不同地区尖音库蚊复合组抗药性的分子特征

通过生物测定、蛋白质电泳和单个蚊虫基因组Southern杂交三种方法对三个不同地区的尖音库蚊复合组蚊虫Culexpipienscomplex的抗性水平、抗性相关基因在种群中的分布及抗性分子特征进行了研究。采自山东高密、北京和云南昆明的尖音库蚊复合组蚊虫 4龄幼虫对敌敌畏、对硫磷 (有机磷类 )和仲丁威 (氨基甲酸酯类 )的抗性水平的测定结果表明 :与北京敏感系相比 ,高密种群对敌敌畏、对硫磷的抗性水平很高 ,北京种群对敌敌畏的抗性水平也很高 (约 30倍 ) ,三个种群对仲丁威的抗性与北京敏感系没有明显的区别。淀粉电泳的结果表明 :高密和北京种群中存在过量产生的非特异性酯酶Estβ11,昆明种群中存在过量产生的非特异性酯酶Estα2和Estβ2 ,单个蚊虫基因组Southern杂交的结果表明 :酯酶Estβ11、Estα2和Estβ2的结构基因发生了不同程度的扩增导致酯酶的过量产生     

杭州地区尖音库蚊复合组的抗药性动态

用生物测定和淀粉电泳技术对采自杭州市和上海市的尖音库蚊复合组(Culex pipienscomplex)蚊虫的抗性水平及与抗性有关的酯酶进行了研究。抗性水平的测定结果表明:与S-LAB敏感系相比,杭州市种群对DDVP、对硫磷、毒死蜱、邻仲丁基苯基甲基氨基甲酸酯和残杀威的抗性分别是S-LAB敏感品系的3.9,7.6,1.6,1.6,2.5倍。利用淀粉凝胶电泳技术分析了野生种群中抗性羧酸酯酶(EST)等位酶的基因表型及其频率。4个种群中都存在着世界范围内广泛分布的过量产生的非特异性酯酶Estβ1和Estα2/β2,上海种群主要以高活性的酯酶Estβ11为主(98.3%),除了这些基因以外,2004年杭州市下城区又出现了1种新的酯酶基因(50%)。     

不同地区致倦库蚊种群相关酯酶 基因的特征分析

分别从广州、沙市、武汉近郊采集到致倦库蚊Culex pipiens quinquefasciatus,对单只蚊虫进行淀粉凝胶电泳和Southern杂交方法的分析结果表明：3个实验种群中均分布有与抗性有关的高活性酯酶β1¹,酯酶α2/β2分布于广州实验种群中;广泛分布于地中海地区尖音库蚊Culex pipiens种群中的酯酶α4/β4、α5/β5在以上3个种群中均不存在。但是,在3个实验种群中均发现存在有一对新的高活性酯酶α8/β8,其电泳迁移率和限制性酶切片段均与目前已报道的几种高活性酯酶不同。含这两对新酯酶的蚊虫将应进一步从种群中纯化,纯合蚊虫新品系做分子特征的研究。     

有机磷抗性致倦库蚊种群中酯酶基因扩增的定量分析

致倦库蚊Culex qinquefasciatus是丝虫病的主要传染媒介。通过生物测定、单个蚊虫酯酶α2和β2基因拷贝数分析和酯酶β基因序列比较, 分析了抗性水平、抗性相关基因在种群中的分布及其基因拷贝数等的抗性分子特征。应用快速PCR仪（realtime quantitatIve PCRs）直接检测库蚊中酯酶基因和mRNA拷贝数。结果显示：上海致倦库蚊对对硫磷的抗性LC₅₀为8.12, 酯酶活性升高是上海致倦库蚊种群对有机磷杀虫药剂产生抗性的主要机理。编码致倦库蚊酯酶β的氨基酸序列同编码尖音库蚊酯酶B1的氨基酸序列相比同源性为98%;同致倦库蚊酯酶B2氨基酸序列相比同源性为100%,同环蹶库蚊酯酶B3氨基酸序列相比同源性为90%, 上海致倦库蚊中酯酶α和β基因均扩增。有机磷抗性的上海和PellRR蚊虫种群中单个蚊虫酯酶α2 和β2定量基因拷贝数均不同,其同一蚊虫个体的酯酶α2 比酯酶β2基因的拷贝数高,但没有明显的规律性,酯酶结构基因的扩增是上海致倦库蚊种群对有机磷杀虫药剂抗性的主要机理,估计在野外种群的杂合个体中存在多种调控机制。     

