黑麦草(Lolium perenne L.)内生真菌的检测、分离及鉴定*

从多年生黑麦草(LoliumperenneL.)5个品种———SR4000、Pinnacle、Topgun、CalypsoⅡ、Justus中分离出61个菌株。次培养后,所得形态稳定的菌株可分为4个形态群,依据其形态特征及APPCR的结果,确定其中的57个分离菌株为Neotyphodiumlolii。     

Paenibacillus massiliensis T7固氮基因簇nifBHDKENX的克隆、序列分析及铵和氧对nifB启动子的调控

Paenibacillus massiliensis T7是我室从北京郊区分离的一株革兰氏阳性、产芽孢的固氮菌. 根据GenBank中已发表的多种固氮生物nifH基因序列, 在其保守区域设计一对简并引物, PCR扩增获得324 bp的nifH片段. 用地高辛标记该片段为探针, 对EcoRⅠ和PstⅠ消化的P. massiliensis T7染色体DNA进行Southern杂交, 结果DNA/EcoRⅠ杂交道1.1 kb和9 kb处, DNA/PstⅠ杂交道1.3 kb和8 kb处分别有两条杂交带, 从而初步判断nifH可能有两个拷贝. 在324 bp nifH片段的基础上, 采用反向PCR扩增的方法, 获得了purD和nifBHDKENX基因. 在nifB的上游有一个类似σ⁵⁴型启动子的保守序列, 在该启动子上游有一个类似激活蛋白NifA结合位点. 分析表明, nifBHDKENX可能组成一个转录单元, 共用nifB上游的启动子. 将nifB启动子与报告基因lacZ相融合, 构建成表达载体pnifB-LacZ, 并转化到P. massiliensis T7中, 研究铵和氧对该启动子的表达调控. 结果表明, 在无氧条件下, 铵浓度为0%时, β-半乳糖苷酶的活性最高, 随着铵浓度的增加, 酶活性并没有明显的下降过程, 即使铵浓度达80 mmol/L时, 酶活也相当于无铵时的73.12%, 说明铵对nifB启动子有微弱的抑制作用, 而铵浓度一定, 氧浓度3%时, β-半乳糖苷酶活性最高, 提高氧浓度则酶活性开始下降, 当氧浓度高于20%时, β-半乳糖苷酶活性仅几个Miller单位, 说明氧对nifB启动子有明显的抑制作用.     

海枣曲霉β-葡萄糖苷酶的提纯与性质

通过聚乙二醇6000一磷酸钾缓冲液双相分离,Sephadex G—100凝胶过滤、DEAE-Sephadcx A-50及SE-Se phadex C-50离子交换柱层析等提纯步骤,从海枣曲霉(Aspe rgillutphoenlcis)麦麸培养物抽提液中提纯到凝胶电泳均一的β-葡萄糖苷酶。该酶的最适pH5．0,最适温度60℃,在pH 4．0--7．5之间及55℃以下稳定。Ag+及Hg2+对该酶有强烈的抑制作用。用SDS-凝胶电泳法及梯度凝胶电泳法测得该酶均分子量分别为118000及195000薄层凝胶等电聚焦法测得其等电点为pH 3.95。     

一个鼻咽癌家系中存在COX7B2基因的低频变异

在中国南方鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)高发地区, 遗传易感性在鼻咽癌发病中起重要作用, 在4p11-4p14区域存在一个鼻咽癌易感位点. 采用PCR-直接测序法对位于该区域内的细胞色素C氧化酶亚单位Ⅶb2 (COX7B2)基因进行单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)筛查, 对发现的变异在家系患者、散发病例和正常人群中进行分型分析, 探讨COX7B2基因变异是否与鼻咽癌有关. 在COX7B2基因中共发现5个新的SNP位点, 分别位于上游启动子区(−158101G>T和−157322G>A)、第2内含子区域(−109602A>G)、第3外显子区(78T>A)和3′-非翻译区(354T>A). 位于第3外显子编码区的78T>A变异导致CAT26CAA (His26Gln)改变, 在31号鼻咽癌家系中与患者易感单体连锁, 但不存在于其他家系患者和散发病人中. 在广东地区和华东地区对照个体中78T>A变异的频率分别为0.45%(2/448)和0.26%(1/384), 在白人、黑人样本中没有发现该变异. 蛋白质序列比对显示COX7B2亚基26His位点在人、大猩猩、黑猩猩、长臂猿、大鼠和小鼠中十分保守. 上述结果提示COX7B2基因26His是一个保守的位点, 低频的His26Gln变异可能与31号家系的鼻咽癌高发有关.     

