大豆单染色体的显微分离及体外扩增

采用玻璃针分离法,通过显微操作器成功地分离到大豆（ＧｌｙｃｉｎｅｍａｘＬ．）单染色体。将分离到的两条大豆染色体分别放入两个０．５ｍＬＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管中,经Ｓａｕ３Ａ酶切,并在染色体ＤＮＡ片段两端加上Ｓａｕ３Ａ人工接头后,进行两轮ＰＣＲ扩增,得到０．３～３ｋｂ之间的ＤＮＡ片段。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交表明,这些大豆单染色体扩增片段与大豆基因组ＤＮＡ之间有同源性,从而证明两条单染色体ＤＮＡ确实已被成功地扩增了,同时表明两条不同的大豆单染色体扩增产物存在一定的差异。在常规的倒置显微镜下对小型染色体进行了显微分离,为小型单染色体ＤＮＡ的体外扩增及微克隆奠定了基础。     

茯苓单孢子分离技术

真菌的单孢子分离和培养是菌种纯化、定向培育和细胞杂交的重要手段。单孢子分离方法很多,有的方法比较准确和现代化,但设备要求较高,如使用显微操作器,价钱昂贵且尚需进口。而另一些方法如稀释法、滴定法等较简单,但其准确性常因使用者的习惯和熟练程度而异。我们在茯苓单孢子培养和交配试验中,采用的微型玻璃毛细管针吸孢法,具有分离单孢     

用Skerman显微操作技术分离硫酸盐还原菌

本文介绍使用Skerman显微操作技术在非厌气条件下对硫酸盐还原菌进行单细胞分离,这一操作可以代替繁琐费时的常规单菌落分离方法。     

用直接注射法生产转基因鱼

本文报道了对鲤鱼、鲫鱼受精卵不加任何去膜处理,用显微操作器把外源基因直接注射到卵核附近,构建转基因鱼的方法。本法操作方便,孵化条件简单,成活率高。斑点杂交和Southern Blot杂交结果表明,外源基因的整合率与其它方法构建的转基因鱼的外源基因的整合率相近。从1988年至今,本组运用这个方法生产转基因鲤鱼、鲫鱼一万余尾。     

王百合单条染色体和染色体片段的分离

本研究利用显微操作器建立了简单、有效地分离王百合单条染色体和染色体片段并将其放人Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中的方法。与前人方法相比,主要改进之处在于：（１）制片简单。不需要对盖片硅化处理,压片在截片和盖片之间进行。（２）所需设备简单。不需要倒置显微嵕担恍枰胍牵⑾覆Ａд肟稍诰凭莆⒒鹕侠啤＃ǎ常┎僮骷虻ィ矢摺Ｔ诒瓯旧霞訊一滴无菌水即可将染色体挑出。在２ｈ之内,用微细玻璃针可挑出６～１０条王百合染色体     

小麦染色体的显微激光分离

探讨了应用氩离子激光进行植物染色体显微激光切割,分离的可行性,应用该技术对普通小麦的体细胞及特定染色体（１Ｂ染色体）实施切割,分离,并且以分离到的单细胞核或单条染色体为模板进行了ＰＣＲ ＤＮＡ扩增。该技术比玻璃针切割分离染色体技术,具有操作方便,容易掌握,且可对整个细胞核进行分离等优点,有利于促进染色体显微操作技术的普及应用。同时,探讨了染色体显微操作技术在细胞遗传学及分子生物学研究领域的应用前景     

染色体显微操作技术及其应用

染色体显微操作技术及其应用何聪芬马有志辛志勇（中国农业科学院作物育种栽培研究所北京１０００８１）染色体显微操作技术起始于８０年代初,是一项特异性基因克隆技术［１］,其优点是能够根据研究者的需要分离任意一条染色体或特定染色体片段,快速高效地建立相应的ＤＮＡ文库。迄今已开发出三种染色体或染色体片段的分离技术,即流式细胞分类器法,微细玻璃针切割法和激光显微切割法［２］,本文将综述这三种方法的原理...     

