被子植物生殖细胞与精细胞的分离方法

开花植物精细胞的发育经历一个独特的后减数分裂过程,在此过程中每个花粉母细胞减数分裂的产物——小孢子经不对称有丝分裂产生1个大的营养细胞和1个小的生殖细胞,随后生殖细胞经过正常的有丝分裂产生2个精细胞。近几年,随着高通量组学技术的不断完善,利用组学技术比较分析生殖细胞和精细胞的分子特征、揭示决定精细胞命运与功能以及受精识别的重要分子已成为植物生殖生物学备受关注的课题。开展此项研究的关键是建立能获得大量高纯度的生殖细胞与精细胞分离纯化技术。该文综述了被子植物生殖细胞和精细胞分离方法的主要研究进展,分析了关键方法的特点和要点以及不同方法之间的差异和共性,以期为相关领域的研究人员提供借鉴。     

玉米离体活性精细胞质膜的凝集素荧光标记(英)

采集纯系玉米708新鲜花粉,经含35％蔗糖的BKS培养液温育、2mmol／L的Mes缓冲液（Sue0．44mol／L,0．1％BSA,pH6．7）胀破后,以10／15／30％Percoll不连续密度梯度离心,获得活性精细胞。选用了6种FITC-凝集素（RCAI、ConA、WGA、SBA、PHA－L和UEAI）标记离体活性精细胞质膜。经荧光显微镜观察发现,10％～35％的精细胞可由FITC－ConA、FITC－WAG、FICT－RCAI所标记。在相应的单糖抑制实验中,未观察到被标记的精细胞。亦未观察到被FITC－SBA、FITC－PHA－L和FITC－UEAI所标记的精细胞。结果表明,玉米精细胞质膜分布有甘露糖、葡萄糖、半乳糖及乙酰氨基葡萄糖等残基。     

杜鹃精细胞的分离

杜鹃成熟花粉为二胞型,含一个营养细胞和一个生殖细胞,其精细胞在花粉管中形成。应用半离体技术培养杜鹃已授粉花柱,使花粉管从花柱中长出,再用渗透压冲击法促使花粉管破裂,释放出一对与营养核相连的精细胞。分离的精细胞经FDA方法检测,证明具活性。用显微操作仪可收集数量较多的分离精细胞。     

蓝猪耳精细胞的分离及两个精细胞群体的收集

蓝猪耳是二细胞型花粉,生殖细胞在花粉管中分裂形成两个精细胞。用体内-体外技术培养出花粉管后,将其置于爆破液中即可释放出花粉管内含物,其中包括两个精细胞和营养细胞。在显微镜下两个精细胞具二型性：体积较大的精细胞与花粉管的营养核相连,体积较小的精细胞只与大精细胞连接。两个精细胞之间的连接比较结实,需用微量酶液将两个精细胞分开。用显微操作仪就可分别挑选出两个精细胞群体,分别有上百个细胞。蓝猪耳精细胞的成功分离为利用蓝猪耳开展离体受精研究打下了良好的基础。这种单一纯化的精细胞群体的获得为用分子生物学方法区分两个精细胞的特异基因和蛋白质创造了条件。     

利用蓖麻毒素（RCA I）亲和层析进一步分离纯化玉米精细胞

利用ＲＣＡ Ｉ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ＭＢ大孔径凝胶对玉米（Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ．）离本活性精细胞进行亲和层析。结果表明,当精细胞数量小于ＲＣＡ Ｉ－凝胶的饱和吸附量时,７０％左右的精细胞被特异性地吸附;４２．１％被吸附的精细胞可由 性单糖一次性洗脱回收。而且镜检,活性检测及ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分析表明,所回收的精细胞仍具有一定的活性,尤其是具有较高的纯度。     

