一株产Bei醌光敏化合物的真菌成分分析

本文报道人工增减的一株菌寄生菌属Ｈｙｐｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．真菌菌体化学成分的研究与分析结果,证明该菌主要次生代谢产物为Ｂｅｉ醌类光敏色素,还含有较丰富的甘露醇和长链烷烃及其衍生物,是一株优良的具有实用开发价值的菌种。     

一株产苝醌光敏化合物的真菌成分分析

本文报道人工培养的一株菌寄生菌属Ｈｙｐｏｎｇｃｅｓｓｐ．真菌菌体化学成分的研究与分析结果,证明该菌主要次生代谢产物为醌类光敏色素,还含有较丰富的甘露醇和长链烷烃及其衍生物,是一株优良的具有实用开发价值的菌种。     

Bei醌类化合物的杀线虫活性

采用液体浸泡方法首次测定了菌寄生菌属Hypomyces sp.的次级代谢物Bei醌类化合物竹红菌甲素和痂囊羟菌素对松材线虫的致病率，结果表明竹红菌甲素对松材线虫的半致病率为18小时50ug/mL，痂囊羟菌素对松材线虫的半致病率为18小时15ug/mL，对比（啊维菌素）对松材线虫的半致病率为18小时0．8ug/mL，在红外光照射下竹红菌甲素和痂囊羟菌素具有良好的光敏杀伤松材线虫的作用。     

醌那霉素生物合成基因簇中alp2F和alp2G基因的功能表征

醌那霉素是由Ⅱ型聚酮合酶系统产生的一类角蒽环类聚酮化合物。从结构上看,其具有三个显著的特征:苯并芴核、高度氧化的A环以及芴环上的重氮基团。醌那霉素因其特殊的苯并芴结构以及良好的生物活性,引起了科研人员广泛的研究兴趣。但是迄今醌那霉素的生物合成途径并没有得到完全的解析,尤其是对重氮基团的形成。前期研究因缺少醌那霉素完整的生物合成基因簇信息而受到阻碍。本课题组最近确证了醌那霉素的完整生物合成基因簇,共包含62个基因,其中有8个基因并没有被报道过。通过生物信息学分析,本研究发现其中alp2F和alp2G基因与cremeomycin生物合成中的creE和creD具有高度的同源性。creE和creD基因产物通过催化天冬氨酸生成亚硝酸,其后亚硝酸在酸性条件下自发加载到化合物的碳骨架上,实现重氮基团的加载。本研究通过体外酶催化反应证实了Alp2F和Alp2G同样可以催化天冬氨酸生成亚硝酸。亚硝酸钠喂养实验进一步确证了亚硝酸盐参与醌那霉素的合成。alp2F和alp2G基因功能体外和体内的确证,不仅是对醌那霉素生物合成基因簇中未知基因功能的表征,也对阐明醌那霉素家族天然产物中重氮基团的形成有启发意义。     

酮基合酶AlpRQ影响醌那霉素的产量

【背景】角蒽环类聚酮化合物醌那霉素生物合成基因簇包含了两套酮基合酶(KSα和KSβ)的编码基因,即alpA,alp B和alpR,alpQ,AlpA和AlpB被证明是醌那霉素合成过程中必需的酮基合酶,而AlpR和AlpQ则被认为与别的化合物的合成相关。【目的】鉴于alpR和alpQ和必需基因alpS在醌那霉素合成基因簇上紧密相邻,本研究旨在确定它们与醌那霉素生物合成的相关性。【方法】PCR-targeting在细菌人工染色体(BAC)文库质粒上进行多基因敲除,构建好的文库质粒再导入通用宿主Streptomyces albus J1074中进行异源表达,并用高效液相色谱(HPLC)检测突变株和野生型菌株的发酵产物。【结果】AlpR和AlpQ对醌那霉素的合成没有直接影响,但是敲除AlpRQ突变株的发酵液中醌那霉素的产量显著提高了。【结论】AlpR和AlpQ很有可能是另一Ⅱ型聚酮化合物的KS_α和KS_β,它们与AlpA和AlpB竞争共同的合成前体。本研究还证明了AlpR和AlpQ并不能替代AlpA和AlpB的功能。     

