表皮葡萄球菌SarA对atlE、lipA和zinC基因表达调控的研究

表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermids)是一种条件致病菌,SarA(StaphylococcalaccessoryregulatorA)是该菌中一个全局性调控因子,它控制着细胞中许多与毒性相关的基因表达.报道了SarA在转录水平直接调控atlE、lipA和zinC基因的表达.RT-PCR和lacZ报告基因的分析结果显示,在表皮葡萄球菌ATCC35984中,SarA对atlE(自溶酶基因)表达起负调控作用,而对lipA(脂肪酶基因)和zinC(膜相关锌金属蛋白酶基因)的表达则有正调控作用.生物信息学分析表明,SarA控制atlE,lipA和zinC3种基因表达可能是通过与被调控基因上游的特定DNA序列的结合来实现的,该DNA结合区保守并富含AT碱基.根据已报道的金黄色葡萄球菌中SarA的结合位点序列,利用Omiga软件分析并推测了SarA结合atlE,lipA和zinC的可能区域.基于SarA是一种多功能的毒素相关调控因子,结果提示,SarA能调控众多因子,可以作为防治表皮葡萄球菌感染的一个药物筛选靶点.     

金黄色葡萄球菌tst-1基因敲除菌株的构建

抽提金黄色葡萄球菌834菌株的基因组DNA,PCR克隆扩增tst-1及tst-1的上、下游基因,通过将tst-1上、下游基因分别重组到载体质粒pAULA中,形成同源重组质粒pAULA Δtst-1,将pAULA-Δtst-1电转入细菌内,进行同源重组,以PCR、Western blot鉴定tst-1基因敲除菌株无tst-1基因片段,且无TSST-1蛋白表达,表明已成功构建金黄色葡萄球菌tst-1基因的敲除菌株。     

骨保护素(Opg)基因敲除小鼠发生高转换型骨质疏松和动脉钙化

骨质疏松以及动脉钙化均是危害极大的临床常见病变，骨保护素 (OPG) 可能是联系两者的分子之一. 构建替换型载体pXpPNT-OPG，利用同源重组，将编码前3个蛋白质结构域的小鼠Opg基因组第二外显子序列剔除掉. 通过胚胎干细胞 (ES) 基因打靶获得了正确重组的ES细胞克隆，ES细胞显微注射后获得嵌合体小鼠，交配传代获得杂合子和纯合子小鼠. RT-PCR和蛋白质印迹实验结果显示，纯合子小鼠没有Opg基因的表达. 纯合子小鼠骨量丢失明显，骨生物力学指标明显下降，发生严重的骨质疏松，此外，还有50%以上的纯合子小鼠在早期出现动脉中层钙化. 小鼠破骨功能亢进，与此同时，成熟成骨细胞数量增加，矿化功能强于野生型. Opg基因缺失小鼠骨中钙和磷大量流失，而血清中水平没有变化，这提示钙磷代谢异常不是OPG缺失导致动脉钙化的原因. 对建立的Opg基因敲除小鼠模型进一步深入的研究，将有助于说明动脉钙化和骨质疏松症相互联系的分子机制，为防治骨质疏松症和动脉钙化的并发提供理论基础支持.     

生鲜猪肉中金黄色葡萄球菌的耐药特征、毒力基因及agr分型

为研究市售生鲜猪肉中金黄色葡萄球菌的污染状况,分两个季节从雅安市雨城区采集351份生鲜猪肉样本,采用K-B法检测分离株的耐药性,PCR技术对分离株的mecA基因、传统肠毒素基因、中毒休克综合征毒素基因、杀白细胞毒素基因、溶血素基因和脱皮毒素基因进行分析和agr分型。结果表明,夏、冬季总体检出率分别为15.28%和28.69%;分离株对青霉素、四环素、红霉素的耐受性最强;5种传统肠毒素的检出率为80%,sea、sed的检出率均为4.11%,seb、sec的检出率均为12.33%;中毒休克综合征毒素基因的检出率为15.07%,溶血毒素基因检出率最高,杀白细胞毒素基因和脱皮毒素基因检出率最低。分离株以agrⅠ型为主（50.68%）,未检测出agrⅣ 。综上表明,该地区生鲜猪肉中金黄色葡萄球菌的污染较为严重,分离株呈多重耐药谱,毒力基因分布多样,部分菌株致病性较强,具有的潜在危险应引起重视。     

