营养动脉结扎和液氮冷冻对股骨头内局部氧分压的影响

目的：观察营养动脉结扎和液氮冷冻对股骨头内局部氧分压的影响,为后期制作极度低氧股骨头缺血坏死模型打下基础。方法：9只雄性大耳白兔随机平均分为对照组、液氮冷冻组和动脉结扎＋液氮冷冻组,对照组动物不做任何处理,液氮冷冻组动物行股骨头液氮冷冻使其发生缺血坏死,动脉结扎＋液氮冷冻组动物先结扎旋股内外侧动脉,再对股骨头进行液氮冷冻。造模后立刻活体观察股骨头内氧分压变化。结果：液氮冷冻组股骨头内氧分压较对照组下降一半左右,2组比较有显著性差异（P〈0．05）;动脉结扎＋液氮冷冻组动物股骨头内氧分压进一步下降到对照组的1／8左右,与其他2组相比有显著性差异（P〈0．05）。结论：液氮冷冻和旋股内、外侧动脉结扎均可明显降低股骨头内氧分压,两者合用具有重叠效应,可共同促使股骨头内氧分压下降。     

小鼠卵巢组织的超速冻存法研究

目的　本实验通过对小鼠卵巢组织进行冻存研究 ,掌握卵巢的低温生物学特性 ,摸索出一种简便有效的组织器官冻存法 ,为卵巢移植及器官冷冻提供有用的技术方法。方法　通过对小鼠卵巢组织进行慢速程序法与快速液氮蒸汽法冻存 ,比较分析了不同方法所需保护剂种类、浓度、渗透平衡时间。采用对解冻后卵巢组织超微结构观察、组织化学染色、激素测定及自体、异体移植后动情期的恢复作为评价指标。结果与结论　通过上述实验表明用同种冷冻保护剂 ,液氮蒸汽法冻存的卵巢组织超微结构保存良好 ;组织化学染色示其活性与程序法冻存组织相同 ;自体、异体移植后 ,小鼠动情周期的恢复率及血清雌二醇水平各项指标均与慢速程序法冷冻无显著性差异     

超低温冷冻对益智种子生理生化特性的影响

益智(Alpinia oxyphylla)是我国四大南药之一,其种子为顽拗性种子,不耐干燥和低温,无法常规保存。为解决益智种子长期稳定保存的问题,该研究以益智种子为材料,从种子含水量以及冷冻方式方面优化益智种子超低温保存方法,并对比液氮冷冻前后种子发芽率、α-淀粉酶活性、超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性、脱氢酶活性、丙二醛含量等活力指标,分析液氮超低温冷冻对益智种子生理生化特性的影响。结果表明:直接液氮冷冻含水量13.92%~14.38%范围的种子是益智种子超低温保存的最佳条件。液氮冷冻后,随着超低温冷冻时间的延长,益智种子发芽率先由76.76%下降至52.5%,再上升至65%,最后下降并稳定在50%以上。其种子α-淀粉酶活性先下降后上升,然后又下降,最后上升并稳定至冷冻前的水平。丙二醛含量则是先上升后下降,最后趋于平稳状态。过氧化物酶活性是先下降,然后稳定在恒定水平。超氧化物歧化酶活性是随着冷冻时间的延长而持续上升,脱氢酶活性则是持续下降。以上结果说明,液氮冷冻时间对益智活力有一定的影响,但对种子有些性能具有一定的促进作用。无论是发芽率,还是生理生化指标,都不同程度表明液氮超低温保存益智种子是可行的。     

去甲基万古霉素菌种低温冷冻、冷干保藏条件优化及10 年菌种保藏效果

【目的】针对去甲基万古霉素产生菌不耐保藏的问题,改进菌种保藏方法,对超低温液氮保藏、-80°C低温冷冻保藏、冷干保藏方法跟踪考察10年保藏稳定性,评价不同保藏方法对去甲基万古霉素产生菌的保藏适用性。【方法】采用甘油作基础保护剂进行超低温液氮保藏和-80°C低温冷冻保藏,采用脱脂牛奶作基础保护剂进行冷干保藏,针对超低温液氮保藏进行降温速率考察,研究非渗透性冷冻保护剂海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等对3种保藏方法的冻存影响,对优选出的保藏方法进行10年跟踪考察。【结果】3种保藏方法冻后菌种存活率依次为:-80°C低温冷冻保藏超低温液氮保藏冷干保藏。液氮保藏最适降温速率为快速冷冻。优选出最佳保护剂配方:超低温液氮保藏为甘油8.0%,海藻糖3.5%;-80°C低温冷冻保藏为甘油6.0%,PVP 5.0%;冷干保藏为脱脂牛奶,6.0%海藻糖。采用优化保藏条件,液氮保藏10年存活率稳定在70.6%,菌种发酵水平为入藏水平的92.9%。【结论】在优化条件下,尤以超低温液氮保藏适合于去甲基万古霉素产生菌长期保藏。     

