺激培养的大鼠VSMC ,用RT PCR和放射免疫分析观察内皮素 1(ET 1)、AngⅡ、心钠素 (ANF)和肾上腺髓质素 (ADM)在VSMC中的表达与释放及相互关系 ,用电泳迁移率改变分析 (EMSA)和染色质免疫沉淀 (ChIP)分析揭示其分子机制 .在被AngⅡ处理的VSMC中 ,4种血管活性肽的表达活性均升高 ,其中缩血管肽基因表达被迅速诱导 ,而舒血管肽则是先降后升 .但刺激前后舒 缩血管肽之间的平衡关系无明显改变 .放免分析证实 ,AngⅡ可程度不同地促进 4种血管活性肽合成 ,使胞内 4种活性肽水平升高 ;对培养液中 4种活性肽进行检测的结果显示 ,AngⅡ可促进ET 1、AngⅡ释放 ,抑制舒血管肽释放 ,尤以ANF的胞内水平明显高于胞外 .EMSA分析显示 ,在AngⅡ诱导 4种肽表达的同时 ,与细胞增殖有关的转录调控因子转录激活蛋白(AP 1)与 4种活性肽基因启动子的结合活性明显增强 .ChIP结果表明 ,AP 1在染色质靶位点的募集与血管活性肽基因的表达上调有直接关系 .结果提示 ,AP 1与特异DNA顺式作用元件的相互作用参与了血管活性肽的转录激活 .VSMC不仅作为它们的效应器 ,而且还通过调节AP 1与靶基因中的共有顺式元件——     

血管钠肽对大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞Ca2+激活K+通道的作用

目的研究血管钠肽(VNP)对大鼠肠系膜动脉血管平滑肌细胞(VSMCs)Ca2+激活K+通道(Kca)的作用及其机制.方法采用全细胞膜片钳技术观察VNP对Kca的影响,以及HS-142-1、8-Br-cGMP和美蓝(MB)在这一过程中的作用.结果①VNP(10-6 mol/L)显著增强Kca(P＜0.05,n=5).②8-Br-CGMP(10-3mol/L)模拟VNP增强Kca的作用(P＜0.05,n=6).③HS-142-1(2×10-5mol/L)或MB(10-5mol/L)完全阻断VNP增加Kca电流密度的作用.结论VNP通过作用于VSMCs的钠尿肽GC耦联受体,升高细胞内的cGMP水平,激活Kca.     

血管平滑肌细胞表型调节机制的研究进展

血管平滑肌细胞（VSMC）的增殖和迁移是动脉粥样硬化斑块形成、高血压和血管再狭窄的共同病理特征,而VSMC表型转化是VSMC增殖和迁移的基础,研究VSMC表型调节的分子机制,对上述疾病的防治具有重要意义。本文对VSMC表型转化的影响因素、信号转导途径和转录因子的研究进展作一综述。     

多巴胺对血管平滑肌细胞钙激活钾通道的影响及其机制

目的：研究多巴胺对血管平滑肌细胞大电流、钙激活钾（ＢＫｃａ）通道的影响及其信息传递机制。方法用膜片钳细胞贴附式技术,记录细胞能液内灌流多巴胺受体激动剂、阻断剂以及第二信使及相关蛋白激酶拮机剂对猪冠状动脉血管平滑肌细胞ＢＫｃａ 爱道活动的影响。结果：多巴胺增加ＢＫｃａ通道活性（Ｐ〈０．０１）,并可被ＣＡ－１受体阻断剂ＳＣＨ２３３９０完全阻断,但不受β２受体阻断剂普藉洛尔的影响。腺苷酸环化酶抑制剂ＳＯ     

血管平滑肌细胞的钙动力学

血管平滑肌细胞外的Ca~(2+)通过多种通道进入细胞内。Ca~(2+)通道的本质是镶嵌在膜脂质双分子层中的糖蛋白,神经介质和药物可影响Ca~(2+)通道的功能。靠近胞膜的肌质网和胞膜内侧面的高亲和性Ca~(2+)结合位点是血管平滑肌细胞内储存和释放Ca~(2+)的主要部位。胞浆[Ca~(2+)]增高后在钙调蛋白的介导下引起血管收缩。高血压等血管性疾病的发生与其平滑肌细胞的钙动力学异常有关。     