3种外源诱导剂预处理对甜瓜抗病特征及其Fom 2和CHT基因表达的影响

该研究选用水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、Ca~(2+)、无菌水(对照)作为外源预处理诱导剂,以抗、感枯萎病甜瓜品种为材料,分别于诱导预处理2d后接种甜瓜枯萎菌,并于接种5、7、9d时观察发病情况,进行病情调查;在接种后1、3、5、7、9d取甜瓜叶片,分析抗病甜瓜(MR-1)和感病甜瓜(M1-15)叶片中甜瓜抗枯萎病基因(Fom-2)、几丁质酶基因(CHT)的表达变化,以探寻提高防治甜瓜枯萎病菌侵染的技术途径。结果显示:(1)外源MeJA和SA预处理接种后2品种的病情指数显著低于对照,但Ca~(2+)处理后的病情指数与对照无显著差异。(2)经外源诱导预处理接种后,MR-1和M1-15品种叶片的Fom-2和CHT基因均出现差异表达,但Ca~(2+)诱导其上调表达的效果微弱。(3)经SA、MeJA诱导预处理接种后,2品种叶片的Fom-2和CHT基因表达总体均显著高于对照;Fom-2基因的表达抗病甜瓜MR-1分别在接种后5d、7d时达到峰值,而感病甜瓜M1-15则均在接种9d时达到峰值;CHT基因的表达抗病甜瓜MR-1则均在接种后7d时达到峰值,而感病甜瓜M1-15分别在接种后7d、9d时达到峰值。(4)Ca~(2+)处理对抗、感甜瓜叶片的Fom-2和CHT基因的表达均无显著影响。(5)相关分析表明,经SA、MeJA诱导预处理接种后,甜瓜枯萎病病情指数与Fom-2和CHT基因表达量有显著的相关性;而Ca~(2+)处理效果不显著。研究表明:SA、MeJA通过诱导Fom-2、CHT基因上调表达,进而使甜瓜的抗病性提高,而Ca~(2+)处理对两基因表达和甜瓜抗病性均无显著影响。     

致病性葡萄球菌cfr基因介导的多重耐药机制研究进展

葡萄球菌是临床常见致病菌及食源性致病菌,可在食品原料加工、包装及运输过程中污染食品,引起人体多种严重感染,其耐药性的不断增强对公共卫生安全产生了重大的威胁。葡萄球菌中cfr (chloramphenicol-florfenicol resistance)基因编码的甲基转移酶,可引起细菌核糖体RNA的甲基化,从而阻碍或减弱多种化学结构不同的抗生素与肽基转移酶活性中心(peptidyl transferase center,PTC)的结合,导致葡萄球菌多重耐药表型的出现。噁唑烷酮类药物−利奈唑胺是继万古霉素后治疗耐药革兰氏阳性菌所致感染的最后一道防线,cfr基因的出现大大加速了利奈唑胺耐药性的传播。cfr基因广泛分布于多种致病性葡萄球菌中,cfr基因与各类型可转移元件(质粒、转座子和整合相关元件等)密切关联的遗传环境是其广泛传播的结构基础。在cfr基因水平传播的过程中,食源性致病葡萄球菌作为中间者扮演着重要的角色。本文就近年来国内外对致病性葡萄球菌中cfr基因的分布状况、耐药机制、遗传环境、传播机制等进行综述,以期为防控致病性葡萄球菌的传播提供参考,以遏制多重耐药菌的进一步传播。     

葡萄球菌生物被膜的基因调控机制研究进展

摘要:细菌的耐药性问题是目前医学临床面临的严峻问题,其中细菌生物被膜的形成是引起细菌持续性感染的主要致病机制之一。细菌生物被膜的形成过程十分复杂,受多种因子和多基因的共同调控,且不同的因子和基因在生物被膜形成的不同阶段所起的作用不同。本文重点对引起院内感染的主要致病菌葡萄球菌的生物被膜形成的基因调控机制,以及药物抑制葡萄球菌生物被膜的研究现状进行综述,旨在为解决医学临床中存在的细菌感染,研制抗生物被膜药物和疫苗等提供参考。     