几种杀虫药剂敏感蚊类酯酶多态性的研究

通过蚊虫酯酶蛋白的淀粉凝胶电泳分析和基因组DNA的限制性酶切片段长度多态性(RFLPs)比较, 对尖音库蚊Culex pipiens、三带喙库蚊Culex tritaeniorhynchus和中华按蚊Anopheles sinensis有机磷杀虫药剂敏感种群的酯酶蛋白和结构基因的多态性进行分析。发现在蛋白质水平上,三带喙库蚊敏感种群(n=54)在酯酶α和β位点分别存在2个和3个等位基因,在DNA水平上有2.9%的个体具有与酯酶β1¹基因1.3 kb Cdna片段同源的1.3 kb单拷贝带存在。发现中华按蚊敏感种群 (n= 50)中具有低活性的非特异性酯酶存在,在蛋白质水平上,酯酶α和β位点各有一个等位基因;在DNA水平上,通过对单个蚊虫基因组DNA的研究未发现有与酯酶β1¹基因同源的酯酶编码基因的存在。对尖音库蚊北京敏感种群(n= 64)的研究发现,在酯酶α和β位点都存在5个等位基因,在DNA水平上,使用一个限制性内切酶(EcoRI),15只蚊虫的样本在酯酶β位点发现了5个等位基因,说明在尖音库蚊北京敏感种群的酯酶β基因周围存在着较大的中性多态性,在有机磷杀虫剂的选择下,这些中性多态性可能会成为基因扩增的潜在因素。     

不同地理种群尖音库蚊复组抗性动态和遗传多样性

通过生物测定、蛋白质电泳和等位酶分析等方法对5个不同地区的尖音库蚊复组蚊虫Culex pipiens complex的抗性水平、种群中非特异性酯酶基因表型分布和种群遗传多样性进行了研究。不同地理种群的抗性检测结果表明：5个种群分别对敌敌畏、对硫磷、氯菊酯和溴氰菊酯的抗性较高,对残杀威、巴沙和胺菊酯的抗性较低;朝阳种群对敌敌畏抗性最高（55.7倍）,武汉种群次之;佛山种群对氯菊酯和溴氰菊酯的抗性比率高达123倍和23.9倍。酯酶电泳结果显示：5个种群间酯酶多态性存在差异,广州和佛山两个库蚊种群酯酶表型多态性最高,有B1,A2-B2,A8-B8,A9-B9,B10和A11-B11等6种酯酶表型,提示高活性酯酶是主要的抗性机制。群体遗传学研究表明：每位点平均等位基因数（A）为2.76,平均多态位点百分率（P）为64.45％,平均预期杂合度（He）为0.1943,种群间遗传分化系数（Fst）值为0.10,平均基因流(Nm)＝2.57,说明5个种群有较丰富的遗传多样性,种群内遗传多样性高于种群之间。据此推测,种群间可以通过迁徙等方式进行基因交流,使得遗传结构、抗性水平朝一致性方向变化。本研究对我国尖音库蚊复组蚊虫的综合治理有一定指导意义。     

库蚊野生种群扩增等位基因重组现象分析

羧酸酯酶 (carboxylesterases)的过量产生是库蚊Culexpipiens对有机磷杀虫剂 (OP)产生抗性的主要机制。由est 3和est 2组成的酯酶超级基因座 (estersuper locus)的基因扩增是引起酯酶基因扩增的主要遗传学基础。通过淀粉电泳研究了采自广州、佛山、郑州的库蚊野生蚊虫种群 ,发现在这些种群中存在着扩增等位基因重组现象。该现象可能是蚊虫受到杀虫药剂的选择压力、等位基因多样性和等位基因型频率的影响。这将提供一个研究抗性进化的自然模型。     

抗性库蚊酯酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

用抗性库蚊酯酶基因,引入原核表达载体pRL439,转化大肠杆菌HB101细胞,获得表达。通过酶切、Southern杂交鉴定重组质粒。研究了重组菌酯酶的活性,重组质粒pRLB1表达的酯酶具有高酶活并能高效降解酯酶的特异性底物α乙酸萘酯(αNA)和β乙酸萘酯(βNA);经对重组菌进行细胞固定化后降解农药三氯杀虫酯(7504),反应时间短,降解效率高     

