原生质体技术选育桃红侧耳优良菌株

研究了桃红侧耳原生质体的制备及再生,并进行了原生质体再生株的筛选工作。实验表明,培养5天的桃红侧耳菌丝体30℃酶解3h原生质体数目可达8.4×107/mL。原生质体再生率在1号再生培养基上最高,为6.9%。再生菌株经筛选后,得到长速显著快于出发菌株的优良菌株H120和H247。经F3代栽培实验证明:H120和H247的生物学效率明显优于出发菌株,且差异极显著。酯酶同工酶分析表明:H120和H247酶谱均发生了变化。     

荧光标记香菇原生质体融合菌株的鉴定

以异硫氰基荧光素（FITC）标记和香菇单核L4菌株的原生质体和未经标记的香菇单核B14菌株的原生质体为亲本,在聚乙二醇（PEG）的促融下进行融合,选取一个带有荧光,另一个不带荧光的原生质体粘合对进行再生培养,通过对利用“锁状联合”筛选得到的菌株进行鉴定后表明：融合菌株为双核菌丝,与双亲产生明显拮抗,其酯酶同工酶及可溶性蛋白质凝胶电泳图谱分析表明融合菌株均与双亲有区别,经琼脂平板快速出菇及出菇实验证明融合菌株出菇早,产量有所提高。     

低温胁迫下草菇甘油‐3‐磷酸酰基转移酶基因表达变化的研究

以草菇低温敏感型V23菌株与耐低温型VH3菌株为试验材料,将二者菌丝体置于冰浴中进行不同时间的低温胁迫处理。首先提取RNA,反转录为cDNA,然后构建含有微管蛋白(tubulin,TUB)基因片段和甘油‐3‐磷酸酰基转移酶(glycerol‐3‐phosphate acyltransferase,GPAT)基因片段的质粒,最终对GPAT基因在低温胁迫不同处理时间下的表达进行定量。结果表明,耐低温型的VH3菌株,在低温处理2h时,GPAT基因相对表达量上升,4h,表达量下降,6h上升,之后逐渐下降。低温敏感型V23菌株,在低温处理2h时,表达量下降,4h,表达量上升,此后逐渐下降;除低温处理4h外,V23菌株的GPAT基因表达量始终低于VH3菌株,初步推测GPAT基因的高表达与草菇的耐低温能力相关。     

草菇冷诱导基因Cor1在低温下表达变化的研究

将草菇菌株V23和耐低温诱变草菇菌株VH3的菌丝在4℃下处理不同时间,分别提取RNA,反转录获得cDNA作为模板,构建含Cor1基因和GPD内标基因片段的质粒作为标准品,采用荧光定量PCR技术研究Cor1基因在低温下的表达变化。结果表明草菇V23菌株的Cor1基因未经低温处理的表达量最大,低温处理后表达量持续下降,在6h达到最低值,8h开始该基因的表达量上升;而VH3菌株Cor1基因低温处理后表达量明显增加,2h达到最大值,4h下降,但6h开始上升,10h又下降。通过推测Cor1基因表达与草菇耐低温特性有相关性,为今后利用草菇自身的抗寒机制进行遗传改造提供理论依据。     

用灭活原生质体融合进行高温香菇育种——Ⅰ.融合产物的选出及其鉴定

用灭活的近裸香菇(Lentinus subnudus Berk.)双核菌株原生质体与香菇[L. edodes(Berk.)Sing.]双核菌株原生质体融合,在35℃的条件下选得融合子。融合频率为0—4.3×10~(-5)。融合子与双亲有明显的拮抗性。融合子的菌丝形态、氨基酸含量,子实体的形态,以及酸性磷酸酶同功酶的测定都与双亲不同。     

银耳原生质体分离与再生条件优化研究*

应用正交设计,研究不同菌株(Tr01、Tr21)、材料(芽孢、菌丝体、子实体)、溶壁酶浓度和酶解温度对原生质体产量的影响。实验结果表明,实验材料对原生质体产量影响最大,以芽孢为材料原生质体产量可达到2.75×107个/ml,而菌丝体和子实体的原生质体产量仅为2.5×106个/ml 和1.0×106个/ml;在35℃下酶解,原生质体产量高;溶壁酶浓度在1%~3%范围内对原生质体产量影响不大;不同菌株原生质体产量差异不显著。本实验还研究了稳渗剂浓度对原生质体再生率的影响,结果表明,0.5 mol/L~0.7 mol/L的KCl 对原生质体再生没有显著差异,再生率最高可达32.3%。     