白榆生活精细胞分离和保存的研究

研究了白榆（ＵｌｍｕｓｐｕｍｉｌａＬ．）精细胞分离和生活力保存的方法。将吸湿后的白榆花粉撒播于蔗糖琼脂培养基上萌发。采用低渗法从花粉管中分离出精细胞。通过蔗糖密度梯度离心纯化和收集精细胞。收集后的精细胞密度为２．０×１０６个／ｍＬ,比较了牛血清白蛋白（ＢＳＡ）和聚乙烯吡咯酮（ＰＶＰ）两种保护剂对生活精细胞分离和保存的影响。在加入ＢＳＡ的蔗糖溶液中,精细胞的生活力在室温条件下可保存５４ｈ以上,而在０～４℃条件下则可保存１２ｄ以上。ＰＶＰ不利于生活精细胞的分离和保存。     

玉米精细胞及体细胞原生质体表膜蛋白的比较

以低渗冲击法（改良两步法）及Ｐｅｒｃｏｌｌ密度梯度离心,成功分离纯化生活玉米（Ｚｅａｍ ａｙｓ）精细胞;以混合酶解法制备玉米叶原生质体和愈伤组织原生质体;以ＮＨＳ－生物素标记完整精细胞及原生质体表膜蛋白,进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ,并以辣根过氧化物酶标亲和素检测被标记的表膜蛋白。结果表明,在精细胞中标记蛋白有４ 种,分子量分别为４８、５９、６７、７９ ｋＤ;叶片原生质体中有５ 种,分子量分别为５４、５８、６６、７１、７８ ｋＤ;愈伤组织原生质体中仅有２ 种,分子量６７ 和８０ ｋＤ。其中４８ ｋＤ蛋白为精细胞所特有,５４ ｋＤ 和７１ ｋＤ蛋白为叶片细胞所特有     

水稻生活精细胞的分离及细胞学观察

近１０多年来已经成功分离得到白花丹［１］、玉米［２,３］、百合［４］等植物的精细胞,并建立起玉米的离体受精实验体系［５,６］。但水稻作为我国和世界重要的粮食作物,迄今未见有类似工作的报道。本文采用渗透压冲击法成功分离得到水稻的生活精细胞。１材料和方法...     

光敏核不育水稻'农垦58S'精细胞的分离

文章对常用的渗透压冲击法作了改进,并从水稻成熟花粉粒中分离出大量精细胞。显微镜下的2个精细胞具有二型性,用显微操作仪从中分别挑选出2个细胞群体,并以荧光素二醋酸酯(FDA)染色的结果表明,分离的精细胞是活的。     

五唇兰精细胞的分离

五唇兰(Doritis pulcherrima)具二胞花粉,授粉后1 d即有花粉开始萌发,授粉后5 d开始有生殖细胞完成有丝分裂形成一对精细胞。通过人工授粉使花粉管在子房内发育,再利用花粉管直接爆破,成功分离出五唇兰的精细胞。成对的2个精细胞在直径大小、荧光强弱上均显示出较大差异,预示2个精细胞具有不同的前途。     

栽培草莓叶绿体分离与cpDNA的提取方法

以栽培草莓‘红颊’(Fragaria×ananassa Duch.‘Benihoppe’)新鲜幼嫩叶片为材料,利用高盐-低pH的缓冲液结合Percoll密度梯度离心分离纯化叶绿体,再用SDS-蛋白酶K法提取叶绿体DNA(cpDNA)。经荧光显微镜、琼脂糖凝胶电泳和PCR扩增检测,结果表明:该方法分离的草莓叶绿体完整性高,叶绿体DNA质量好,纯度高,能够满足后续基因组测序等实验的基本要求,为草莓属及其他草本植物cpDNA的提取提供参考。     

韭菜精细胞的分离(简报)

分离精细胞是在高等植物中开展离体受精研究的前提之一,也是开展精细胞分子生物学研究的前提 [1,2].对具三胞花粉的植物,精细胞的分离比较容易,将花粉粒直接撒到含一定渗透压的培养基中,花粉粒爆破释放出精细胞.     