Smads转录激活检测系统的建立

目的:构建Smads转录激活检测系统,以研究Smad2、Smad3、Smad4的功能。方法:将Smad2/3/4编码序列以正确读码框与pRC-lac载体中的Lac阻遏蛋白编码序列融合构建重组质粒,将重组质粒与受Lac操纵子调控的荧光素酶报告基因质粒共转染293T细胞,检测荧光素酶活性,其活性的强弱即代表转录活性的强弱。结果:Smad2和Smad3具有较强的依赖于TGF-β1的转录活性;Smad4全长没有检测到转录活性,但其SAD结构域有不依赖于TGF-β1的转录活性,MH2结构域有依赖于TGF-β1的转录活性。结论:构建的Smads转录激活检测系统能有效地用于Smad2、Smad3、Smad4功能的研究。     

血管平滑肌细胞中大电导钙激活钾通道的调节作用

大电导钙激活钾通道(BKCa)广泛分布于血管平滑肌细胞(VSMCs).由通道组成亚基α和调节亚基β构成.BKCa在细胞膜电位以及血管张力方面有重要的调节作用,并且与高血压等心血管类疾病的发生也有密切的关系.本文就BKCa通道的分子结构、生理功能及其与心血管疾病的关系研究进展作一综述.     

血管平滑肌细胞的分化与血管内壁的构建

血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)的发育与血管壁的构建是目前相关领域中的重要学科前沿．国内外同行的工作多集中在血管发育初始阶段内皮细胞及其前体细胞在血管新生中的作用、调节因素及生物学机制．VSMCs参与血管壁早期构建,特别是VSMCs的募集与分化机制已经成为血管新生研究中的一个新领域． 本期发表的《 抑制Rac1蛋白活化阻碍胚胎发育早期血管新生 》(见696～701页)报道了韩雅玲教授及其合作者在这一领域取得的最新研究结果．Rac1是真核细胞内重要的一类信号传递分子,在细胞信号传递过程中发挥分子开关作用．他们采用胚胎干细胞(ESCs)为模型,建立稳定表达持续型Rac1和显性失活型Rac1编码序列的小鼠ESCs并制备胚胎小体,诱导分化后观察其对内皮细胞分化和迁移的影响,发现抑制Rac1可以干扰血管内皮细胞连接成血管网状结构,细胞骨架F-actin排列紊乱,细胞的迁移受到明显抑制,表明Rac1在胚胎早期血管发育过程中与内皮细胞的迁移有关[1]． 近年来,韩雅玲教授及其研究集体在VSMCs发育与血管构建、胚胎干细胞来源的拟胚体血管平滑肌发育与血管新生机制以及胚胎主动脉VSMCs起源等方面开展了研究,取得了一系列有价值的成果[2～11],可能为闭塞性和增生性血管病的发生及防治提供理论依据和候选基因．详见“相关链接”．     

