蛹虫草液体培养条件优化及有效成分含量分析

为优化蛹虫草菌的液体培养条件,对蛹虫草菌丝体进行液体摇瓶培养。以干菌丝体得率为指标,对影响发酵产量的重要因子设计正交试验,得出最佳培养条件。在最优条件下扩大培养,检测此时菌丝体中虫草素及虫草多糖含量。结果表明:蛹虫草菌丝体液体发酵的最适条件为:接种量10 % (v/v) ,发酵初始pH7 0 ,发酵温度2 7℃,发酵时间96h。扩大培养后,测得菌丝体中虫草素的含量为5 1 785mg/10 0g ,虫草精多糖含量为1 92g/10 0g。     

肺炎克雷伯氏菌荚膜多糖表达量评价指标的建立及发酵条件优化

建立了特异性强的肺炎克雷伯氏菌荚膜多糖全菌ELISA检测方法,检测结果与多糖表达量相关性好;以全菌ELISA值结合菌数为评价指标,对影响荚膜多糖表达的培养基组成及发酵条件进行了优化,优化后的摇瓶培养条件下发酵液活性和生物量分别比优化前提高72.7和33倍,并经7L罐放大实验,绘制发酵动力学曲线,为肺炎克雷伯氏菌荚膜多糖进一步开发打下基础。     

透明颤菌vgb基因在产核黄素B.subtilis中的整合表达研究

目的:将透明颤菌血红蛋白vgb基因应用于核黄素的工业化生产。方法:以枯草芽孢杆菌整合载体pAmyE构建了vgb基因的整合表达载体pAudV,采用化学转化法将vgb基因整合到枯草芽孢杆菌GJ08的染色体上,并通过发酵摇瓶实验检测核黄素的产量。结果:得到产核黄素枯草芽孢杆菌GJ09,摇瓶试验结果表明,在限氧条件下核黄素的产量分别提高了5.23%和3.42%。结论:透明颤菌血红蛋白vgb基因能够促进核黄素产量的提高,可以应用于核黄素的工业化生产中。     

鸟苷发酵条件的优化研究

以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)TA208为供试菌株,运用单因素实验方法进行了摇瓶条件下发酵培养基以及发酵条件的优化研究,在最优发酵条件下鸟苷产量达到19．79g／L,比基本培养条件提高32．37％。     

牛IL-2基因工程菌表达条件的研究

对重组牛IL 2基因工程大肠杆菌的摇瓶表达条件进行了研究。实验结果表明 :采用DH5α作为宿主菌 ,接种后 30℃培养 3h升温 4 2℃诱导表达 3～ 4h ,目的蛋白 (分子量 14ku左右 )表达量可达细胞总蛋白的 2 0 %～ 30 %。实验同时还确定了摇瓶发酵装液量 ,Amp浓度等关键因素。     

大肠杆菌工程菌高密度发酵生产L-抗坏血酸-2-葡糖苷酶

为提高大肠杆菌基因工程菌E.coli-p ET21a高密度培养生产L-抗坏血酸-2-葡糖苷酶产量,采用摇瓶培养的方法,通过考察培养液菌体量和酶产量,筛选适用于E.coli-p ET21a液体深层发酵的培养基。50 L发酵罐采用适用于工业化大生产的搅拌、供氧、p H控制和过程补料方式,进行液体深层发酵放大培养,大幅度提高酶产量。通过优化发酵过程控制p H和诱导温度,发酵液酶活提高至88 U/m L,达到摇瓶培养的10.1倍。研究结果对大肠杆菌基因工程菌高密度培养,高效表达生物酶有重要的参考价值。     