用灭活原生质体融合进行高温香菇育种I．融合产物的选出及其鉴定

用灭活的近裸香菇(Lentinus subnudus Berk.)双核菌株原生质体与香菇[L. edodes(Berk) Sing.] 双核菌株原生质体融合,在35℃的条件下选得融合子。融合频率为0—4.3x10^{-5。融合子与双亲有明显的拮抗性。融合子的菌丝形态、氨基酸含量,子实体的形态,以及酸性磷酸酶同功酶的测定都与双亲不同。}     

6个杏鲍菇菌株生理生化研究

目的:对收集的6个杏鲍菇菌种菌丝进行生理、生化研究,酯酶同工酶法分析菌株间的差异与关系。方法:利用杏鲍菇菌丝阶段的生长速度测定、诱变剂抗性试验和酯酶同工酶比较,对杏鲍菇菌株营养生长阶段的理化指标进行研究,对酯酶同工酶谱进行相似系数和遗传距离分析,确立各菌株的异同。结果:菌株间菌丝生长速度差异不显著;抗诱变剂实验结果显示,2、5、6号菌株对诱变剂抗性较强;酯酶同工酶分析表明,杏鲍菇6个菌株同工酶酶带存在的差异很大。结论:通过试验表明,所选6株杏鲍菇菌种为各自独立菌株。     

抗A型肉毒毒素人源三结构域抗体的重组设计与表达

以获得的抗A型肉毒毒素人源单链抗体ScFvB17为模板 ,PCR扩增抗体ScFv基因的重链可变区 (VH)和轻链可变区 (Vκ) ,以重链恒定区 1(CH1) 5′端 12个氨基酸的序列作为连接肽 ,构建成三结构域抗体分子 :VH_连接肽_Vκ(VH Vκ)。重组VH Vκ抗体分子在大肠杆菌中得到高效表达 ,其表达量占菌体总蛋白质的 34%以上。表达的蛋白质在菌内形成包含体 ,采用镍柱金属鏊合层析法对该包含体进行纯化 ,得到了纯度高达 95 %的VH Vκ。ELISA等实验结果显示 ,重组设计并制备的三结构域抗体蛋白VH Vκ不但可以特异识别毒素抗原 ,具有与原母本单链抗体ScFv相同的抗原特异性 ,而且具有了更高的相对亲和力和稳定性。     

黑木耳亲本、单核、杂交菌株鉴定的研究

应用荧光核染色技术、酯酶同工酶鉴定技术,对黑木耳亲本双核菌株、原生质体单核菌株和单-单杂交菌株进行筛选鉴定。结果表明:荧光核染色技术可快速有效地鉴定获得菌株的核相,酯酶同工酶技术可准确地区分单核菌株及杂交新菌株的不同核型,研究得到1个酶带差异显著的新菌株。     

谷子耐盐系的几种同工酶的变化及外源ABA对它们的影响

对谷子细胞变异系的过氧化物酶,细胞色素氧化酶和脂酶同工酶的分析表明：耐盐系在无盐胁迫条件下过氧化物酶同工酶的总酶活性高于对照系,其各同工酶带的强度也与对照有明显差异;在ＮａＣｌ迫条件焉耐盐系中个别原有的酶带消失。细胞色素氧化活性与过氧化物酶同工酶的活性变化情况类似,均与对照有明显差异。     

优良酿酒酵母(面包酵母)三倍体菌株的选育*

通过初筛、单倍体分离、诱变、原生质体融合及杂交等育种技术选育出一株具有高生物量、耐高糖、强絮凝性能的优良酿酒酵母(面包酵母)三倍体菌株ZLFH-121,其生物量分别为原始亲株BL68、BL92、L77的1.22、1.33与1.83倍;絮凝性能明显优于原始亲株BL68、BL92。并对其培养条件进行了优化研究,结果表明三倍体菌株ZLFH-121能够很好地利用糖蜜培养基,并表现出良好的絮凝能力。在优化的培养条件下,生物量提高至93.82g/L(湿重),为初始培养条件下的1.30倍。经遗传稳定性分析,证明三倍体菌株ZLFH–121遗传稳定,是一株具有潜在应用价值的优良酿酒酵母(面包酵母)菌株。     

