双向凝胶电泳缺陷胶及其原因

双向凝胶电泳是蛋白质组学研究中的关键技术之一,涉及较多的实验步骤和试剂,常出现缺陷胶而导致实验失败。从数千张电泳胶图中选取了21张典型的缺陷胶图,对它们进行了归类和总结,分析和讨论了形成缺陷胶的多种原因,提出了实验改进的方法和注意事项。     

小鼠黑质双向凝胶电泳技术的优化

为了优化小鼠黑质双向凝胶电泳(2-DE)技术,比较了不同样品预处理方法、不同胶条和不同上样量对凝胶电泳结果的影响。研究发现,两种样品预处理方法均可顺利升至最高等电聚焦(IEF)电压(10000V)。与Clean-upkit法相比,TAC/丙酮沉淀法预处理后蛋白得率较低,同时丢失了样品中的部分中、小分子蛋白质。pH3-10L胶条中蛋白点主要分布在中间区域;pH3-10NL胶条对中间区域的蛋白点的分离有所改善;pH4-7胶条中蛋白点分布均匀,横条纹较少。80μg上样量的图谱背景干净,但点数最少(411);180μg上样量的图谱蛋白点较多(883),且圆润、清晰,背景干净,分辨率高;300μg上样量的图谱蛋白点虽然最多(904),但背景较深,部分蛋白点融合,横条纹也较多。研究表明,对于小鼠黑质蛋白质,使用Clean-upkit法对样品进行预处理,选取pH4-7的胶条,采用180μg的上样量能获得背景干净、分辨率高的双向电泳图谱,为帕金森病的生物标志物和药物靶点的研究打下了基础。     

双向凝胶电泳技术在前列腺癌研究中的应用

双向凝胶电泳是目前蛋白质组学研究最常用的技术之一,近年来,在前列腺癌的研究中也有很多实际应用,取得了一些成果。本文按照双向电泳的样品来源,分类综述了目前基于双向电泳的蛋白质组学技术在寻找前列腺癌肿瘤标记物、药物靶标和阐明其发生发展机理研究中的应用。     

应激心肌细胞蛋白质组双向凝胶电泳分析

采用双向凝胶电泳技术和计算机辅助的图像分析方法 ,对去甲肾上腺素诱导的应激心肌细胞与正常心肌细胞蛋白质进行分离和比较分析 .正常心肌细胞可分离 12 32± 5 6个蛋白点 ,蛋白点匹配率为 83 3%± 1 0 %.有 11种蛋白质在NE应激后发生了明显和稳定的质和量的改变 (P <0 0 5 ) ,其中 6种 (Mr pI :4 9 7kD 7 8,38 3kD 5 9,37 1kD 6 6 ,2 9 3kD 7 4 ,18 7kD 6 1,18 5kD 7 7)在应激后表达降低 ,4种 (Mr pI:4 7 6kD 5 5 ,31 9kD 4 4 ,2 6 6kD 4 6 ,33 2kD 8 1)在应激后表达增高 ,1种 (Mr pI:19 4kD 6 9)只在应激后发生表达 .这些差异表达的蛋白质可能参与了心血管应激反应乃至应激损伤发生的过程 .     

双向凝胶电泳比较三种常用蛋白质提取方法

组织(或细胞)的蛋白质提取效率直接影响蛋白质双向凝胶电泳(2-DE)的分辨率.为探索建立适用于人乳腺癌细胞株MCF-7蛋白质提取的最佳条件,比较目前在双向凝胶电泳中常用的3种蛋白质提取方法对MCF-7细胞总蛋白的提取效率.MCF-7细胞经培养后,分别采用M-PER试剂、标准裂解液或含硫脲裂解液提取其总蛋白质,然后进行双向凝胶电泳,并根据凝胶上蛋白质斑点的丰度和分布特点判断所得双向电泳图谱的质量,以确定MCF-7细胞蛋白质提取的相对最佳方法.结果显示,M-PER试剂法得到的图谱分辨率较低,蛋白质主要集中分布在分子量15~70kD,pH4.7~6.3的范围内;标准裂解液法得到的图谱分辨率有所提高,蛋白质分布比M-PER试剂法得到的图谱广;硫脲裂解液法得到的图谱是三者中分辨率最高的,尤其是高丰度蛋白和高分子量蛋白分离效果比前两者好.结果表明,在3种常用的蛋白质提取方法中,硫脲裂解液对细胞蛋白质的溶解性最佳,相对更适合于提取MCF-7细胞的蛋白质,并与双向凝胶电泳条件更兼容.     