黄鳝单条染色体的显微分离及特异性检测

建立了显微分离黄鳝单条染色体及检测其特异性的方法;在Olympus倒置显微镜下用毛细玻璃微针手工分离黄鳝减数分裂Ⅰ终变期3号染色体,将期DNA作模板进行DOP-PCR扩增后,分别以α^-32P-dCTP和Biotin-11-dUTP标记的单条染色体DNAPCR扩增产物及Biotin-11-dUTP标记的大豆18SrRNA基因作探针进行Southern杂交,FISH和Dot杂交来检测其特异性,结果表明：（1）减数分裂Ⅰ终变期染色体标本是进行染色体显微操作的理想材料;（2）DOP-PCR扩增产物片段在200-1000bp之间,平均600bp左右;（3）杂交结果显示,本研究所获得的单条染色体是黄鳝3号染色体;（4）与显微操作仪和微激光分离相比较。该方法不需要昂贵仪器,在常规实验室即可操作,具有广泛的普及应用意义。     

通过原生质体融合改建酵母细胞的研究——Ⅴ.酿酒酵母与糖化酵母种间融合杂种的遗传分析

HU-KDP-185菌株是由单倍体糖化酵母与二倍体椭圆酿酒酵母经原生质体融合而获得的种间三倍体融合杂种。遗传分析表明,该杂种在遗传上是稳定的;在一般情况下,其产孢率为13.54%;但在特定预培养条件下,可提高到38.61%,即使在只含0.98%醋酸钾和0.186%KCl的HU-Li简易产孢培养基上,其产孢率也可达33.23%。用显微操作器解剖了202个4孢子子囊,得到376个四分子单孢株,其孢子成活率达46.53%;四分子的交配型出现A、a、AA、aa4种类型,没有发现有AAa交配型存在。四分子发酵可溶性淀粉的能力为1:2(发酵:不发酵);而遗传标记的分离比为野生型:营养缺陷型(包括hisˉ,argˉ,hisˉargˉ)约为1:1。     

激光微束对哺乳动物早期胚胎选择性破坏后存活的研究

应用显微操作技术,证实哺乳动物早期胚胎至少在发育到8-细胞期时,每个卵裂球仍然是全能的,即还没有开始分化。近年来有Tarkowski等的卵裂球分离实验;Kelly的卵裂球重聚合实验以及最近Willadsen的羊胚卵裂球分离实验等。激光是一种比较新型的光源,主要产生单色的平行的相干辐射光束,具有相当人的能量密度。根据激光的特性已经把通过光学显微镜聚焦产生的激光微束来代替常规的显微外科技术。Daniel等曾使用激光显微照射技术选择性地破坏2-细胞兔胚的特定的卵裂球,证明这种操作不会影响另一未损伤卵裂球的继续分裂和发育。说明这一技术有助于克服显微操作所产生的机械损伤的缺点。     

黑麦1R染色体的显微分离、体外扩增及扩增产物的鉴定

借助Leitz显微操作器,在国产倒置显微镜下(400×)用玻璃针对处于有丝分裂中期的黑麦根尖细胞中的1R染色体成功地进行了分离。分离出来的1R染色体转入0.5 ml的Eppendorf管中,用蛋白酶K处理,把DNA释放出来;经Sau3A酶切,再与人工合成的Sau3A连接头连接;以连接头的一条链的核苷酸顺序片段为引物对DNA酶切片段进行了PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳显示扩增产物的长度大约为300~1000 bp。以生物素分别标记的黑麦总体DNA和小麦rDNA为探针进行斑点杂交,结果表明PCR扩增产物确实来源于黑麦的1R染色体DNA。这个方法为构建黑麦1R染色体亚基因组文库和筛选1R染色体特异性探针奠定了基础。     

精子介导转基因动物的制备

近年来 ,通过显微注射DNA至孵育的卵母细胞原核或外源基因转染后的胚胎干细胞进行转基因动物的生产已取得了令人瞩目的成就。在过去的 1 0年中 ,以精子作载体制备转基因哺乳动物或脊椎动物也取得了一些不同程度的进展。这些技术主要包括 :直接将外源DNA与精子共孵育至成熟 ;提取分离的精子DNA或进行预处理至精子发育成熟 ;以及在辅助受精前分离精子细胞等。此外 ,一些显微注射技术 ,如在输精管内进行体内直接转染雄性生殖细胞 ;将体内转染的雄性生殖细胞植入已分离的雄性生殖细胞 ,再显微注射至受体的睾丸 ,这些技术也逐渐成熟起来。研究表明 ,通过体内、体外转染外源DNA的显微操作技术只需将雄性受体与野生型雌性交配就可产生出转基因的后代个体 ,同时也避免了辅助受精和胚胎操作带来的机械损伤 ,因此具有一定的优势。本文综述了精子介导转基因 (SMGT)技术的发展历程、研究现状及前沿进展。     

黑麦1R染色体的显微分离与回收

建立了利用显微操作技术分离植物单个染色体的方法。以黑麦(Secale cereale L.)为材料,以其标准染色体组型图为依据,识别出黑麦含抗病基因的1R染色体。经显微操作,将单条1R染色体放入Ep-pendorf管中。研究表明,用α-溴奈饱和液对细胞进行预处理,可快速鉴别出黑麦1R染色体。采用去壁低渗制片技术,可明显地改善显微分离单染色体的条件。     