鹅源新城疫病毒NP、P和L基因的克隆与P基因的表达鉴定

将鹅源新城疫病毒的NP、P和L基因通过RT PCR方法从尿囊液中扩增后分别克隆进pGEM-Teasy载体 ,再分别亚克隆到真核表达载体pCI neo上 ,通过酶切、PCR和测序验证克隆正确。利用P基因开放性阅读框 (ORF)上靠近终止密码上游的AgeI位点 ,将报告基因绿色荧光蛋白 (GFP)基因克隆进P基因真核表达重组质粒 ,分别转染COS-1细胞和CEF细胞 ,在倒置荧光显微镜下可见到绿色荧光 ,表明GFP基因已得到表达 ,由此证明P相似文献   

表皮葡萄球菌生物被膜对红霉素渗透性的研究

为探讨表皮葡萄球菌生物被膜对红霉素的渗透性, 我们采用生物被膜抗生素渗透模型检测Staphylcoccus epidermidis 1457、1457-msrA和临床分离株S68生物被膜不同时间点红霉素的渗透率, 并用吖啶橙染色激光共聚焦显微镜观察生物被膜内细菌RNA/DNA的相对含量; 扫描电子显微镜观察膜内细菌的密度。红霉素作用36 h后, 1457、1457-msrA、S68的渗透率分别为0.93, 0.55和 0.4; 1457渗透地较快, 8 h后渗透率即达到0.58, 而1457msrA和S68相对较为缓慢, 24 h后分别为0.499和0.31; 吖啶橙染色可见红霉素作用下膜内菌RNA和DNA的相对比例减小, 生长速率下降; 扫描电子显微镜观察可见生物被膜红霉素作用后空气面的细菌数与琼脂面相比均较少, 细胞碎片相对较多, 而对照组(无抗生素作用)琼脂面和空气面的细菌密度和分布较均匀。可见红霉素可渗透入表葡菌生物被膜, 但不能完全杀死膜内细菌; 膜内细菌在生物被膜环境中生长速率下降, 有助于降低细菌对红霉素的敏感性。     

依赖PrfA转录调控的单核细胞增生李斯特菌毒力基因inlC启动子结构特点的初步研究

为了研究单核细胞增生李斯特菌毒力基因启动子的结构特点与转录调控因子PrfA蛋白之间的关系,应用PCR定点突变和重组PCR技术缺失了该菌毒力基因inlC启动子上可能与PrfA蛋白结合以及诱发转录起始相关的碱基序列,构建了一系列突变启动子与lacZ报告基因融合表达质粒, 使lacZ基因的表达置于inlC突变启动子下,并分别电转化单核细胞增生李斯特菌野生株P14、PrfA蛋白高表达突变株P14a 和prfA基因等位缺失突变株A42中,检测相应的β-半乳糖苷酶活性。结果表明：位于inlC启动子转录起始点下游22bp 处的一段17bp的类似PrfA蛋白结合序列TTAACAGCGTTTGTTAA并没有增强和抑制PrfA转录调控活性的功能;甚至将其改造成“完美的” PrfA蛋白结合序列TTAACATTTGTTAA后,也不影响inlC依赖于PrfA的转录活性地表达;但是,如果缺失inlC启动子上原始的PrfA蛋白结合序列,则使inlC依赖于PrfA的转录活性完全丧失;另外,单核细胞增生李斯特菌毒力基因inlC和plcA 依赖于PrfA的转录活性的表达也与启动子上PrfA蛋白结合区(PrfA-box)距离-10区的碱基个数有关:最适为22或23bp,长于23bp或短于22bp的突变启动子的依赖PrfA的转录活性大大降低,甚至没有活性。说明除PrfA蛋白结合序列外,受PrfA调控的毒力基因启动子上还可能存在其它尚未阐明的结构和序列影响PrfA蛋白的结合以及启动转录表达。     

苦参碱对表皮葡萄球菌生物被膜作用初探

通过中药有效成分苦参碱对表皮葡萄球菌生物被膜抑制作用的研究,为表皮葡萄球菌生物被膜引起的相关感染提供新的治疗途径。利用XTT减低法评价苦参碱对表皮葡萄球菌初始粘附及生物被膜内细菌代谢的影响,镜下观察该药对表皮葡萄球菌生物被膜的形态学影响。结果表明:苦参碱对表皮葡萄球菌生物被膜菌的SMIC50和SMIC80分别为62.5 mg/L和500 mg/L;1 000 mg/L浓度的苦参碱对表皮葡萄球菌早期粘附有抑制作用;250 mg/L浓度的苦参碱对表皮葡萄球菌生物被膜的形态有显著影响。因此可见,苦参碱对表皮葡萄球菌生物被膜的形成与粘附均有抑制作用。     