肾上腺髓质素和降钙素基因相关肽受体在血管平滑肌细胞的脱敏—受体活性修饰蛋白的作用

新近研究发现,肾上腺髓质素（adrenomedullin,ADM)和降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide,CGRP)均能与降钙素受体样受体（calcitoni receptor-like receptor,CRLR)结合,其配体特异性由受体活性修饰蛋白（receptor activity-modifying protein RAMP)调控,本工作在离体培养的大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞（vsacular smooth muscle cells,VSMCs)上观察ADM和CGRP受体脱敏现象,以探讨CRLR／RAMP假说在心血管组织方面的意义,用无血清培养基（serum-free medium,SFM)和含有10^-8mol/L ADM,CGRP和肾上腺髓素质前体原N－末端20肽（proadrenomedullin N-terminal 20 peptide PAMP）的SFM培养,再用10^-8mol/L ADM或 CGRP和磷酸二酯酶的抑制剂异丙基次黄苷（isobutyryl methyxanthine,IBMX)与VSMCs进行第二次孵育,然后收集细胞,测定VSMCs cAMP含量。10^-8mol/LADM,CGRP和PAMP单独与VSMCs孵育,VSMCs cAMP含量分别较SFM组高191％（P＜0．01）,385％（P＜0．01）和67％（P＜0．05）,预先用10^-8mol/L ADM ak CGRP与VSMCs孵育可降低随后的CGRP刺激VSMCs产生cAMP,分别较单次CGRP育少44％（P＜0．05）和48％（P＜0．01）,预先用100nmol/L蛋白激酶A（PKA）抑制剂H－89处理VSMCs,可完全阻断ADM和CGRP预处理诱导的第二次CGRP刺激的VSMCs cAMP含量减少,表明VSMCs对CGRP的脱敏过程是通过PKA途径实现的,预先用ADM,CGRP处理VSMCs后,用ADM第二次孵育,细胞内cAMP含量与单次ADM孵育无明显改变,PKA抑制H－89与VSMCs孵育,无论对欠ADM刺激或对ADM和CGRP处理的第二次刺激的cAMP生成均无影响,用PAMP处理VSMCs后,ADM和CGRP的第二次刺激的VSMCs cAMP水平无明显改变（P＞0．05）。结果提示,在离体培养的大鼠VSMCs,ADM epc wsg i euk txgtdmj CGRP受体对预先用ADM和CGRP处理后的激动剂的第二次刺激都脱敏,表明ADM和CGRP的脱敏现象不一致。     

同源异型盒基因对血管平滑肌细胞的调控作用

同源异型盒基因是一类对生物体的生长、发育和分化从时间和空间上进行协调的调控基因。构成血管中膜的血管平滑肌细胞表型具有极大的可塑性。在一些病理性血管重构时,血管平滑肌细胞可发生表型调变,从分化型调变为去分化型,具备增殖和迁移能力。在此过程中,多种同源异型盒基因的表达发挥了重要的调控作用。现就同源异型盒基因与血管平滑肌细胞的表型调变、增殖和迁移的关系等方面的研究进展作一综述。     

慢病毒介导的HTRA1 基因稳定过表达人脑血管平滑肌细胞株的建立

目的:构建并包装针对HTRA1基因以及其1091TC突变基因(HTRA1-Mut)的过表达慢病毒载体,以及建立稳定表达HTRA1及HTRA1-Mut基因的人脑血管平滑肌细胞(HBVSMC)株。方法:采用RT-PCR方法扩增HTRA1及HTRA1-Mut基因片段并将其连接于GV287载体质粒,采用慢病毒包装三质粒系统(GV287/p Helper 1.0/p Helper 2.0)转染293T细胞,收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液并标定病毒滴度,慢病毒感染经培养和鉴定的HBVSMC细胞株。结果:成功构建含HTRA1及HTRA1-Mut基因的慢病毒重组载体,PCR鉴定阳性的克隆进行测序和BLAST比对分析显示与源基因序列一致,并能够有效的感染并在293T细胞中表达。表达载体包装后测定病毒滴度为:2E+8 TU/mL。过表达慢病毒感染后HBVSMC有荧光表达,并且荧光率达80%以上,细胞生长良好传后细胞几乎无死亡现象。结论:成功构建了过表达HTRA1及HTRA1-Mut基因的慢病毒表达载体,得到了较高滴度的病毒悬液,建成了稳定表达HTRA1及HTRA1-Mut基因的HBVSMC细胞株,为进一步探讨HTRA1基因及突变后细胞的功能变化提供了良好的研究工具。     