定量蛋白质组学分析方法及应用

蛋白质组学经历了近10年的发展,现在已经初具规模。但是由于它是动态地观察生物体不断变化的所有蛋白质,所以技术难度非常之大。为使研究简化并更具针对性,人们着重进行比较蛋白质组学的研究。为了具体量化这些蛋白质的变化产生了定量蛋白质组学,近几年各种标记技术的进步使得该学科得以迅猛发展。     

水稻蛋白质组双向电泳优化流程及方法

双向电泳是分析蛋白质混合物的一种有力手段, 已在蛋白质组研究中得到广泛应用。水稻(Oryza sativa)作为重要的粮食作物, 对其蛋白质组学研究开展较早。但由于技术复杂, 对实验操作要求高, 初学的研究者很难在较短的时间内掌握该实验技术。该文介绍了水稻研究中适合多个组织的双向电泳实验方法和优化流程。该优化流程能使新的研究者逐步优化实验条件, 更快更好地完成双向电泳实验。同时详细介绍了实验关键环节的操作方法。     

水稻蛋白质组双向电泳优化流程及方法

双向电泳是分析蛋白质混合物的一种有力手段,已在蛋白质组研究中得到广泛应用。水稻（Oryzasativa）作为重要的粮食作物,对其蛋白质组学研究开展较早。但由于技术复杂,对实验操作要求高,初学的研究者很难在较短的时间内掌握该实验技术。该文介绍了水稻研究中适合多个组织的双向电泳实验方法和优化流程。该优化流程能使新的研究者逐步优化实验条件,更快更好地完成双向电泳实验。同时详细介绍了实验关键环节的操作方法。     

红色红曲菌蛋白质组双向凝胶电泳体系的建立

红曲菌是一种具有较高食用和药用价值的丝状真菌,能够产生红曲色素、莫纳可林K等多种生理活性物质。通过分析比较培养基、蛋白质裂解液组成以及水化上样条件对双向电泳结果的影响,建立了红色红曲菌蛋白质组的双向凝胶电泳体系,为从蛋白质水平研究红曲菌及其次级代谢产物的生物合成提供依据。结果表明：用YES培养基培养红色红曲菌6 d,TCA 丙酮法提取菌体总蛋白质,蛋白质裂解液组分为8mol/L尿素,2mol/L硫脲,4 % CHAPS,1 % DTT和2 % Bio-lyte,可获得蛋白质样点数量多,清晰度高的双向电泳图像,为进一步研究红曲菌蛋白质组奠定了基础。     

双向凝胶电泳技术及其应用

介绍了双向电泳的基本原理、操作过程及其在动植物和医学中的应用。同时对当前双向电泳技术面临的挑战和发展前景进行了介绍。     

用于双向凝胶电泳分析的奶牛乳清蛋白样品制备方法的比较

为建立适用于双向凝胶电泳分析的奶牛乳清蛋白的制备方法,分别比较了直接裂解法、三氯乙酸-丙酮法,Trizol法和2-D clean up kit法对奶牛乳清蛋白提取效率和双向凝胶电泳图谱的影响.用2-D Quant Kit试剂盒测定蛋白浓度,分别用十二烷基磺酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳和双向凝胶电泳进行奶牛乳清蛋白的分离.蛋白定量结果表明,2-D clean up kit法产率最高,直接裂解法、三氯乙酸-丙酮法次之,trizol法产率最低;十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明,2- D clean up kit法提取的蛋白质量最高;双向电泳图谱分析表明,2-D clean up kit法得到的蛋白图谱与另外3种方法相比,检测到的蛋白点最多,图谱背景清晰,分辨率最高.结果提示,2-D clean-up法相对最适合于双向凝胶电泳分析奶牛乳清蛋白样品的制备,尤其对一些低丰度高分子量蛋白的分离效果较为明显.     