优良酿酒酵母(面包酵母)三倍体菌株的选育

通过初筛、单倍体分离、诱变、原生质体融合及杂交等育种技术选育出一株具有高生物量、耐高糖、强絮凝性能的优良酿酒酵母(面包酵母)三倍体菌株ZLFH-121,其生物量分别为原始亲株BL68、BL92、L77的1.22、1.33与1.83倍;絮凝性能明显优于原始亲株BL68、BL92.并对其培养条件进行了优化研究,结果表明三倍体菌株ZLFH-121能够很好地利用糖蜜培养基,并表现出良好的絮凝能力.在优化的培养条件下,生物量提高至93.82g/L(湿重),为初始培养条件下的1.30倍.经遗传稳定性分析,证明三倍体菌株ZLFH-121遗传稳定,是一株具有潜在应用价值的优良酿酒酵母(面包酵母)菌株.     

重组质粒pHN32对花生根瘤菌固氮的影响

通过三亲本杂交将大豆根瘤菌高效基因工程菌株HN32所携带的增效重组质粒pHN32引入一株快生型花生根瘤菌菌株85-7和另一株慢生型花生根瘤菌菌株co2-5中。花生盆栽结瘤试验结果统计分析表明:p的HN32载体质粒pLAFR1对根瘤菌85-7和co2-5的固氮功能没有影响;pHN32对85-7固氮影响不论在植株干重方面还是在固氮酶活方面统计学上都不显著;而对co2-5则植株干重提高了25.7％,存在极显著差异,固氮酶活尽管提高了51.8％,但统计学上不显著。根瘤中分离的Tc~r根瘤co2-5(pHN32)中的pHN32EcoR1酶切分析表明:pHN32没有发生结构上的变化且固氮增强作用可能由3.7kb外源片段引起。     

利用单克隆抗体对乙型脑炎病毒不同毒株抗原分析的研究

实验发现,应用动物免疫血清(多克隆抗体,PcAb)进行抗原分析时,我国分离到的乙型脑炎病毒SA14、P3、A2和高株的抗原性无明显差别,与从日本分离到的中山株有些差别,但仍被PcAb所中和;而用单克隆抗体(McAb)进行分析,情况就明显不同:SA14和P3株抗原性相似,高株和中山株不能被51-8McAb所中和,A2株则介于两者之间。A2和高顺生株的寡核苷酸指纹图谱分析表明,高株比A2株多两个斑点,但大多数斑点是一样的,证实了上述结果。实验还发现不同毒株的保护效果不同,A2株的免疫效果明显优于高株。     

一株红假单胞菌的分离及生理特性研究

光合细菌在水处理和水生态修复领域应用前景广阔, 对其生理特性研究具有重要价值。从武汉东湖分离得到一株不产氧光合细菌PUF1, 通过对菌落形态、细胞超微结构、特征吸收光谱以及系统发育等分析, 初步确定为红假单胞菌属(Rhodopseudomonas sp.)紫色非硫光合细菌。PUF1细胞呈直的或稍弯曲的杆状, 长3.05—10.06 μm, 直径0.32—0.68 μm, 具有片层膜结构。PUF1培养物呈深紫红色, 主要色素为细菌叶绿素a (Bchl. a)和类胡萝卜素。初始pH 6.0—8.0, 光照强度500—3000 lx, 稳定期细菌生物量无显著差异, 但培养液pH>8.0会显著抑制PUF1最大光量子产量(F_v/F_m)。试验进一步研究了细菌不同生长阶段粗蛋白含量、ATP酶(ATPase)活性及F_v/F_m的变化规律。结果表明, PUF1不同生长阶段其蛋白含量有所差异, 以稳定期为最高(>60%), 而ATPase活性随培养时间的延长而逐渐降低。此外, PUF1光合作用与其生长状态也有一定的关系, 具体表现为细菌生长周期内F_v/F_m变化规律适用单峰高斯模型, 且以对数期F_v/F_m为最高。研究结果可为光合细菌生理生化特性研究提供重要的参考依据。     

Embryonic development in repeat breeder and virgin heifers seven days after insemination