库蚊中抗性相关酯酶的研究进展

世界范围内普遍分布的库蚊是丝虫病的主要媒介,其存在极大地危害着人畜的健康。随着杀虫剂的广泛使用,该蚊抗性正日益增强;其中,非特异性酯酶活性升高是其对有机磷杀虫药剂（OP）产生抗性的主要机制。在尖音库蚊＠lexP巾lensfirm。。中,非特异性酯酶B活快升高是由于酯酶结构基因大量扩增,相应地大量表达酯酶而造成的（关于这方面的研究进展后振华先生1993年［’l就已作过综述）。本文仅介绍尖音库蚊抗性相关酯酶基因扩增研究方面的一些新进展。！与抗性相关的酯配基因应直到本世纪70年代末80年代初人们才发现尖音库蚊的酯酶活性升高…     

被动迁移在抗性进化中的作用

为了明确迁移和基因交流在杀虫剂抗性基因进化中的作用,我们从四个不同的地区采集有机磷抗性的库蚊野生种群,利用淀粉电泳鉴定了各种群中存在的已知过量产生酯酶的分布频率,并通过5个假定的中性位点的电泳多态性分析了种群间的遗传多样性。结果表明种群间的基因交流是存在的,遗传分化与地理位置存在一定关系,而抗性等位基因A2一B2的分布却与种群间的遗传分化不一致。对这种差异的解释是：被动迁移(铁路运输等)加速了抗性基因的交流,而当抗性基因以自然迁飞的方式向周围地区扩散时,却是一个相对缓慢的过程。     

我国尖音库蚊复合组蚊虫的杂交及其与Wolbachia感染的关系

为了了解我国尖音库蚊复合组蚊虫间杂交卵的不孵化现象和明确该现象与共生微生物Wolbachia感染的关系,对该复合组实验室种群4个亚种进行了笼内杂交和抗生素处理后的杂交。试验表明: 在复合组蚊虫中骚扰库蚊Culex pipiens molestus与淡色库蚊Cx. Pipiens pallens、致倦库蚊Cx. Ipiens quinquefasciatus与尖音库蚊Cx. Pipiens pipiens之间存在有单向胞质不融合现象,骚扰库蚊的雄虫与尖音库蚊、致倦库蚊和淡色库蚊的雌虫杂交卵的孵化率分别为0.06%、0.46%和0.19%;该胞质不融合现象可以通过抗生素处理而消除,处理后骚扰库蚊雄虫与其余3个亚种雌虫F₃杂交卵的孵化率均有提高,分别为89.49%（t=3.90×10^-28＜t_0.01=2.704）、23.39%（t=9.15×10^-7＜t_0.01=2.660_）和22.27%（t=5.08×10^-4＜t_0.01=2.750）,并可因抗生素处理而产生新的不融合类型。     

淡色库蚊 (Culex pipiens pallens Coquillett)的抗性酯酶表现型及其在杀虫剂压力下的变化趋势(英文)

对来自杭州、临海和金华三个城市的淡色库蚊种群进行了抗性酯酶表现型频率分布的测定和分析 ,同时对三个种群进行双硫磷、敌百虫、毒死蜱和马拉硫磷等四种有机磷杀虫剂的抗性品系筛选 ,逐代测定和分析各种群在不同杀虫剂压力下 ,其抗性酯酶表现型频率分布的变化。结果表明 ,三个自然种群中都存在酯酶B1 、B2 纯合表现型及酯酶B1 /B2 杂合表现型 ,其中酯酶B1 纯合表现型占优势。各自然种群中的抗性酯酶表现型频率分布有差异。经过杀虫剂的逐代筛选 ,各种群相对于某一杀虫剂的压力 ,表现出选择较为单一的抗性酯酶表现型的趋势 :双硫磷有利于酯酶B1 纯合表现型的选择 ,敌百虫和毒死蜱有利于酯酶B2 纯合表现型的选择 ,马拉硫磷则似乎有利于酯酶B1 纯合表现型和酯酶B1 /B2 杂合表现型的选择 ,但酯酶B1 纯合表现型相对于B1 /B2 杂合表现型来说 ,对马拉硫磷抗性更强一些。根据研究结果 ,就蚊虫的抗性酯酶基因对不同杀虫剂的选择优势及相应的蚊媒控制策略进行了讨论。     