蛋白质双向电泳图像分析

随着人类基因组计划的接近完成,蛋白质组（proteome）研究成为新的热点.其中高分辨率的双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE）技术使对组织或细胞的整个蛋白质组的综合分析成为可能.近年来这一技术有了很大的改进和提高,特别是图像分析系统,算法更为先进,功能日益强大,操作也更简便,为大规模研究提供了良好的工具.使用新一代的2D图像分析系统,对离体培养的雪旺氏细胞的蛋白质样品双向电泳结果进行了初步分析,探讨了在图像扫描、点检测、背景消除、匹配、结果报告和数据分析各步中的技术问题,并报告了进行2D图像分析的体会.     

Protein changes in macrophages induced by plasma from rats exposed to 35 GHz millimeter waves

A macrophage assay and proteomic screening were used to investigate the biological activity of soluble factors in the plasma of millimeter wave‐exposed rats. NR8383 rat macrophages were incubated for 24 h with 10% plasma from male Sprague–Dawley rats that had been exposed to sham conditions, or exposed to 42 °C environmental heat or 35 GHz millimeter waves at 75 mW/cm² until core temperature reached 41.0 °C. Two‐dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, image analysis, and Western blotting were used to analyze approximately 600 protein spots in the cell lysates for changes in protein abundance and levels of 3‐nitrotyrosine, a marker of macrophage stimulation. Proteins of interest were identified using peptide mass fingerprinting. Compared to plasma from sham‐exposed rats, plasma from environmental heat‐ or millimeter wave‐exposed rats increased the expression of 11 proteins, and levels of 3‐nitrotyrosine in seven proteins, in the NR8383 cells. These altered proteins are associated with inflammation, oxidative stress, and energy metabolism. Findings of this study indicate both environmental heat and 35 GHz millimeter wave exposure elicit the release of macrophage‐activating mediators into the plasma of rats. Bioelectromagnetics 31:656–663, 2010. © 2010 Wiley‐Liss, Inc.     

基于双向电泳技术的里氏木霉高效组成型启动子筛选

获得强启动子是建立高效表达系统的基础。通过蛋白质双向电泳技术从蛋白质水平全面筛选里氏木霉的组成型启动子,获得了3个表达效率较高的启动子,分别是葡萄糖/核糖醇脱氢酶基因的启动子（grdh）、微体蛋白基因的启动子（hex1）和FAD相关蛋白基因的启动子（flo）。通过木聚糖酶Ⅱ（XYN2）的高效同源表达对这些启动子的功能进行了验证,为在里氏木霉中进行同源或异源蛋白的组成型表达提供了有效的工具。     

一种提高固定pH梯度（IPG）凝胶双向电泳的重复性、分辨率和通量的方法

在蛋白质组学研究中 ,双向聚丙烯酰胺凝胶电泳是现行蛋白质分离的最重要的方法之一。实验发展了一种提高固定pH梯度 (IPG)凝胶双向电泳的重复性、分辨率和通量的方法 :在一块SDS 聚丙烯酰胺凝胶上同时进行多块固定pH梯度(IPG)凝胶 (Multi stripsononeSDSgel,MSOG)电泳。用此方法比较了人肝癌细胞、不同生长状态的人肝癌细胞、3T3细胞的蛋白质以及同一个样品在不同大小的第二向凝胶系统 (大型和中型凝胶 )的双向电泳图谱。结果表明 ,同一样品在 13cmIPGStrip双向电泳可分离 2 0 0 0以上蛋白质点且图谱蛋白质点的匹配率可超过 95 %以上。同时又可以最大程度地降低凝胶背景对蛋白质点比较分析的干扰 ,从而提高了双向电泳分离蛋白质的分辨率和通量。这些优点都有助于差异蛋白质组学特别是细胞器差异蛋白质组学研究的自动化。     

双向电泳分析鸢尾绿白嵌合叶片的蛋白质

利用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳对鸢尾（Iris japonica)绿白嵌合叶片的蛋白质进行分离,并初步鉴定了蛋白质的相对分子量和等电点。每个电泳图谱共检测到400余个蛋白点,其中至少13个蛋白的表达变化明显;结果表明,嵌合叶片的绿色与白色叶组织具有明显不同的蛋白质双向电泳图谱。与数据库中拟南芥双向电泳图谱相比较,发现Rubisco大亚基,标记为W和T蛋白的表达变化与产生绿白嵌合叶片的表型密切相关。