The aim of this study was to compare the development of embryos from repeat breeder heifers with that of embryos from virgin heifers at 7 days after standing heat. A total of 23 repeat breeder heifers (RBH) and 18 virgin heifers (VH) were utilized. The heifers were between 16 and 30 months of age and most of them were of the Swedish Red and White Breed. Two RBH were heterozygous for the $\text{1}\text{29}$ chromosome translocation, one RBH was a trisomy X and all the other heifers had normal karyotypes. All heifers were inseminated with frozen semen from the same bull and all inseminations were performed by the author. The fertility of the bull was above the average for the AI association to which it belonged. Embryos were collected by a non-surgical technique (89) or after slaughter (19). The morphology of the embryos was examined under a phase-contrast microscope and they were classified as being normal (N), morphologically deviating (MD) or degenerated (D). Thirteen embryos from RBH and 15 from VH were examined for total cell numbers after examination of their morphology.There was no significant difference in recovery rates of embryos between RBH (68%) and VH (76%) but independent of collection method the recovery rate of embryos from VH was numerically higher. The fertilization rate was high in both RBH (89%) and VH (97%). Seventyfour percent of the embryos collected from VH were normal ($\text{23}\text{31}$) while only 28% ($\text{11}\text{40}$) of the embryos collected from RBH had a normal morphology. The difference in number of normal embryos recovered from the two groups of heifers was highly significant (P < 0.005). Exclusion of the RBH heifers with deviating karyotype did not influence this difference. However, there was a tendency to a higher incidence of fertilization failure and morphologically deviating embryos in these heifers. The N embryos had significantly higher total cell numbers (P < 0.005) than the MD embryos but there was no significant difference in total cell numbers between N embryos from RBH or VH.The results of this study strongly indicate a higher incidence of abnormal embryos in RBH than in VH. It is likely that these deviations are followed by an increased incidence of early embryonic death.     

Frankia与链霉菌融合子特性的研究

将Frankia菌株CcOl与金色链霉菌GL原生质体融合,得到3株融合子,均具有GL生长快的特性与CcOl的结瘤固氮能力.固体培养时,3株融合子呈现出与GL不同的颜色;且均具有Frankia菌的顶囊形态,以及链霉菌的链状孢子丝结构.与两亲本相同,3株融合子均对大肠杆菌有抗性,其中F4与GL的抗菌谱基本相同.在传10代之后,它们仍具有结瘤与固氮能力.血清学分析表明,F1与F6兼具两亲本的特异抗原,而F4仅具有GL的特异抗原,融合子F1、F6较F4在遗传上更为稳定.     

酯酶同工酶及RAPD技术在香菇杂种优势研究中的应用

采用酯酶同工酶及RAPD技术对香菇3个亲本双核体(苏香、野生46#、野生80#)及其10个单核体、以及它们的10个杂交后代进行了遗传差异和亲缘关系的研究,同时针对亲本单核体酯酶同工酶标记和RAPD标记遗传距离、以及杂交子和亲本单核体RAPD标记遗传距离与香菇产量超亲优势进行了相关性分析。结果表明,酯酶同工酶和RAPD技术都可进行香菇杂种优势群的划分研究,但RAPD标记检测的多态性要远远高于酯酶同工酶标记。相关分析结果表明,亲本单核体酯酶同工酶标记遗传距离与香菇产量超亲优势无相关性,而RAPD标记遗传距离与其存在极显著正相关;杂交子和以苏香为来源的单核体亲本之间RAPD标记遗传距离与香菇产量超亲优势也存在极显著正相关,而杂交子和以野生46#、野生80#为来源的单核体亲本之间RAPD标记遗传距离与其相关不显著。     

酯酶同工酶及RAPD技术在香菇杂种优势研究中的应用*

采用酯酶同工酶及RAPD技术对香菇3个亲本双核体(苏香、野生46#、野生80#)及其10个单核体、以及它们的10个杂交后代进行了遗传差异和亲缘关系的研究,同时针对亲本单核体酯酶同工酶标记和RAPD标记遗传距离、以及杂交子和亲本单核体RAPD标记遗传距离与香菇产量超亲优势进行了相关性分析。结果表明,酯酶同工酶和RAPD技术都可进行香菇杂种优势群的划分研究,但RAPD标记检测的多态性要远远高于酯酶同工酶标记。相关分析结果表明,亲本单核体酯酶同工酶标记遗传距离与香菇产量超亲优势无相关性,而RAPD标记遗传距离与其存在极显著正相关;杂交子和以苏香为来源的单核体亲本之间RAPD标记遗传距离与香菇产量超亲优势也存在极显著正相关,而杂交子和以野生46#、野生80#为来源的单核体亲本之间RAPD标记遗传距离与其相关不显著。