原生质体融合技术选育耐热性β-淀粉酶产生菌

从土壤中分离到两株产β-淀粉酶芽孢杆菌菌株,经紫外线、丫-射线,氯化锂、亚硝基胍等诱变和筛选,得到β-淀粉酶高产菌和耐热性β-淀粉酶产生菌各一株。将两菌进行原生质体融合,获得兼有两亲株遗传特性的融合子wg6。从菌落形态和产酶特性等证实此融合子系两亲株融台所得的杂交子代。W96菌株产酶能力介于两亲株之间,酶的热稳定性较高,60℃处理15min,酶活力仍达93．2％。此菌株还可产生少量茁霉多糖酶(一种支链淀粉酶)．与所产生的β-淀粉酶协同作用,使淀粉水解率达到80．6％,因而有较高的应用价值。     

斜卧青霉纤维素酶系的酶学研究

使用包括疏水相互作用色谱在内的多种色谱分离技术,对斜卧青霉的纤维素酶进行了系统的分离纯化。共分得一种β一葡萄糖苷酶,六种β一葡聚糖纤维二糖水解酶和八种内切β一葡聚糖酶组分。其中六种分别进一步分离为二到六个亚组分。多数达到电泳纯。系统地研究了各组分的分子组成和酶学特征。并用计算机对各酶组分及其它来源的纤维素酶组分的氨基酸组成进行了绕计分析,推论了它们之间的相互关系。据以提出转译后修饰的假说,以解释纤维素酶系多组分性和微异质性产生的原因。     

痢疾基因工程三价菌苗候选株的构建

通过DNA体内外同源重组, 用霍乱毒素B亚单位基因(ctxB)完全取代了福氏志贺氏2a T32株染色体上的asd基因, 获得了稳定表达CtxB的DAP依赖株FWL01. 随后, 用T32株的asd基因标记志贺氏宋内S7株的Ⅰ相大质粒, 并将其诱动至FWL01, 构成三价菌苗候选株FSW01. 在该菌苗候选株中, 表达宋内Ⅰ相O抗原的大质粒与宿主菌是平衡致死的. 因此, 该候选株在没有任何抗生素存在情况下, 能稳定地表达福氏 2a, 宋内O抗原和CtxB. 豚鼠眼角膜试验和HeLa细胞侵袭试验证明FSW01无毒, 家兔免疫试验证实了其有很好的免疫原性. 小鼠和猴体免疫保护试验显示该候选株对相应的有毒株攻击具有很好的保护效果.     

NAC1上游调控区表达特征及其与侧根激素诱导的关系

从拟南芥(Arabidopsis thaliana）中克隆到与侧根原基发生相关的转录因子基因NAC1上游调控区序列,构建由该序列驱动β-葡聚糖苷酶基因(GUS)的植物表达载体并转化烟草(Nicotiana Tabaccum),经筛选获得了在根组织高GUS活性而地上部痕量表达的转基因烟草植株。对转基因植株进行GUS活性和染色分析,结果表明NAC1上游调控区驱动的GUS基因表达具有根部组织特异性,在侧根顶端分生组织区、侧根原基基部和幼嫩侧根基部表达。用IBA,GA₃,GA₄₊₇处理转基因植株根部,NAC1上游调控区驱动的GUS表达均增强,表明生长素、赤霉素可显著诱导NAC1上游调控区的表达,并参与侧根发生的调控。     

含庚型肝炎病毒E2基因片段质粒DNA能诱发相当强烈的体液免疫应答

研究了庚型肝炎病毒E2(HGVE2 )基因片段作为DNA疫苗的可行性。将来自于质粒pThioHis-E2编码HGVE2的基因片段 (559bp)亚克隆到质粒pCMV-S中 ,使之和HBsAg基因位于同一阅读框 ,形成重组质粒pCMV-S-E2。用纯化的质粒pCMV-S-E2DNA注射到昆明小鼠后腿四头肌中来免疫小鼠 ,同时用pCMV-S作为对照。间隔 14天再加强一次免疫。在加强免疫后的第 8天眼眶取血。用E2-GST融合蛋白作为固定化抗原 ,通过ELISA检测受试小鼠的体液免疫应答。结果表明 ,用质粒pCMV-S-EDNA免疫的小鼠可以产生很强的体液免疫应答。     