液氮冷冻大鼠左冠状动脉前降支中上1／3所支配区域建立心肌梗死模型

目的探讨大鼠左冠状动脉前降支中上1／3所支配的区域液氮冷冻处理后对心肌形态学及心功能的影响,以建立适合移植干细胞再生修复心肌梗死研究的一种新的大鼠心肌梗死模型制作方法。方法80只雄性SD大鼠,随机分为3组即：冷冻组、结扎组、对照组。大鼠麻醉后,行气管插管连通动物呼吸机,打开胸廓暴露心脏,用特制的直径为0．6cm冷冻头置入液氮中冷冻降温后迅速冷冻大鼠左冠状动脉前降支中上1／3所支配的区域,或结扎左冠状动脉前降支中上1／3处。分别于处理后1d、3d、7d、14d、28d观察心脏病理组织学变化,并于处理28d后检测心功能的变化。结果在液氮冷冻大鼠心脏后,大鼠心肌组织出现凝固性坏死,继而有肉芽组织长人梗死灶内,最后形成疤痕。用液氮冷冻法可成功复制心肌梗死大鼠动物模型。与冠状动脉结扎法相比较,操作简单,手术时间短,死亡率低．心肌梗死面积变异小。结论液氮冷冻法作为一种复制心肌梗死模型的方法,有其自身的优势．可用于心肌梗死发生机制和干细胞治疗等方面的研究。     

玻璃化冷冻对猪体外成熟卵母细胞染色体与纺锤体的影响

以冷冻环为载体,探讨玻璃化冷冻对猪体外成熟卵母细胞染色体与纺锤体影响。单用40%乙二醇(ethyleneglycol,EG)或20%EG与20%二甲基亚砜(dimethylsulphoxide,DMSO)联合作冷冻保护剂,用直投液氮或使用玻璃化冷冻仪法制冷冷冻猪体外成熟卵母细胞;解冻2h后固定并免疫荧光法染色纺锤体及染色体;挑选各试验组形态正常卵母细胞进行体外受精实验。结果表明,与单用EG以及EG和DMSO联合直投液氮方案比较,EG和DMSO联合应用并采用玻璃化冷冻仪制冷方案卵母细胞染色体正常率为30.1%,纺锤体正常率为37.2%,可明显降低卵母细胞染色体及纺锤体结构损伤(P<0.05),并明显提高卵母细胞的激活效果(P<0.05)。采用联合冷冻保护剂及玻璃化冷冻仪高速冷冻可较好维持猪卵母细胞染色体与纺锤体形态,但玻璃化冷冻明显影响猪卵母细胞体外受精后的发育能力。     

瘤胃微生物RNA提取中样品前处理方法的优化

通过优化瘤胃液前处理方法,提高瘤胃微生物RNA提取数量与质量。试验优化4个前处理条件,共组合形成5个处理组。前处理完成后,利用Trizol进行RNA提取,检测RNA浓度和完整度(RIN)。结果显示,提取瘤胃内容物和瘤胃菌体RNA浓度和完整度的影响没有显著差异(P0.05)。液氮保存的样品提取的RNA浓度和完整度均显著(P0.05)高于RNA保护液保存的样品。解冻处理对RNA浓度的影响无显著差异(P0.05),但是不解冻处理提取的RNA完整度显著高于解冻处理(P0.05)。液氮冷冻研磨提取的RNA浓度(P0.05)显著高于常温研磨,但是对RNA完整度的影响没有显著差异(P0.05)。瘤胃内容物、液氮速冻、不解冻处理结合冷冻研磨方法所提取RNA的RIN值为9.43,完整度最高。瘤胃内容物、液氮速冻、解冻离心收集菌体结合冷冻研磨方法所提取的RNA浓度为1 048 ng/μL,为最高浓度。因此,瘤胃内容物直接液氮速冻并在不解冻条件下冷冻研磨,所提取的RNA效果最好,可用于后续宏转录组学试验。     