不同地域有机磷杀虫药剂抗性库蚊复合组酯酶B1扩增的研究

在库蚊Culex pipiens品系中,非专一性酯酶的过量产生是对有机磷杀虫药剂抗性的普遍机理。酯酶基因位于紧密连锁的A和B座位上。现已知所有酯酶B的过量产生都是基因扩增的结果。为了确定不同国家库蚊品系的酯酶B1的过量产生是否都是相同DNA单基因型扩增的结果,我们构建了酯酶B1结构基因扩增区的限制性内切酶酶切图谱,分析了限制性酶切片段长度多态性(RFLP)。研究发现不同地理位置的酯酶B1库蚊,如法属圭亚那,委内瑞拉、波多黎各岛、美国加利福尼亚和中国北京,都有着相同的单基因扩增,但在扩增水平上有较大的差异。我们认为无论在美洲或亚洲,凡是酯酶B1扩增的库蚊都为同一个起源,之后经迁移而传播到各地;同时发现酯酶B1扩增的库蚊与酯酶A2一B2扩增的库蚊相比,其迁移有一定的局限性;并且酯酶B1扩增的库蚊仅仅限于美国、加勒比和中国的一些地区,而酯酶A2-B2扩增的库蚊则广泛地分布于美国、加勒比、亚洲、非洲、太平洋各岛及欧洲等地。     

解毒酶基因在蓝藻中的克隆与表达

用抗性库蚊酯酶基因B1的cDNA片段插入质粒pRL-439中的强启动子之后,再与穿梭表达载体pDC-8相连构建成大肠杆菌蓝藻穿梭表达载体pDC-B1,然后通过三亲接合转移法将pDC-B1转入蓝藻Synechococcus sp. PCC7942中,经新霉素筛选获遗传稳定的转基因藻株;纯化单藻落在液体中扩大培养,提取蓝藻质粒,Southern杂交确证B1cDNA已转入受体细胞;用酯酶的特异性底物β-乙酸萘酯(β-NA)检测B1的表达,转基因藻对β-NA的降解明显高于野生藻,证明酯酶B1基因在转基因藻中得到表达。     

淡色库蚊酯酶等位基因及其在自然种群中的频率分布

酯酶基因扩增所产生的酯酶活性升高是库蚊Culex pipiens对有机磷杀虫剂抗性的主要机理之一。采用分子杂交技术和限制性酶切片段长度多态性(RFLP)分析,已鉴定出多种酯酶等位基因类型。该文通过酯酶基因特异性片段的PCR扩增及扩增片段的酶切片段分析,对淡色库蚊Culex pipiens pallens四种有机磷抗性品系的酯酶等位基因进行分型,并测定分析自然种群中不同酶型的频率分布。研究结果表明：PCR分型方法具有快速、准确的特点。不同的有机磷杀虫剂对酯酶等位基因具有明显的选择作用。双硫磷品系为B₁型;毒死蜱和敌百虫品系为B₂型;马拉硫磷品系为B₁型和B₁/B₂杂合型。不同地区采集的种群表现出不同的酶型频率分布。该文就杀虫剂对酯酶等位基因选择作用及自然种群的酶型频率分布进行了讨论。     

库蚊羧酸酯酶研究进展

在昆虫对有机磷杀虫剂抗性的研究中 ,羧酸酯酶 (ｃａｒｂｏｘｙｌｅｓｔｅｒａｓｅｓ)的过量产生是库蚊对有机磷杀虫剂 (ＯＰ)产生抗性的主要机制。羧酸酯酶能够与进入昆虫体内的有机磷杀虫剂快速结合 ,将杀虫剂在到达靶标作用位点前阻隔或降解 ,使其无法发挥原有的杀伤效用。1 .羧酸酯酶的命名库蚊中羧酸酯酶的命名一般根据其水解α 和 β 乙酸萘酯的先后顺序和电泳迁移率不同而定 ;在淀粉电泳中 ,当等量α 乙酸萘酯(α ＮＡ)和 β 乙酸萘酯 (β ＮＡ)同时存在时 ,优先水解α ＮＡ呈蓝色的为酯酶Ａ ,优先水解 β ＮＡ呈红色的为酯酶Ｂ[1] …     