绿色木霉MJ1产内切β-葡聚糖苷酶的分离纯化及酶学性质

利用KTAUPC-900快速蛋白液相色谱系统(FPLC)从绿色木霉MJ1固体发酵产物中分离纯化出内切β-葡聚糖苷酶。分离纯化后酶的比活力提高了28.6倍,回收率为19.7%。SDS-PAGE后经BIO-RAD凝胶成像系统分析该内切酶的分子量为64.7kD。酶学试验研究表明:该酶的最适反应温度53℃,最适pH为4.2,Lineweaver-Burk法求得动力学参数,K_m和V_max分别为1.230×10^{-2相似文献}   

一氧化氮和氧自由基诱导缺氧再给氧心肌细胞凋亡的bcl-2和p53信号通路研究

观察了心肌缺氧再给氧损伤的一氧化氮(nitric oxide, NO)和氧自由基机制. 新生Wistar大鼠心肌细胞置于95% N₂ /5% CO₂环境培养24 h, 然后置于95% O₂ /5% CO₂环境培养4 h造成缺氧再给氧心肌细胞损伤模型. 单纯缺氧组心肌细胞置于95% N₂/5% CO₂环境培养24 h, 但不再给氧. NO供体硝普钠(SNP, 5 mmol/L)、NO合酶抑制剂Nw-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME, 100 mmol/L)和其异构体Nw-硝基-D-精氨酸甲酯(D-NAME, 100 mmol/L)以及超氧化物歧化酶/过氧化氢酶(SOD/CAT, 各100 U/mL)分别于缺氧前加入培养基. 正常对照组心肌细胞置于95% 空气/5% CO₂环境下培养. 结果显示, 缺氧24 h能增加培养介质中NO, 硫代巴比妥酸反应产物(TBARS)和乳酸脱氢酶(LDH)水平, 再给氧降低培养介质中NO和 水平, 增加TBARS和LDH水平. 缺氧上调bcl-2和p53和p21/waf1/cip1蛋白表达水平, 而再给氧下调bcl-2蛋白表达水平, 上调p53和p21/waf1/cip1蛋白表达水平. 同时, 缺氧增加心肌细胞凋亡率, 而再给氧增加心肌细胞坏死率. NO供体硝普钠(SNP)增加培养介质中 和TBARS水平, 下调bcl-2蛋白表达而上调p53和p21/waf1/cip1蛋白表达水平, 增加DNA断裂、凋亡及坏死细胞率. L-NAME和 SOD/CAT分别降低培养介质中 和TBARS水平, 它们均能上调bcl-2蛋白表达而下调p53和p21/waf1/cip1蛋白表达水平, 抑制DNA断裂、凋亡及坏死细胞率, 而D-NAME则无此作用. 以上结果表明, 在缺氧再给氧所致心肌细胞死亡过程中, NO和氧自由基参与下调bcl-2蛋白表达水平和上调p53和p21/waf1/cip1蛋白表达水平, 相应地激发细胞凋亡程序, 并提示一氧化氮及氧自由基诱导心肌细胞凋亡的机制与调节 bcl-2和p53和p21/waf1/cip1信号通路有关.     