重组巴氏毕赤酵母高密度发酵表达rHSA

对基因工程菌Pichiapastoris的摇瓶发酵条件进行了试验 ,并根据摇瓶发酵的优化结果进行了补料分批高密度发酵。在摇瓶发酵时 ,甲醇诱导基因工程菌P .pastoris表达重组人血清白蛋白的发酵周期为 96h ;甲醇的最佳诱导浓度为 1 0g L ;发酵pH范围为 5 72～ 6 5 9;在摇瓶培养时 ,随着接种量的增加 ,虽然目的蛋白表达量缓慢增加 ,但单位细胞光密度的蛋白产率却明显下降 ,符合y =1 2 941x- 0 50 59方程 (线性相关系数r=0 9789) ,其限制性因子很可能为溶氧。在分批发酵 ,接种量为 1 0 %且种子细胞光密度 (OD60 0 )为 2 0左右时 ,细胞生长的延迟期为 2 1 1h左右 ,细胞生长光密度与培养时间的关系模型为 :y =0 7841e0 .2 3 19t(线性相关系数r=0 .993 6 ) ;在补料发酵时细胞干重浓度可达到 1 1 5g L— 1 6 0g L ,在 1 2 0h重组人血清白蛋白表达量最大达到 3 6g L。     

一株虫草头孢菌深层培养条件的研究

采用摇瓶培养的方法,以菌丝体收率为指标,通过单因子实验和正交实验确定了虫草头孢菌最佳培养条件和最佳发酵培养基配方。在相同条件下,优化培养基比原培养基的菌丝体收率提高了31.75%。     

谷氨酸棒状杆菌合成5-氨基乙酰丙酸的途径构建与发酵优化

5-氨基乙酰丙酸(5-amino levulinic acid,ALA)是生物体内天然存在的一种非蛋白质氨基酸,在农业和医药等领域应用广泛。为了在谷氨酸棒状杆菌中建立ALA碳四合成途径并优化其发酵体系,首先在谷氨酸棒状杆菌中过表达沼泽红假单胞菌来源的ALA合成酶(ALAS),建立高效的ALA碳四合成途径,然后从不同发酵培养基的比较、诱导剂和底物甘氨酸的浓度以及初始接种量等不同方面对ALA摇瓶发酵工艺进行了优化。结果显示,过表达Hem A的13032/p ZWA1菌株ALA产量达到1.41 g/L,是对照菌株的67.14倍。ALA的最优摇瓶发酵条件为以酵母粉为氮源的M9培养基,采用5%的接种量0.1 mmol/L IPTG进行Hem A的诱导表达,体系中甘氨酸的浓度要控制在4 g/L,摇瓶中ALA产量可达到3.28 g/L,比优化前提高了132.62%。采用发酵优化的条件,在5 L发酵罐的放大发酵中ALA产量可达10.08 g/L,这是现有报道中谷氨酸棒状杆菌一步发酵合成ALA的最高产量。     

氮源对L-苏氨酸发酵的影响

以L-苏氨酸生产菌TRFC为供试菌株,研究了氮源对L-苏氨酸发酵的产量和糖酸转化率的影响。首先通过摇瓶实验确定发酵的最佳无机氮源和有机氮源分别为硫酸铵和酵母粉,进一步利用10L罐补料分批发酵确定硫酸铵和酵母粉的最佳用量,继续优化培养条件,采用发酵中后期流加硫酸铵和糖氨混合补料等措施,L-苏氨酸产量得到进一步的提高。在最优发酵条件下,通过10L罐补料分批发酵36h,产酸可达118.9g/L,糖酸转化率为47.6%。     

重组巴斯德毕赤酵母产米根霉α-淀粉酶发酵条件的研究

为了提高重组菌的淀粉酶表达量,以可分泌表达米根霉α-淀粉酶的甲醇快速利用型巴斯德毕赤酵母重组菌为基础,采用摇瓶发酵方式对影响重组菌表达淀粉酶的多个因素进行了研究和优化。摇瓶发酵条件确定为:温度为30℃,pH值为6.0,接种量为2.0(OD_(600)),甲醇补加方式采用前72 h发酵时间内每隔12h添加至终浓度为1.0%,72 h以后每隔24 h添加至终浓度为1.0%,在此条件下获得的淀粉酶最高表达量为47.5 U/mL,且在无机盐培养基中和有机氮源培养基中获得的淀粉酶发酵单位相当。以摇瓶发酵数据为基础确定15 L发酵罐放大实验条件为:无机盐培养基,温度为30℃,pH值为6.0,接种量为10%,甲醇流加方式采用DO—Start法控制,在此发酵条件下获得的淀粉酶表达量为440 U/mL,约为摇瓶发酵方式获得的淀粉酶表达量的9倍。     