表皮葡萄球菌对皮肤健康的作用研究进展

人体皮肤表面定居着多种微生物,这些微生物与皮肤健康密切相关。表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)是正常人群皮肤表面微生物的主要成员之一,对维持皮肤的健康状态发挥着重要作用。在正常生理环境下,表皮葡萄球菌通过抗菌肽参与皮肤固有免疫,其细胞壁成分脂磷壁酸有助于适应性免疫系统的发育和启动,从而调节皮肤免疫过程。通过分泌鞘磷脂酶,表皮葡萄球菌可以对皮肤上的神经酰胺进行补充,同时可以增强角质形成细胞间的紧密连接,进而维护皮肤屏障稳态。表皮葡萄球菌可以和多种细菌进行交流,在皮肤抗菌防御中发挥着良性的作用,并且可以促进皮肤的再上皮化,加速伤口修复。本文归纳总结了表皮葡萄球菌在维持健康皮肤方面的最新研究结果及认识,有助于深入了解其作为潜在益生菌充分发挥对皮肤的有益影响,为皮肤病的治疗及化妆品的研发提供借鉴。     

表皮葡萄球菌vraSR-srrAB突变株的构建及生物学表型

【背景】形成生物被膜是表皮葡萄球菌的主要致病方式,双组分系统(two-component regulatory system, TCS) VraSR和SrrAB与细菌的生长、生物被膜形成等多种生物学表型密切相关。敲除表皮葡萄球菌SE1457 vraSR后细胞壁变薄,生物被膜形成量降低,而敲除srrAB后生长进入稳定期的时间延长,生物被膜形成量也降低,且TCS-VraSR和SrrAB均通过ica途径调控表皮葡萄球菌生物被膜的形成。ica操作子是表皮葡萄球菌生物被膜形成的重要调节元件,由icaADBC这4个开放阅读框(openreadingframe,ORF)和1个转录方向相反的icaR组成,IcaR是icaADBC的抑制子。【目的】探索TCS-VraSR和SrrAB协同调控表皮葡萄球菌生长及生物被膜形成中的作用,为防控表皮葡萄球菌引起的持续性感染奠定基础。【方法】构建pKOR1-ΔvraSR重组质粒,经大肠杆菌DC10B修饰后转入ΔsrrAB,通过同源重组在ΔsrrAB突变株的基础上进一步敲除vraSR基因,疑似ΔvraSR-srrAB突变株经PCR、RT-PCR和测序验证。检测Δvra...     

嗜肺军团菌mip/ctxB融合基因体外表达与动物免疫试验的免疫原性研究

ＰＣＲ扩增嗜肺军团菌mip基因和霍乱弧菌ctxB基因,克隆入载体pcDNA3.1(+),重组子经限制性酶切分析、PCR、序列分析鉴定正确后,命名为pcDNA3.1-mip/ctxB.脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-mip、pcDNA3.1-mip/ctxB转染NIH3T3细胞,用免疫荧光法和蛋白质印迹鉴定瞬时表达和稳定表达产物,结果发现：重组质粒成功转入细胞并获得短暂表达,稳定转染细胞分别在24 ku和35 ku处检测到阳性杂交信号.将pcDNA3.1-mip、pcDNA3.1-mip/ctxB作为DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,检测免疫小鼠体内抗原特异性抗体水平、脾淋巴细胞增殖活性、IFN-γ产生水平、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性等体液免疫和细胞免疫反应的指标,评价疫苗的免疫原性.结果发现：各实验组均检测到免疫原性,pcDNA3.1-mip/ctxB免疫组的免疫原性高于pcDNA3.1-mip免疫组,有显著性差异(P＜0.01).研究结果为mip/ctxB融合基因DNA疫苗的研制提供了初步的实验依据.     