同型半胱氨酸对大鼠血管平滑肌细胞增殖的作用

血中同型半胱氨酸（ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ,ＨＣＹ）浓度的升高已成为动脉粥样硬化发生的一个独立危险因子．为进一步阐明ＨＣＹ促进血管平滑肌细胞（ｖａｓｃｕｌａｒｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｅｌｓ,ＶＳＭＣｓ）增殖,从而引起动脉粥样硬化发生的机理．本实验采用细胞计数、３Ｈ－ＴｄＲ参入、细胞周期分析、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交方法证明,一定剂量的ＨＣＹ可促进离体培养的ＷＫＹ大鼠血管平滑肌细胞增殖,使其ＤＮＡ合成增加,细胞周期中Ｓ期细胞所占比例增加４３％,并促进ｃ－ｍｙｃ与ｃ－ｆｏｓ原癌基因ｍＲＮＡ表达增加．提示ＨＣＹ可能通过促进ＶＳＭＣｓ增殖而诱发动脉粥样硬化     

血清饥饿可诱导人血管平滑肌细胞再分化

体外培养的分化型血管平滑肌细胞 (vascularsmoothmusclecells ,VSMC)以特异性标志基因表达、长梭形外观及对兴奋剂刺激产生收缩反应为其表型特征 .以血清饥饿法培养处于超汇合 (overconfluence)状态的人VSMC ,观察其分化型标志基因表达活性及其与细胞形态特征和收缩反应性之间的关系 ,探讨细胞生存环境对VSMC基因表达及表型的影响 .研究显示 ,生长至超汇合的VSMC由含血清培养转为血清饥饿后 ,收缩蛋白如SMα肌动蛋白 (SMα actin)、SM2 2α、h1 calponin、肌球蛋白重链 (MHC)SM1和SM2亚型的表达活性明显上调 ,证实血清饥饿诱导的收缩蛋白基因表达和血清应答因子 (serumresponsefactor ,SRF)与CArG顺式元件结合活性的增强有关 .同时 ,血清饥饿还可激活参与VSMC分化调节的转录调控因子SmLIM、Gax和分化相关蛋白HRG 1基因的转录 .随着血清饥饿培养时间的延长 ,VSMC逐渐形成多层、束状、成极性排列的形式 ,对兴奋剂刺激产生的收缩反应明显增强 .结果表明 ,超汇合状态的去分化型VSMC脱离血清刺激后 ,可以再分化成熟并重新获得收缩能力     

PDGF-BB下调血管平滑肌标志物SM22α表达的机制

血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell,VSMC）表型转化是血管重塑性疾病的细胞病理学基础,血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor,PDGF）-BB抑制平滑肌分化标志基因表达、加速其降解,是VSMC表型转化的关键。该研究用PDGF-BB刺激VSMC诱导细胞发生表型转化,利用Western blot和免疫共沉淀等技术,检测PDGF-BB对早期分化相关基因平滑肌22 alpha（smooth muscle 22 alpha,SM22α）磷酸化与泛素化的影响。实验结果显示,PDGF-BB促进VSMC增殖;上调增殖相关蛋白PCNA的表达,下调分化相关蛋白SM22α与SMα-actin的表达;诱导SM22α发生磷酸化和泛素化,而且,该过程与SM22α水平下调具有时相相关性;抑制剂阻断分析证实,ERK和PKC参与介导了PDGF-BB诱导的SM22α磷酸化。以上结果提示,在VSMCs表型转化中,PDGF-BB可能是通过激活ERK-PKC信号通路,促进SM22α的磷酸化和泛素依赖的蛋白质降解。     