多杀菌素的生物合成

多杀菌素是一种新颖大环内酯类杀虫剂,具有对害虫高效、对环境安全、对哺乳动物低毒的优异特点。介绍了多杀菌素生物合成的步骤,及参与这些合成步骤的有关酶系统和基因簇。通过对刺糖多孢菌中多杀菌素合成基因的克隆鉴定与分析,已基本了解多杀菌素生物合成的限速步骤及相关控制基因,从而可通过遗传工程的办法改造刺糖多孢菌,提高多杀菌素的产量 。     

多杀菌素生物合成的研究进展北大核心CSCD

多杀菌素是在刺糖多胞菌发酵液中提取的一种大环内酯类生物杀虫剂,它对靶标昆虫具有独特的快速触杀和摄食毒性,兼具化学农药的速效性和生物农药的安全性,具有低残留、快速降解等优点。本文介绍了多杀菌素的生物合成途径和体外合成方法,对随机诱变、代谢工程定向改造等刺糖多孢菌工业菌株育种方法进行了介绍,对多杀菌素在异源宿主中的合成进行了讨论。     

类菌孢素氨基酸生物合成研究进展

现有的人工合成的防晒剂可能危害环境，而天然的水溶性小分子抗辐射化合物——类菌孢素氨基酸(mycosporine-like amino acids,MAAs)有望成为环境友好型防晒剂，具有广阔的应用前景。从生物体内提取的MAAs产量不足，无法满足商用需求。以合成生物学方法在宿主细胞中表达MAAs合成基因簇是解决MAAs供应不足的有效策略。本文简介MAAs的生物合成途径，总结现有MAAs生物合成研究的成果，分析探讨MAAs生物合成发展方向。     

专性海洋放线菌盐孢菌的研究进展

盐孢菌属(Salinispora)作为首个被报道的专性海洋放线菌,主要分布于热带和亚热带海洋沉积环境中,在海绵、海鞘中也有发现。与其他大多数放线菌一样,盐孢菌属的菌株可以产生大量具有抗细菌、抗病毒、抗肿瘤细胞活性、结构新颖的次级代谢产物且表现出物种特异性。全基因组序列分析显示,盐孢菌属菌株基因组中超过10%的基因序列与次级代谢产物合成相关,但绝大多数生物合成基因簇编码的产物未被发现,表明盐孢菌属还存在巨大的生物合成潜能,有待深入发掘。目前新的培养方法、测序技术及生物信息学、基因组发掘技术、合成生物学技术的发展对提升盐孢菌属菌株新型药物的生产潜力发挥重要作用。本文对盐孢菌属的物种多样性、系统分类与化合物发现等方面的研究进行了系统综述。     

基于重组氧化葡萄糖酸杆菌生物合成吡咯喹啉醌

吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone,PQQ)是一种重要的氧化还原酶辅基,具有多种生理生化功能,在食品、医药卫生及农业等领域具有广泛的应用。文中采用重组氧化葡萄糖酸杆菌生物合成吡咯喹啉醌。首先构建丙酮酸脱羧酶基因GOX1081敲除的重组菌G. oxydans T1,减少副产物乙酸的形成。然后利用筛选的内源性组成型启动子P0169融合表达pqqABCDE基因簇及tldD基因,构建重组菌G. oxydans T2。最后对发酵培养基添加物和发酵条件进行优化。结果显示重组菌G. oxydans T1、G. oxydans T2生物量较野生菌分别提高43.02%和38.76%,而PQQ的产量分别是野生菌的4.82倍和20.5倍。进一步优化G. oxydans T2碳源及培养条件,最终PQQ产量达(51.3241±0.8997)mg/L,是野生菌的345.62倍。通过基因工程手段,可以有效提高氧化葡萄糖酸杆菌的生物量和合成PQQ的产量,为改善PQQ生物合成效率奠定基础。     

HeLa细胞对竹红菌甲素摄取的直接观察与动态过程分析

利用荧光光谱测定方法和高灵敏度荧光显微镜成像技术研究了竹红菌甲素（ＨＡ）在Ｈｅｌａ细胞中的分布,动态过程及其影响因素和光敏损伤效应。结果显示：ＨＡ主要分布于细胞膜及胞浆中,只有很少量的ＨＡ进入细胞核中,细胞对ＨＡ的吸收,随着培养液中ＨＡ浓度的增大和保温时间的延长而增加,当保温时间超过１６小时,或当ＨＡ浓度达８７μｇ／ｍｌ以上时,细胞对ＨＡ的吸收呈现饱和趋势。保温时间在２４小时以内,对ＨＡ排出较快,     