毕赤酵母高密度表达重组猪胰岛素前体的研究

对摇瓶和50L罐上的重组菌毕赤酵母(Pichia pastoris)表达猪胰岛素前体(PIP)的发酵过程进行了研究。摇瓶发酵中,最佳诱导周期为60 h左右,诱导期甲醇的最佳加入量为每日2．0%～2．5%。50L发酵过程分为批发酵、补料和诱导表达3个阶段。生长期(批发酵和补料阶段)细胞干重与培养时间的关系可用模型y= 0．6525e~(0．1909t)来描述。在批发酵阶段和补料阶段,流加的氨水和甘油几乎全部用来合成菌体和维持,没有其他副产物产生。诱导表达阶段流加的氨水和甲醇分别约有80%和70%被菌体利用。将摇瓶与发酵罐的实验结果进行了比较,发现摇瓶发酵的限制因子很可能是溶氧,而罐发酵的限制因子为碳源,因此,将摇瓶实验的结果放大到发酵罐时调整了控制策略,加大了甲醇的补料速率,最终PIP浓度达到1．72g/L。     

嗜热棉毛菌木糖苷酶Xyl43基因优化及其在毕赤酵母中高效表达

【目的】通过外源表达手段构建重组毕赤酵母实现木糖苷酶的高效表达。【方法】基于毕赤酵母密码子偏好性优化嗜热棉毛菌β-木糖苷酶(Xyl43)基因密码子,将其导入毕赤酵母GS115中实现分泌表达,并对重组木糖苷酶酶学性质进行分析。通过单因素实验优化高产菌株的摇瓶发酵条件,并在5 L发酵罐中进行扩大培养。【结果】Xyl43基因优化后的序列中222个碱基发生改变,G+C含量由52.8%降低到44.6%,序列一致性为78.17%;将构建的表达载体p PIC9K-Opt Xyl43电击转入毕赤酵母中,利用平板初筛和摇瓶复筛获得一株高效表达重组菌(命名为P.pastoris GS115-Xyl43);其所产重组木糖苷酶大小为51.5 k D,动力学参数Km为2.93 mmol/L、Vmax为157.9μmol/(min·mg),最适反应温度55°C,最适p H 7.0,在p H 6.0-9.5条件下具有良好的稳定性;摇瓶优化结果表明:培养基初始p H 6.0、甲醇补加浓度1.0%、培养温度28°C、摇床转速250 r/min为最佳产酶条件,在此条件下发酵144 h胞外酶活达到42 U/m L(蛋白含量0.54 g/L);5 L发酵罐放大培养,发酵156 h(甲醇诱导96 h),木糖苷酶酶活为222.2 U/m L,蛋白含量2.36 g/L,较摇瓶提高了4.3倍。【结论】木糖苷酶在毕赤酵母中实现了高效表达,具有较好的工业化应用前景。     

聚苹果酸的发酵培养条件优化

对出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)BS02发酵制备生物降解材料聚苹果酸的摇瓶发酵条件进行研究,确定了出芽短梗霉发酵制备聚苹果酸的摇瓶培养条件。由实验结果可知:优化的培养基(g/L)为葡萄糖120.0、丁二酸铵3.0、丁二酸2.0、MnSO4.H2O 0.005、MgSO4.7H2O 0.1,另外每升发酵液加玉米浆0.5 mL,CaCO350 g/L,培养条件为pH4.0～4.5、24℃、500 mL摇瓶装发酵液100 mL、摇床转速220 r/min,在最优条件下,聚苹果酸产量可达到30 g/L。     