Src介导骨桥蛋白诱导的血管平滑肌细胞黏附和迁移过程

为阐明酪氨酸激酶Src在整合素被骨桥蛋白(OPN)激活所触发的细胞黏附和迁移信号途径中所起的作用,应用Src特异性抑制剂PP2阻断Src,观察OPN诱导的血管平滑肌细胞(VSMC)黏附和迁移活性的改变,并利用免疫沉淀检查PP2对整合素下游信号分子黏着斑激酶(FAK)和整合素偶联激酶(ILK)磷酸化及其相互作用的影响。结果显示,PP2可明显抑制OPN诱导的VSMC黏附和伤口愈合(黏附和迁移活性分别为对照组的76.6%和33.8%);OPN可显著诱导FAK磷酸化(磷酸化水平达对照组的1.9倍),促进ILK去磷酸化,并使FAK与ILK的结合减少(降至对照组的46.4%)。10μmol/LPP2可明显抑制OPN诱导的FAK磷酸化、拮抗OPN诱导对ILK的去磷酸化作用、促进FAK与ILK之间的结合。研究结果表明,Src作为OPN-整合素-FAK信号途径中的信号分子,通过影响FAK和ILK的磷酸化以及两者之间的相互作用来调节VSMC的黏附和迁移活性。     

非编码RNA调控血管平滑肌细胞成骨样表型转化的研究进展

分化成熟的血管平滑肌主要功能是收缩血管、调节血管周径及血压等.在高磷、高糖、维生素D₃、炎症等因素的作用下,平滑肌细胞可转分化为成骨样细胞参与血管钙化的形成,诱发心脑血管不良事件.非编码RNA是经基因转录但不翻译为蛋白质的一类RNA总称,其通过调控多种细胞活动来参与机体的生理和病理过程.已有研究表明,非编码RNA可通过调控血管平滑肌细胞成骨样表型转化影响血管钙化的发生、发展.本文从微小RNA、长链非编码RNA、环状RNA几方面综述非编码RNA在血管平滑肌成骨样表型转化中的调节作用,有助于进一步了解血管钙化的分子机制以及发现防治血管钙化的新靶点.     

反义凝血酶受体基因的表达对人ASMC增殖的影响

介入治疗后再狭窄的发生严重降低了该治疗手段的最终疗效．为探讨再狭窄的发生机理、寻找有效的预防手段,利用反义ＲＮＡ技术构建了含有部分反义凝血酶受体（ＡＴＲ）ｃＤＮＡ片段的真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３／ＡＴＲ,并观察了其对培养的人主动脉平滑肌细胞（ＡＳＭＣ）增殖的影响．结果表明ｐｃＤＮＡ３／ＡＴＲ的瞬时转染即能显著抑制人ＡＳＭＣ的３Ｈ－ＴｄＲ参入量,且该作用与导入的ＤＮＡ量呈剂量依赖性．说明部分反义凝血酶受体基因的表达可以抑制ＡＳＭＣ的增殖     

细胞因子对血管平滑肌细胞MMP-2基因表达的诱导及其作用机制研究

为了探讨血管平滑肌细胞 ( VSMC)基质金属蛋白酶 - 2 ( MMP- 2 )基因的表达调控机制 ,利用Northern印迹杂交和 MMP- 2活性酶图分析检查 b FGF、TNF- α和 IL- 1 β对 VSMC MMP- 2基因表达的影响 ,应用电泳迁移率改变实验 ( EMSA)和 CAT分析对其作用机制进行研究 .结果证实 ,3种细胞因子均能显著诱导 MMP- 2基因表达 ,其作用强度依次为 b FGF>TNF-α>IL - 1β.将 MMP-2基因 5′侧翼 - 61 9～ 1 9bp调控序列克隆进携带报告基因的重组质粒 p SV0 - CAT后 ,经转染VSMC及 CAT分析显示 ,在上述 3种细胞因子的作用下 ,该调控序列可激活 cat基因表达 ,三者促进 cat表达的活性与其诱导 VSMC表达 MMP- 2的结果相一致 ;EMSA结果显示 ,被 b FGF和TNF- α刺激的 VSMC中产生与该基因调控区序列特异结合的转录调控因子 .提示细胞因子除可激活 VSMC细胞周期调节基因表达外 ,还可通过诱导 MMP- 2表达而发挥其对细胞外基质代谢的调节作用及参与 VSMC迁移的启动过程 ;细胞因子对 VSMC MMP- 2基因表达的诱导作用是通过促进转录调控因子的合成或活化而实现的 .