鸭儿湖摇蚊复组种群酯酶多态性的研究

应用淀粉凝胶电泳研究了从湖北鸭儿湖污染区采集的较耐污染的摇蚊复合组幼虫,结果发现：在取样种群中存在高活性的β酯酶（EST）,其电泳迁移率与致倦库蚊实验参考系均不同;从甘油醛－3－磷酸脱氢酶（GPD）染色结果发现,其酶谱与已报道的库蚊GPD染色结果有很大不同,在污染最重的1号氧化塘的摇蚊复合组幼虫的GPD没有表达;但在中度污染的2、3号氧化塘中,摇蚊复合组幼虫GPD位点呈现明显多态现象。群体遗传学分析结果表明,取样种群由于杂合子不足造成种群偏离哈迪－温伯格平衡。所分析的2号、3号、4号塘三个亚种群之间遗传差异不显,有效迁移个体数比较少,亚种群间基因流动少。     

新疆棉铃虫对溴氰菊酯和硫丹 抗性的生化机理研究

通过生物测定和生化分析研究了新疆棉铃虫Helicoverpa armigera (Hübner)敏感种群和室内筛选获得的抗性种群对硫丹和溴氰菊酯的反应及其α-乙酸萘酯酶和乙酰胆碱酯酶的动态活性反应。结果表明,筛选后新疆棉铃虫对硫丹和溴氰菊酯产生的抗性倍数分别为13倍和66倍。两个抗性种群的α-乙酸萘酯酶和乙酰胆碱酯酶比活力均高于敏感种群。相应杀虫剂预处理后,α-乙酸萘酯酶酶活力受到抑制。抗性种群的α-乙酸萘酯酶对底物的亲和力高于敏感种群,但Vmax低于敏感种群。抗性种群的乙酰胆碱酯酶对底物的亲和力显著低于敏感种群,Vmax比敏感种群高。聚丙烯酰胺凝胶电泳显示,两个抗性种群都有一条特异性酶带,其迁移率相近,且均可被甲基对氧磷抑制。因此推测,α-乙酸萘酯酶参与了新疆棉铃虫对硫丹和溴氰菊酯的抗性,具有代谢和阻断作用;乙酰胆碱酯酶对抗性的产生也起到了重要作用。     

一个致倦库蚊杀虫剂敏感品系的筛选

化学防治是控制蚊虫传播疾病的主要方法, 抗性监测表明我国蚊虫已对有机磷、 有机氯、 氨基甲酸酯和拟除虫菊酯类杀虫剂产生了不同程度的抗性。蚊虫抗药性的分子机制主要包括靶标抗性和三大解毒酶家族带来的代谢抗性。筛选对杀虫剂敏感的品系是抗性监测和抗性机理研究必不可少的材料。本研究通过从一个致倦库蚊Culex pipiens quinquefasciatus野生种群筛选无乙酰胆碱酯酶G119S突变且具有低活性羧酸酯酶、 P450单加氧酶和谷胱甘肽-S-转移酶的单雌系, 建立了一个对杀虫剂敏感的致倦库蚊品系。该品系的羧酸酯酶活性是敏感品系S-lab的2.5倍, P450单加氧酶和谷胱甘肽-S-转移酶的活性与S-lab相当。生物测定表明, 与S-lab相比, 该品系对有机磷杀虫剂有低于2倍的抗性, 对氨基甲酸酯和拟除虫菊酯类杀虫剂没有抗性, 可以作为相对敏感品系用于抗性监测。     

高酯酶活性工程菌的构建及其对有机磷农药的降解

将抗性库蚊解毒酶酯酶B1基因片段引入融合表达载体pThioHisA中,转化入大肠杆菌DH5α,在IPTG诱导下,经过8 h,酯酶B1在大肠杆菌中获得融合高效表达,目的蛋白占菌体总蛋白的48.7%.重组质粒pThioHiA-B1表达的酯酶融合蛋白具有较高的酯酶B1活性,能高效降解酯酶的特异性底物β-乙酸萘酯(β-NA),并在37℃、pH7.5的条件下,2h内对1000mg/L的甲基对硫磷降解率达81%.