两种不同密度分离液分离的脐血CD34+、CD34-细胞造血活性比较

目的:比较两种不同密度的ficoll-泛影葡胺分离造血干细胞群的效果,找出更适合分离脐血造血干、祖细胞的分离密度,为脐血造血干细胞的医学研究及临床应用提供一定依据。方法:采集脐血6份,根据密度梯度离心法,用质量分数为(1.068±0.001)g/m L、(1.077±0.001)g/m L ficoll-泛影葡胺分离液等量分离同一份脐血,分别计数这两种分离液的单个核细胞获得率及细胞存活率,得到的单个核细胞再分别经免疫磁珠分选法获得高纯度的CD34~+细胞及除去了CD34~+的单个核细胞(CD34~(-depleted) MNCs),统计分析这两种不同密度分离液获得的CD34~+细胞、CD34~(-depleted)MNCs在甲基纤维素中形成CFU-GM集落数。结果:1(1.068±0.001)g/m L、(1.077±0.001)g/m L两种分离液分离的单个核细胞平均密度分别为(1.52±1.0)×10~6个/m L、(2.84±0.98)×10~6个/m L,(P0.05);经免疫磁珠纯化后的CD34~+细胞占单个核细胞(MNCs)的比率分别是(1.26±0.47)%、(1.07±0.15)%,(P0.05);2(1.068±0.001)g/m L分离的单个核细胞经免疫磁珠纯化后1.5×10~3个CD34~+细胞形成CFU-GM的集落(140.5±14.5)显著多于(1.077±0.001)g/m L的集落数(118.3±13.8)(P0.05);(1.068±0.001)g/m L分离的5×10~4个CD34~(-depleted) MNCs形成的CFU-GM集落数(132.0±5.1)也显著多于(1.077±0.001)g/m L的集落数(101.3±9.4),(P0.05)。结论:与1.077 g/m L Ficoll相比,1.068g/m L Ficoll-泛影葡胺分离液分离的单个核细胞中的CD34~+、CD34~-细胞造血活性更强,更适合用来分离脐血中造血干细胞群。     

玉米生活精子的分离及扫描电镜观察(简报)

生殖细胞的分离和纯化是植物生殖生物学及生殖细胞工程的发展基础之一。70年代,Cass(1973)首次从大麦花粉管及花粉粒中分离精子;到80年代后期,分离精子已成为国际上实验生殖生物学中的热点。由于大量分离和纯化的技术进一步完善,已从一些植物的     

玉米精细胞质膜68kD特异糖蛋白组分的纯化和N—端序列测定

经ＳＤＳ＿ＰＡＧＥ和ＩＥＦ＿ＳＤＳ双向电泳，从玉米（ＺｅａｍａｙｓＬ．）精细胞质膜分离纯化得到等电点（ｐＩ）为５．５的６８ｋＤ糖蛋白的单一组分。伴刀豆球蛋白＿辣根过氧化物酶（ＣｏｎＡ＿ＨＲＰ）染色结果表明，该组分的糖链中含有甘露糖及葡萄糖残基。氨基酸序列分析表明，该组分的Ｎ＿端１５个氨基酸序列与ＣｏｎＡ的Ｎ＿端相应序列相同。根据分子量及ｐＩ值的差异，认为该组分并非ＣｏｎＡ，而可能与玉米精细胞质膜上的ＣｏｎＡ受体有关。它在玉米的精卵识别、粘附及融合中有何作用，无疑是令人感兴趣的问题。     

小鼠腹水瘤病毒(SRSV)及其核糖核酸的纯化和某些性质的研究

从感染NIH3T3小鼠成纤维细胞上清液中分离小鼠腹水瘤病毒,用蔗糖密度梯度离心法纯化。从新鲜病毒中取小鼠腹水瘤病毒RNA,并用酚-氯仿抽提和蔗糖梯度分离。各组分的沉降系数(S)和分子量通过超速离心凝胶电泳分析测定。SRSV RNA主要由两组分组成,一是沉降系数约60～70S(热处理后约35S),还有少量18S和28S,另一是4～5S。35S组分在体外能指导无细胞蛋白的合成。