不同冷冻保护剂对早期卵裂期小鼠胚胎冷冻后成活率和发育的影响

为了评价利用不同冷冻保护剂冷冻早期卵裂期胚胎的效果,用小鼠为实验动物,采用慢速冷冻、快速融解的冷冻技术,比较丙二醇、二甲基亚砜和甘油作冷冻保护剂对小鼠2-细胞、4-细胞、8-细胞胚胎冷冻后胚胎存活率和囊胚形成率的影响。发现以丙二醇和蔗糖为冷冻保护剂冷冻4-细胞、8-细胞胚胎,解冻后胚胎成活率和囊胚形成率显著高于以二甲基亚砜或甘油为冷冻保护剂。结果表明,丙二醇是一种冷冻早期卵裂期小鼠胚胎有效的冷冻保护剂。     

甘草酸二胺肠溶胶囊联合液氮冷冻治疗斑秃的疗效

为了研究观察不同剂量的甘草酸二胺肠溶胶囊联合液氮冷冻治疗斑秃的疗效分析,以及检测甘草酸二胺肠溶胶囊对患者肝肾功能的影响,进一步阐明甘草酸二胺肠溶胶囊对斑秃治疗的效果与对人体的健康影响,本研究以仅使用液氮冷冻治疗斑秃为对照组,设低剂量甘草酸二胺肠溶胶囊联合液氮为低剂量组(50 mg/次),高剂量甘草酸二胺肠溶胶囊联合液氮为高剂量组(200 mg/次),一日3次,共治疗12周,以斑秃皮损面积及严重程度指数(PASI)评分为疗效评价。采用血液生化检验(肝,肾功检查)检测3组治疗前后的丙氨酸氯基转移酶、尿素氮和肌酐水平。研究结果表明,治疗后高剂量组总有效率(92.50%)高于低剂量组(82.50%)及对照组(55.00%)(p<0.05)。高剂量组PASI评分及治疗前后丙氨酸氯基转移酶、尿素氮、肌酐水平相对于低剂量组及对照组无统计学意义(p>0.05)。本研究初步结论表明,高剂量的甘草酸二胺肠溶胶囊联合液氮治疗斑秃疗效显著高于甘草酸二胺肠溶胶囊联合液氮及仅使用液氮冷冻治疗;甘草酸二胺肠溶胶囊安全可靠,不影响患者的肝肾功能。     

酒酒球菌液氮超低温保存

【目地】为安全、长期的保藏酒酒球菌,本文研究了菌体生长时间、冷冻方法、解冻温度、菌密度以及保护剂等对酒酒球菌细胞冷冻存活率的影响,找到最优液氮超低温保存方法。【方法】采用平板计数法测定冷冻存活率。【结果】实验结果表明酒酒球菌的最佳保存方法为:首先在稳定期前期离心收集菌体;其次加入保护剂(20 g/L酵母浸提物,40V/V甘油,20 g/L蔗糖,30 g/L谷氨酸钠)稀释菌体,使菌密度为109CFU/mL;然后直接投入液氮冷冻;最后在37℃温水浴中迅速解冻。保存6个月后,其中21株酒酒球菌的冷冻存活率达到99%以上。【结论】初步研究表明酵母浸提物,甘油,蔗糖,谷氨酸钠复合保护剂对酒酒球菌的保护效果较好,液氮超低温保存可用于酒酒球菌的长期保存。     

系统低温生物学技术在实验小鼠资源保存中的建立与应用

目的建立小鼠胚胎与配子冷冻库,以安全、有效地保存小鼠资源。方法选择不同遗传背景（近交系、远交群、免疫缺陷、疾病模型和基因改变等）的实验小鼠,系统进行了超数排卵、体外受精（IVF）率、胚胎与精子的冷冻复苏效果、卵巢冷冻与移植、辅助体外受精等比较研究。结果①小鼠年龄和遗传背景的不同,其超数排卵的结果也不同（P〈0．01）。三个日龄段中,28日龄最好,其次为112日龄,56日龄最差;不同遗传背景小鼠的超数排卵结果显示,封闭群和大部分近交系小鼠优于转基因小鼠（P〈0．05）,自发性疾病小鼠和基因剔除小鼠的结果最差;②不同品系小鼠的新鲜精子和冻融精子的体外受精率差异有显著性（P〈0．05）,特别是C57BL／6J小鼠冻融精子的IVF率（10．3±4．2％）与新鲜精子（89．8±4.8％）相比,差异极显著（P〈0．01）;③不同品系小鼠的胚胎复苏率,除MRL／mp小鼠的复苏率略低外,其他小鼠品系均有较高的冷冻胚胎复苏率（58．2％～83．9％）,表明,不同遗传背景小鼠之间差异有显著性（P〈0．05）,但均可以达到有效保存小鼠资源的目的。④小鼠的遗传背景、年龄等对小鼠精子的冷冻效果都有影响,采用改良的FERTIUP冷冻保护剂和细胞质内单精注射（ICSI）技术可有效提高以C57BL／6J为背景的基因改变小鼠的精子冷冻复苏率。⑤卵巢冷冻保存可以改善雌性小鼠的繁殖困难或不孕。结论小鼠资源的安全保存,除了长期连续繁殖保种外,最好的或最保险的方法是低温保存。通过将胚胎、配子、卵巢等长期保存在液氮（-196℃）中避免遗传性状的改变,并在将来复苏后获得正常的小鼠后代,以用于生物学和医学等研究。     