产鼠李糖脂菌株种子培养条件和C、N源的优化

对自行筛选的3个可利用废弃油脂进行发酵生产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌菌株进行评价,并进行了种子培养条件和摇瓶发酵部分条件的优化。种子培养优化实验表明,当培养基pH 6～8,培养温度为30 ℃时最利于菌体生长。菌株均具有一定的耐盐性,在5%的盐度下生长未受到明显抑制,因此在沿海地区采用盐水或海水发酵具有较广阔的应用前景。通过排油圈、表面张力、苯酚-H2SO4比色法比较了这3个菌株的表面活性剂表面活性的大小,以表现较好的Z41进行了摇瓶发酵条件的优化。单因素实验表明,发酵较优条件为发酵温度30 ℃,接种量5%。在此基础上,通过正交试验对Z41菌株发酵培养基中的C、N源进行了研究,实验结果表明,在考虑因素间交互作用和发酵成本的情况下,最佳C源为3%炸货油,最佳N源为3.5 g/L尿素。在此发酵条件下,糖脂产量较高13.024 g/L,且成本较低。     

紫外诱变原生质体选育D-核糖生产菌株

以D-核糖产生菌枯草芽孢杆(Bacillus subtilis)B941为出发菌株,采用紫外诱变原生质体的方法,获得了4株可以在含有6．0％D-核糖的培养基上生长的D-核糖高产菌株,其摇瓶发酵产糖达55．0g／L左右。通过摇瓶发酵试验,研究了D-核糖高产菌株Buvp-24的遗传稳定性。研究结果表明,经多次传代,菌株Buvp-24的发酵产糖能力及对发酵产物D-核糖的耐受性没有改变,有望应用于工业生产中。     

产灵菌红素沙雷氏菌的诱变育种

通过紫外线—氯化锂复合处理灵菌红素生产菌沙雷氏菌 (Serratiasp )W 0 2 0 6,用高浓度葡萄糖为碳源的选择性平板定向筛选抗葡萄糖分解代谢物阻遏的高产株 ,筛得高产突变株B 2 0 ,相对于原始菌株 ,B 2 0摇瓶发酵灵菌红素产量提高了 3倍 ,5L反应器上的产量提高了 63 %。     

重组昆虫病原细菌Cip蛋白基因工程菌发酵条件的初步研究

昆虫病原细菌产生两种胞内晶体蛋白CipA和CipB,为新型的生物农药——昆虫病原线虫提供必需的营养。在已构建原核表达载体pET-15b-cipA和pET-15b-cipB的基础上,研究了这两种重组载体在不同宿主菌中的表达情况,重组菌的生长特性,摇瓶培养时表达重组Cip蛋白工程菌的发酵条件。结果显示:以E.coli BL21(DE3)为宿主菌,在LB培养基中培养至OD600为0.8～1.0时,1 mmol/L IPTG诱导8 h,CipA和CipB的表达量可达30.9%和32.6%,重组质粒具有良好的分离稳定性和结构稳定性。     

响应面法优化维生素K_2(MK-7)发酵条件

对实验室保藏的一株维生素K2(MK-7)高产菌的摇瓶发酵条件进行优化,结果表明菌体在静置培养状态下比在摇瓶培养状态下能够合成更多的维生素K2;同时发现玉米粉经过高温淀粉酶液化之后非常适合作为合成维生素K2的碳源。最后利用响应面法对发酵培养基中主要因素的最适宜水平及其交互作用进行了研究与探讨,优化后维生素K2产量由7.09 mg·L-1提高到了67.22mg·L-1,高于文献报道值。     

一株寡营养细菌胞外多糖的摇瓶发酵研究

从新疆的寡营养环境——古尔班通古特沙漠中分离到一株寡营养细菌Azotobacter sp．(1～15mg碳/L培养基),通过进行Azotobacter sp．菌的单因子优化培养基的试验、摇瓶培养工艺条件的优化试验(培养温度、培养时间、初始pH值、溶氧量),确定了菌种生长与营养需求等主要因子与胞外多糖产量、粘度的关系,结果表明,摇瓶发酵的最适宜条件为:以蔗糖为碳源,碳酸钙含量为2g/L,初始pH值为7左右,种龄72～84h,磷酸二氢钾、硫酸镁的含量分别为0．3g/L、0．1g/L,接种体积分数15%,于37℃摇瓶培养72h,250mL摇瓶装液量为50mL,在适宜条件下粘多糖的产量最大可达到1145．94μg/mL,粘性可达9200 mPa·s。