鸡Ⅱ型胶原基因疫苗pcDNA-CCOL2A1能有效治疗大鼠类风湿性关节炎

已证明Ⅱ型胶原(CII)是类风湿性关节炎(RA)最主要的自身免疫抗原, 采用口服鸡Ⅱ型胶原蛋白(CCII)诱导免疫耐受治疗RA标志着RA治疗策略的重大进展之一. 在国际上克隆成功鸡Ⅱ型胶原蛋白基因(CCOL2A1)的基础上, 探讨了采用pcDNA-CCOL2A1基因疫苗策略治疗RA的科学性和可行性. 将克隆的CCOL2A1基因连接于真核表达载体pcDNA3.1(＋)上, 即为基因疫苗pcDNA-CCOL2A1. 然后将该表达载体pcDNA-CCOL2A1 转染COS-7细胞, 经Western blot分析显示, pcDNA-CCOL2A1在COS-7细胞中是以分泌型来表达CCII多肽链的α亚单位. 随后, 以CCII诱导的 Wistar大鼠为RA模型即CIA, 系统观察一次性尾部静脉注射20, 200, 400 μg/kg 3个不同剂量pcDNA-CCOL2A1基因疫苗对CIA关节炎的治疗作用. 结果表明, 在注射后第5天200 μg/kg组就可观察到大鼠关节肿胀程度明显减轻, 与空载体组比较有显著性差异(P <0.05), 而20, 400 μg/kg两剂量组与空载体组比较未观察到治疗效果(P>0.05). 注射后6周, CIA大鼠血清中抗CII抗体浓度水平、TNF-α浓度在200 μg/kg治疗组较空载体组明显降低(P<0.05), 而400 μg/kg组则显著的升高, 20 μg/kg组则无明显变化. 此外, 细胞因子TGF-β, IL-10浓度水平在200 μg/kg组较空载体组明显升高(P<0.05), 而20与400 μg/kg两组则无显著性差异. 脾细胞淋巴细胞增殖实验表明, 200 μg/kg剂量pcDNA-CCOL2A1基因疫苗治疗组大鼠脾细胞对CII的反应能力较空载体组明显下降(P<0.05). 此结果表明, 200 μg/kg剂量pcDNA-CCOL2A1基因疫苗能明显抑制CIA大鼠关节肿胀程度, 降低抗CII抗体、TNF-α水平, 提高细胞因子TGF-β, IL-10水平, 降低脾细胞增殖反应能力, 对CIA大鼠关节炎有显著的治疗作用.     

植物细胞离析酶的制备和应用

用 Aspergillus sp．A-19菌经固体发酵研制成一种新的植物细胞离析酶(SeparatasezA—P)。其离析单细胞的酶活力平均为70 767u／g,有效作用的pH在3．0—7．0,温度为20—45℃。发酵培养基配方是麸皮：桔皮粉：(NH₄)₂SO₄(w／w)为100:100:O．63,料水比为1 :2．0,培养适宜条件为25℃、60小时。     

豌豆核基质结合区的分离及其在转基因烟草中的功能分析

从豌豆基因组中分离出一段具有核基质结合区(matrix attachment region,MAR)特征的DNA序列,与已知序列相比,获得的序列中部缺失了115bp的重复序列.重复序列上、下游两段序列与已知序列相对应的序列有较高的同源性,并具有A-box,T-box和TATAAA等典型的MAR序列特征.为验证此DNA序列的功能,以β-葡糖醛酸酶(β-glucuronidase,GUS)基因(uidA)作报导基因构建了植物表达载体,通过农杆菌介导转化了烟草.GUS定量检测表明,由于此DNA序列的存在,uidA基因的平均表达水平提高了2倍,最高的单株可达6倍.上述结果表明,该DNA具有MAR序列的特征序列,并且具有增加转基因表达的功能.     

来源于Pyrococcus furiosus的耐高温α-淀粉酶基因在衣藻叶绿体中的表达

来源于Pyrococcus furiosus的耐高温α-淀粉酶是一种重要的酒精工业用酶,在植物中表达耐高温α-淀粉酶可以大大降低用植物秸秆生产酒精的成本。选择衣藻叶绿体基因组同源片段clpP-trnL-petB-chlL-rpl23-rpl2和壮观霉素抗性基因,构建了来源于Pyrococcus furiosus的耐高温α-淀粉酶基因的衣藻叶绿体表达载体P64a。通过基因枪将其导入衣藻叶绿体中,经壮观霉素抗性(100mg/L)筛选,获得了9 个抗性衣藻转化子。转化子经过抗性继代筛选后,经PCR、Southern blot 检测分析及暗培养,证实耐高温α-淀粉酶基因已整合到衣藻叶绿体基因组中并得到表达。酶活性检测表明,转基因衣藻表达产物具有耐高温α-淀粉酶活性,每克鲜重衣藻最高达77.5u。 实验结果证明在植物叶绿体中表达工业酶制剂是可行的。     