超低温冷冻对羯布罗香种子结构和生理生化特性的影响

为长期、稳定、有效地保存羯布罗香(Dipterocarpus turbinatus Gaertn.F.)种子,探讨了低温冷藏对种子活力、结构和生理生化指标的影响。结果表明,45%的含水量是种子的安全储藏含水量;玻璃化冷冻和缓慢冷冻对种子结构损害较大,且冷冻后的种子活力下降幅度大;快速冷冻法是种子超低温保存的最佳冷冻方式;液氮冷冻降低了种子过氧化物酶、过氧化氢酶和脱氢酶活性,提高了α-淀粉酶活性,而对丙二醛含量无显著影响。因此,超低温保存羯布罗香种子是科学可行的。     

一种安全有效的卵母细胞封闭式玻璃化冷冻载体

目的探讨封闭式玻璃化冷冻载体冻存小鼠卵母细胞的可行性。方法以小鼠MII期卵母细胞为模型,以开放式玻璃微细管法（GMP）为对照组,比较两种玻璃化冷冻载体对小鼠卵母细胞冷冻后的存活率、受精率、卵裂率及囊胚率的影响。结果卵母细胞经冻融后,封闭式冷冻载体组和GMP组的存活率、受精率、卵裂率和囊胚率均没有明显差异（92.80%vs93.11%,49.80%vs51.67%,36.73%vs35.83%,12.65%vs14.17%%;P〉0.05）。结论封闭式冷冻载体能安全、有效的冷冻保存小鼠卵母细胞。     

疫霉属菌种的液氮超低温保藏

对疫霉属的15个种68株菌和霜疫霉2株菌进行了液氮超低温的保藏试验并得到成功。比较了冷冻速度、保护剂和解冻速度对菌存活的影响。严格控制每分钟降温摄氏1度直到-40℃后再放入液氮罐中,对疫霉和霜疫霉来说都是非常必要的。这种降温程序可通过简单设备人工操作达到。而直接由室温降到-150℃以下会损伤菌种以致死亡。在所用的保护剂中,不论10％甘油还是5-15％二甲基亚砜都能起到保护作用。尚看不出对那种保护剂有特别的要求,似可任意选用。至于解冻条件,由液氮中取出放置在38℃水浴中快速融化与在20℃水浴中中等速度融化效果相等,对菌的成活都没有太大影响。我们的试验肯定了在有保护剂存在下,用慢速冷冻可以在液氮中保存疫霉和霜疫霉。     

平衡时间、冷冻方法及解冻程序对马精液冷冻效果的影响

精液平衡、冷冻及解冻是冻精制作过程中三个必不可少的环节,对精液冷冻效果起着决定性作用。在马(Equus caballus)精子冷冻中针对这三个过程的研究较少,为进一步优化马精液冷冻方法,提高精液冻后质量,本研究比较不同平衡时间、冷冻方法及解冻程序对冻融后精子运动参数、质膜完整性及线粒体膜电势的影响。平衡120 min、180 min和240 min组冻融后精液活力及质膜完整性明显高于平衡0 min、45 min、90 min及8 h平衡组;距离液氮面2 cm和4 cm高度熏蒸冷冻获得了与程序冷冻仪冷冻法相似的冷冻效果;采用高温瞬时解冻法(75℃7 s和46℃20 s)比常规方法(37℃30 s)获得了更高的冻后精液活力(P0.05)。综合上述结果,在马精液冷冻过程中综合采用120~240 min平衡,距离液氮面2~4 cm熏蒸法和高温瞬时解冻法(75℃7s和46℃20 s)可获得更好的精液冷冻效果。     