银白色葡萄球菌的发现、分布与致病性

银白色葡萄球菌(Staphylococcus argenteus)是金黄色葡萄球菌(S. aureus)的近缘新种,于2015年正式被鉴定、命名。在此之前,银白色葡萄球菌一直被认为是金黄色葡萄球菌种内的一个远源支系。该物种绝大多数菌株分离自人体,基因组上含有大量与金黄色葡萄球菌同源的毒力基因,可导致与金黄色葡萄球菌类似的临床感染和食物中毒症状。因为与人类健康相关,银白色葡萄球菌受到了越来越多的关注,目前已在20多个国家被报道。但是由于出现较晚,与金黄色葡萄球菌难以区分,银白色葡萄球菌的全球分布状况、原始生境和传播过程尚不清楚。本文从发现过程、分布、致病性和鉴定方法等方面综述了银白色葡萄球菌的最新研究进展。     

龙眼DlPSY基因在根和叶中的表达及其生物信息学分析

为研究八氢番茄红素合成酶(phytoene synthase)基因在龙眼类胡萝卜素合成途径中的作用机制,该文从龙眼转录组数据中筛选获得一个PSY基因,命名为DlPSY,采用生物信息学方法对龙眼PSY蛋白的一级结构、理化性质、信号肽、跨膜结构、亚细胞定位、亲疏水性、蛋白质二级结构、蛋白质三级结构、卷曲螺旋、蛋白质结合位点、系统进化树、蛋白质互作等进行分析和预测,并同时运用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术对DlPSY基因在龙眼根和叶中的差异表达进行分析。结果表明:龙眼DlPSY基因长度为1 260 bp,编码420个氨基酸;生物信息学预测DlPSY蛋白具有Isoprenoid Biosyn C1超家族结构,含有信号肽,为分泌性蛋白,无跨膜结构,是一种可溶性亲水蛋白,定位于膜外; DlPSY蛋白的二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成,具有卷曲螺旋。Ramachandran评估结果表明应用SWISS-MODEL构建的蛋白质三级结构模型可靠,其配体结合位点为344Phe和347Lys。RT-qPCR分析结果表明DlPSY基因在龙眼根和叶中均有表达,叶中表达量高于其在根中的表达量。该研究结果为下一步采用遗传学方法提高龙眼中类胡萝卜素的含量奠定理论基础。     

万古霉素敏感性下降金黄色葡萄球菌(VISA/hVISA)的研究进展

万古霉素敏感性下降的金黄色葡萄球菌(VISA/hV ISA)日益增多,已经成为公共健康的重要威胁。来自临床或实验室的VISA/hV ISA菌株表现出一些共同特征,如细胞壁增厚,自溶活性降低,毒力减弱,醋酸盐代谢异常。金葡菌从VSSA到VISA/hV ISA的转化是一个逐步演变的过程,VISA中一些调控基因的变异,特别是如wal KR、graRS、vra SR、rpo B、rpo C、rpo D、agr、msrR、fdh2、sle1等基因连续的变异与金葡菌对万古霉素的耐药性相关。VISA/hV ISA中相应基因的变异也是VISA/hV ISA对宿主毒力减弱,持续定殖及对宿主适应性改变的遗传基础。为了预防和控制VISA/hI VSA感染,应全面了解其生物学特性,开发简便有效的检验方法,探索制定灵活的治疗策略,达到有效防治的目的。     

Characterization of pACK4, a mobilizable plasmid from Staphylococcus simulans biovar staphylolyticus

Staphylococcus simulans biovar staphylolyticus, the lysostaphin-producing organism, contains five plasmids designated pACK1–pACK5. pACK4 was found to be relaxable and to share sequence similarity with a number of well-characterized mobilizable plasmids from other staphylococci. All mobilizable staphylococcal plasmids characterized to date mediate resistance to various antibiotics, but pACK4 is unique because it contains no recognizable antibiotic resistance genes. pACK4 was found to contain an origin of transfer (oriT) region that shares inverted repeat regions and the same nic site as several other mobilizable staphylococcal plasmids. The presence of this conserved oriT region suggested that pACK4 might be mobilized in the presence of a conjugative plasmid. Filter mating studies revealed that pACK4 was mobilized by the conjugative plasmid pGO1. In addition, pACK4 was found to be virtually identical to the recently described plasmid pVGA from Staphylococcus aureus, except that pVGA contains an additional region (vgaA) that confers resistance to pleuromutilin, streptogramin A, and lincosamide. The high sequence similarity among pACK4, pVGA, and several previously described mobilizable staphylococcal plasmids suggests a common origin for these plasmids.