竹红菌甲素引起红细胞膜蛋白的光敏交联

为了探讨竹红菌甲素对红细胞膜蛋白的光敏交联机理,我们使用了一些专一性及非专一性的基团修饰剂来修饰膜蛋白,试图说明膜蛋白的光敏交联究竟是由膜蛋白的巯基光氧化所引起的,还是膜蛋白的氨基酸与其侧链氨基之间的交联所引起的。我们分别采用N-乙基顺丁烯二酰抱亚胺(NEM)修饰膜蛋白的巯基,用N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)来修饰色氨酸残基,用乙氧甲酸酐(DEP)修饰组氨酸残基,及用琥珀酸酐(SA)修饰氨基。测定了红细胞膜修饰前后及有竹红菌甲素存在时,光照前后的膜蛋白巯基及膜氨基的变化,膜蛋白内源性荧光的变化,以及对膜蛋白形成交联的影响。结果表明:NEM、DEP和NBS修饰的膜, 在有甲素存在时,光照对巯基影响很小,而对SA修饰的膜有明显的光敏作用。甲素对膜蛋白氨基的影响小于巯基,仅降低含量20%。甲素光照能引起NEM和SA修饰的膜内源荧光下降。甲素对NEM处理的膜仍能引起交联,但SA处理过的膜能抗交联,说明氨基在膜蛋白光敏交联中起着重要的作用。     

赤霉素及竹红菌甲素荧光量子产率的常量化区域

通过对赤毒素、竹红菌甲素及苯酚量子产率的测定与比较发现,这三种荧光化合物都具有一个相对于激发波长的量子产率的稳定区域。尽管它们具有多个激发峰,但不同激发峰所激发的荧光量子产率差别较小。竹红菌甲素在室温放置一个月,690nm荧光光谱有明显的改变。以上结果提示在测定未知荧光化合物的量子产率时,被测溶液的散射较强,同时荧光物的激发与发射波长彼此相接近。量子产率较弱时,可以在最大激发峰的蓝移方向上选择激发波长来避免散射光的干扰,提高量子产率测定的准确度。竹红菌甲素在690nm的荧光肩峰,可能是分子空间结构上容易发     

竹红菌甲素对红细胞膜内脂双层的微扰

本文以荧光探针为手段,以人红细胞膜为材料,测量了膜偏振度的改变,荧光探针能量转移,荧光峰的蓝移和甲素激发峰的分裂。结果表明在有竹红菌甲素存在时,红细胞膜偏振度增加,探针荧光强度减小,荧光峰蓝移。甲素浓度增加时,上述现象更加明显,即它们之间有正的相关关系。同时,甲素激发光谱的a带发生分裂。据此,我们认为甲素对红细胞膜内脂双层产生明显微扰,甲素与红细胞膜间存在着相互作用。在甲素浓度较大时,它主要是渗入到红细胞膜脂双层的深层部位(膜脂肪酸链的12—16位)。     

类脂过氧化对竹红菌甲素引起膜蛋白光敏交联的影响

本文研究了丙二醛与红细胞膜温育后所形成的交联。当丙二醛浓度在5×10~-4mol/L以上时,膜蛋白发生交联,并且在460nm处有荧光特征峰出现。而甲素光敏所致膜蛋白的交联,在460nm处没有荧光峰,光敏所产生的内源丙二醛量很少,不足以引起红细胞膜反应形成交联。我们还研究了BHT和Vit E两种抗氧化剂对甲素光敏作用的影响。BHT能抑制类脂过氧化,不能抑制膜蛋白巯基的变化和膜蛋白的交联。而Vit E仅不能抑制膜蛋白的交联。以上结果均说明甲素光敏所致膜类脂过氧化是不参与膜蛋白交联的。     