菜豆重金属响应基因PvSR2在烟草中的表达及镉抗性分析

重金属特异诱导基因PvSR2(Phaseolus vulgaris stress-related)是从法国菜豆中克隆出来的, 为了研究该蛋白能否提高植物的抗重金属能力, 将PvSR2基因插入到植物转化中间载体pCAMBIA2301中CaMV 35S启动子的下游, 用根癌农杆菌介导的叶盘法将其导入烟草中, 在含有100 mg/L Kan的MS培养基上筛选, 获得了转基因植株. PCR和Southern杂交结果表明PvSR2已整合在烟草基因组中, GUS和Northern分析表明PvSR2在转基因烟草中获得表达. 重金属抗性实验表明: 与野生型烟草相比, PvSR2转基因烟草具有较高的抗重金属镉(Cd)的能力. 组织Cd含量分析显示: 在低浓度Cd (0.5~0.75 mmol/L)处理时, Cd在PvSR2转基因烟草与野生型烟草根中的累积量没有明显的差别, 而在高浓度Cd(0.1 mmol/L)胁迫下, 转基因烟草根中Cd的累积量低于野生型烟草, 说明PvSR2的表达能够提高植物的抗重金属能力, 同时表明PvSR2可能与重金属在植物中的运输和积累有一定关系.     

日本根霉IFO5318胞外β-葡萄糖苷酶的纯化及部分特性

采用硫酸铵沉淀及柱层析等步骤纯化了日本根霉IFO5318的β—葡萄糖苷酶,回收率为22％。该酶分子量约为4.0×10~5,由四个相同大小的亚基组成;最适反应温度55℃,最适反应pH5.5;对热较敏感,但能在较大的pH范围内保持稳定。用对硝基苯基—β-D-吡喃葡糖苷为底物,测得的K_m和V_(max)值分别为0.825mg·ml~(-1)和135.4μmol·min~(-1)·mg~(-1)。该酶对纤维二糖的水解能力最强,SDS、Fe³⁺、Hg²⁺等对酶活力有抑制作用。     

抑制c-sis/PDGF-B原癌基因表达的TFO设计、体外三链形成及功能的检测

血小板衍生生长因子(PDGF)在肿瘤发生、生长,动脉粥样硬化和炎症反应等病理状态中起着极其重要的作用,其B链基因为原癌基因c-sis的同源物.提供了用于抑制c-sis/PDGF-B原癌基因表达的3种TFO(三链形成寡聚脱氧核苷酸triplex-forming oligonucleotide).凝胶阻滞电泳、DNaseⅠ印迹、体外转录抑制及核蛋白结合抑制等实验证明了这些化合物可与靶位点(c-sis/PDGF-B基因5′上游启动子核心区)形成稳定的三链复合物,并可抑制其下游基因的转录和转录因子的结合.它们有望应用于配制治疗肿瘤发生、生长,动脉粥样硬化和炎症反应等有关疾病的药物.     

黑曲霉N14植酸酶基因在巴斯德毕赤酵母中的高效表达

从黑曲霉N14基因组DNA中扩增出植酸酶phyA基因表达片段 ,并将其克隆到pMD18-T载体中。以此片段构建了pPIC9K-phyA重组表达载体 ,目的片段以正确的阅读框架插入到pPIC9K的多克隆位点EcoRⅠ和NotⅠ之间。重组表达载体经XbaⅠ线性化处理 ,电击转化毕赤酵母 ,经G418抗性筛选、酶活性测定、PCR鉴定和SDS-PAGE分析 ,获得了两株产酶活性分别为 14 39583u mL发酵液 (PP N1422 )和14 89083u/mL发酵液 (PP-N1444)的高产工程菌 ,其酶活性分别是出发菌株酶活性 (422u/mL)的 34113倍和 35286倍 ,重组酵母具有很好的遗传稳定性。重组植酸酶在pH值 2.5～3.0和 5.0～5.5时酶活性最高 ,且在pH4.5～6.5之间均有相当高的酶活性 ,最适作用温度为55℃。     

多粘芽孢杆菌 (Bacillus polymyxa)β-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达、纯化及酶学性质分析

从多粘芽孢杆菌 (Bacilluspolymyxa 1794 )中克隆得到 β-葡萄糖苷酶基因bglA。将其构建在大肠杆菌 (Es-cherichiacoli)表达载体pET28a(+)上 ,转化E .coliBL21,获得重组工程菌BL1979。重组表达的 β-葡萄糖苷酶的酶活力达到 247IU mL ,经镍柱纯化后的β-葡萄糖苷酶最适温度为 37℃ ,最适pH值为70 ,该酶经纯化后纯度可达92.7%。用非变性梯度聚丙烯凝胶电泳发现该酶具有多种寡聚体形式 ,经荧光底物活性染色表明这些寡聚体均具有β-葡萄糖苷酶活性.