一种高效的灵芝菌丝体总蛋白的提取方法

灵芝基因组精细图谱的完成必将推动灵芝蛋白质组学的快速发展,因此,建立一种高效稳定的灵芝菌丝体总蛋白的提取方法是蛋白质组学研究的首要步骤。本文以灵芝菌丝为研究对象,使用超声波、液氮冷冻研磨和超声波联合液氮冷冻研磨等三种破碎细胞壁的方法,采用含不同蛋白酶抑制剂的尿素-硫脲法溶解菌丝体总蛋白,经SDS-PAGE电泳分析和蛋白浓度测定,发现液氮冷冻研磨结合尿素-硫脲溶解蛋白质的方法适合灵芝菌丝体总蛋白的提取,从每克新鲜菌丝中能提取16 g蛋白质,且蛋白质种类多,条带丰度高。     

仙客来愈伤组织的超低温保存

为了避免连续继代造成仙客来愈伤组织的变异, 对仙客来愈伤组织进行了超低温冷冻保存研究。以继代后处于对数生长期的愈伤组织为实验材料, 首先在含有不同蔗糖浓度的培养基上预培养不同时间, 转至不同的冰冻保护剂中直接液氮冷冻或-20oC预冷冻2 h, 然后液氮超冷冻保存, 37oC水浴迅速解冻, 并用相应蔗糖浓度的液体培养基洗涤, 以中性红染色测定细胞的存活率, SPSS13.0软件进行统计学分析。结果表明: 预培养基中蔗糖浓度、预培养时间、降温方式、冷冻保护剂等对解冻后材料相对存活率存在不同程度的影响, 筛选出4%蔗糖浓度预培养3 d、9号保护剂、0oC停留30 min后直接冷冻为超低温保存的最佳方案, 通过简单的方法获得了较好的愈伤组织保存效果。     

仙客来愈伤组织的超低温保存

为了避免连续继代造成仙客来愈伤组织的变异, 对仙客来愈伤组织进行了超低温冷冻保存研究。以继代后处于对数生长期的愈伤组织为实验材料, 首先在含有不同蔗糖浓度的培养基上预培养不同时间, 转至不同的冰冻保护剂中直接液氮冷冻或-20oC预冷冻2 h, 然后液氮超冷冻保存, 37oC水浴迅速解冻, 并用相应蔗糖浓度的液体培养基洗涤, 以中性红染色测定细胞的存活率, SPSS13.0软件进行统计学分析。结果表明: 预培养基中蔗糖浓度、预培养时间、降温方式、冷冻保护剂等对解冻后材料相对存活率存在不同程度的影响, 筛选出4%蔗糖浓度预培养3 d、9号保护剂、0oC停留30 min后直接冷冻为超低温保存的最佳方案, 通过简单的方法获得了较好的愈伤组织保存效果。     

不同品系小鼠胚胎玻璃化冷冻保存的比较研究

目的　研究甘油作为冷冻保护剂、不同基因型小鼠对胚胎玻璃化冷冻的影响。方法　采用 6 5mol L的甘油作为冷冻保护剂 ,采用二步法对CBA、NOD、C57BL 6J、ICR及CD1小鼠 3 5d的胚胎进行玻璃化冷冻 ,并比较了不同品系小鼠胚胎的复苏率及移植受孕率。结果和结论　CBA、NOD、C57BL 6J,ICR及CD1的复苏率分别为 5 7 6 %、4 8%、31 3%、86 5 %及 88% ,移植受孕率为 2 1%、2 3 5 %、11%、38%和 35 5 % ,封闭群小鼠的胚胎复苏率、移植受孕率均显著高于近交系小鼠。这提示胚胎的复苏率及移植受孕率可能与小鼠的不同基因型有关。五个品系中 ,桑椹胚及早期囊胚的体外复苏率均显著高于扩张囊胚。这说明不同基因型及胚胎的不同发育阶段对胚胎玻璃化冷冻效果有影响     

液氮喷雾治疗器的研制与临床应用

介绍了液氮雾化的原理,自行研制新型液氮喷雾治疗器经过,并用于临床治疗,冷冻治疗242例雀斑,疗效显著,经1年~3年追踪观察,治愈率为81.4%,有效率复发率为0.02%。结果显示新型液氮治疗器适用于治疗小的、表浅的和某些特殊部位的皮损,对色素性疾病有很好的疗效。