竹红菌甲素对红细胞膜上几种酶光敏失活作用的研究

本文比较了竹红菌甲素对人红细胞膜AchE,GPDH,Na~ -K~ ATPase和Ca~(2 )-Mg~(2 )ATPase的光敏失活能力,结果表明甲素对Ca~(2 )-Mg~(2 )ATPase作用最强,Na~ -K~ ATPase次之,GPDH再次之,AchE最不敏感,甲素还引起膜蛋白巯基氧化,膜脂质过氧化。其中,巯基氧化可能是ATPase光敏失活的主要原因,而脂质过氧化对ATPase活力损伤作用不大。游离GPDH不如与膜结合的GPDH敏感。GSH,NAD分别对ATPase,GPDH有保护作用。膜蛋白的电泳及内源荧光证据表明:在GPDH活力受到严重损伤时,酶结构并未发生剧烈改变。     

竹红菌甲素对体外培养细胞光敏作用的实验研究

本文用免疫荧光细胞化学、流式荧光分析等方法研究了光敏剂H_A对培养的HeLa细胞的光敏化作用。结果表明,H_A光敏化作用使细胞形态发生变化,细胞表面微绒毛丧失,细胞增殖受到抑制,上述变化随光照剂量增加而加剧,其中对肿瘤细胞的抑制作用较正常二倍体细胞更大,细胞群体中G_1期细胞下降,S期细胞增多。H_A的光敏化作用还使胞质微管变稀疏,微管中心的亮荧光近乎消失。以上实验说明,H_A的光敏作用对培养细胞的作用引起细胞膜、细胞骨架的损伤,使细胞周期部分阻断于S期,从而抑制了细胞的增殖。     

新型光敏化剂——竹红菌甲素的抑瘤作用

 利用竹红菌甲素并结合其光敏特性进行了动物体内的抑瘤试验。发现患瘤局部表皮涂布竹红菌甲素软膏或局部皮下注射或腹腔注射甲素花生油溶液、并经光照致敏后能使小鼠S-180实体肉瘤生长减缓,甚至有个别消退。同时利用细胞培养法和~3H标记化合物参入法进行了甲素抑瘤作用的定量分析。发现作用时间固定时(光照40分钟后继续培养3小时),大于12.5ng/ml浓度的甲素能明显抑制~3H-TdR、~3H-UR和~3H-Leu对S-180肉瘤细胞的参入速率;剂量与抑制率呈正相关。据此结果求出甲素对S-180肉瘤细胞的有效抑制浓度(LD(50))为40ng/ml。光照组与无光照组差异有显著性。用Ebrlich腹水癌细胞为研究体系也得到了类似的试验结果。实验结果提示竹红菌甲素具有明显的抑瘤作用,这种作用与其光敏特性有关。     

抗氧化剂对HeLa细胞在竹红菌甲素（HA）光敏损伤下的保护作用的研究

通过细胞台盼兰拒染检测、电镜观察以及３Ｈ—Ｔｄｒ同位素掺入等方法,分别从细胞水平及分子水平上,定性定量测定了维生素Ｅ（ＶｉｔＥ）、丁羟基甲苯（ＢＨＴ）、阿魏酸钠（ＳＦ）三种抗氧化剂对于竹红菌甲素（ＨＡ）光敏所致ＨｅＬａ细胞损伤的抑制作用。结果表明：三种抗氧化剂对于细胞的损伤均有不同程度的抑制作用,其中ＶｉｔＥ的抑制作用最明显,ＢＨＴ及ＳＦ的抑制作用则较弱,提示脂质过氧化在细胞膜和细胞核损伤中起着重要的作用。     

抗氧化剂对HeLa细胞在竹红菌甲素（HA）光敏损伤下的保护作用的研究

通过细胞台盼兰拒染检测、电镜观察以及＾３Ｈ－Ｔｄｒ同位素掺入等方法,分别从细胞水平及分子水平上,定性定量测定了维生素Ｅ、丁羟基甲苯（ＢＨＴ）、阿魏酸钠（ＳＦ）三种抗氧化剂对于竹红菌甲素（ＨＡ）光敏所致ＨｅＬａ细胞损伤的抑制。结果表明：三种抗氧化剂对于细胞的损伤均有不同程度的抑制作用,其中ＶｉｔＥ的抑制作用最明显,ＢＨＴ及ＳＦ的抑制作用则较弱,提示脂质过氧化在细胞膜和细胞核损伤中起着重要的作用。