人腔前卵泡分离及培养

采用机械吹打、胶原酶消化、镜下显微解剖及胶原酶消化加镜下显微解剖4种卵泡提取方式并相互对比.将分离得到的腔前卵泡在含FSH0.5IU/mL、1.0IU/mL和2.0IU/mL的培养液中培养,检测其E2分泌量.与机械吹打、胶原酶消化相比,胶原酶消化加镜下显微解剖法不仅提取卵泡多(P＜0.01),而且可以得到原始、初级、次级各级卵泡.但操作时间较长(P＜0.01).得到的腔前卵泡在FSH为0.5IU/mL、1.0IU/mL和2.01IU/mL的培养液中培养,所分泌的E2分别为10.86pg±4.11pg、31.55pg±9.34pg和43.82pg±18.76pg,较之对照组的4.99pg±2.09pg有显著性差异(P＜0.01),E2的分泌量与FSH浓度呈剂量依赖性关系.FSH有促进腔前卵泡分泌E2的作用.     

胚胎操作和显微操作的几点改进

改进的胚胎吸管包括外径为2.5mm的单根玻璃细管和连接支持管两大部分.与传统的巴氏管比较,具有容易制作,可使有关操作更为简便有效和经济适用的优点.通过配置上的优化,并利用国产倒置显微镜所装配的显微操作仪,与全套进口的显微操作仪相比,可节约三分之二以上的费用,实践证明这样的配置的显微操作仪完全可以满足有关显微操作的需要.同时,引入了一种新的操作系统--空气系统.本文还介绍了改进的显微操作小室和电融合槽的制作方法.     

简单介绍两种简便的微量凝胶电泳方法

在不同材料的组蛋白和碱性蛋白的研究中,摸索了二种简便的微量电泳方法。一、微量圆盘电泳采用0.1毫升或0.2毫升的移液管作电泳管。把一根移液管截成几段长度相等(每段长46毫米),同一根移液管截成的电泳管标以相同号数,以示内径相同。灌胶时,不需显微操作器等一些较为复杂的设备.取二根玻璃管,玻璃管的一头拉成小于电泳管内径的毛细管,另一头套上橡皮滴头,     

由喉内向外缝合针输送器械

本文介绍了一种适用于显微喉镜下操作,不需作喉裂开术,由喉内向外缝针的输送器械(见图1 a、b)及其结构和使用方法,该器械可用来治疗声带疤痕粘连和双侧性喉神经麻痹所致的喉狭窄。(一)声带疤痕粘连治疗在显微喉镜下     

体外培养哺乳类细胞去核的研究

为了研究细胞核和质这两个主要部分的各自独立又相互协调的作用,人们常设想把细胞核从细胞质中分离出来,或者用再重新加以组合的方法来进行此项研究。这样就需要一种在生理条件下进行核质分离的技术。自从1939年Commandon等最先成功地进行去核和核移植实验以来,一直是倚仗显微操作术进行这样的工作。这种去核方法所能进行的工作是非常有限的。     

黑斑蛙骨髓细胞染色体标本制备的新方法

染色体标本制备是黑斑蛙分子细胞遗传学研究的基础。为了简化操作程序,缩短实验周期,建立了黑斑蛙染色体制备的一种新方法——骨髓细胞体外短时培养与秋水仙素同步处理法。该方法操作简便,重复性较好,可在较短时间里制备出分裂相较多且形态良好的蛙染色体标本,适用于核型分析、染色体荧光原位杂交、染色体显微分离和单染色体文库构建等多个方面的研究。     

激光显微切割分离细胞的微量RNA质量鉴定体系的 建立

摘要: 探索一套激光显微切割(Laser capture microdissection, LCM)分离细胞后获得的微量RNA质量鉴定标准操作流程。选取3个低温保存的胃癌旁组织样本, 冰冻切片进行甲酚紫染色和病理学检查, 利用激光显微切割技术分离非癌上皮细胞, 提取RNA并以Agilent 2100生物分析仪鉴定RNA的纯度和完整性。同时, 选择高、中、低3种不同表达丰度的6个基因(EF1A, ACTB, GAPHD, B2M, MED1, CK20), 在每个基因的5′和3′端设计引物, RT-PCR扩增。以3个培养细胞制备的高质量RNA和3个有降解的胃癌旁组织样本RNA作对照, RT-PCR扩增结果与Agilent 2100生物分析仪的结果高度一致。结果显示冻存组织进行冰冻切片结合病理学检查后, LCM获取细胞提取微量RNA采用RT-PCR进行质量鉴定是一种操作简单的稳定方法, 可以作为肿瘤基因组研究的有效和常规方法。