重组七鳃鳗细胞毒素蛋白rLj-RGD3表达及对Hela细胞活性的影响

为研究重组七鳃鳗细胞毒素蛋白rLj-RGD3的抗肿瘤活性,确定其生物学地位及意义,本研究提取成体七鳃鳗(Lampetra japonica)口腔腺组织总RNA,经RT-PCR获得cDNA序列长度为357bp的目的基因片段,将其克隆于pET23b载体,获得带有组氨酸标签的分子量为15kD的基因重组蛋白rLj-RGD3的高效可溶性表达,通过组氨酸亲和层析纯化蛋白。采用MTT法检测不同浓度rLj-RGD3对bFGF诱导下的Hela细胞增殖的抑制作用,结果表明rLj-RGD3能显著抑制Hela细胞的增殖,IC50为2.6μmol/L。rLj-RGD3作用后的Hela细胞经Hoechst染色及DNAladder检测结果显示,细胞均发生凋亡。rLj-RGD3对Hela细胞黏附玻连蛋白(VN)作用的实验结果为有效抑制。采用Transwell细胞培养板对bFGF诱导下的Hela细胞迁移实验表明,rLj-RGD3能够抑制Hela细胞的迁移,且抑制率达60%。采用人工基质膜基质Matrigel及Transwell模仿体内环境研究rLj-RGD3对Hela细胞浸润行为实验显示,以bFGF为趋化剂的Hela细胞穿透Matrigel的...     

重组七鳃鳗富含半胱氨酸RGD蛋白rLj-RGD1对人肝癌HepG2细胞的抑制作用

rLj-RGD1为源于日本七鳃鳗口腔腺的基因重组蛋白,其富含半胱氨酸并具有一个RGD(Arg-Gly-Asp)模体.前期工作表明,rLj-RGD1具有抑制血小板聚集及血管新生的RGD毒素蛋白典型功能.为了研究rLj RGD1是否具有RGD毒素蛋白的另一典型抗肿瘤功能,以人肝癌HepG2细胞为模型,对rLj RGD1进行了活性研究.MTT法结果显示,rLj-RGD1呈剂量依赖方式抑制HepG2细胞的增殖,其半抑制浓度(IC50)为36 μmol/L;细胞迁移与浸润实验结果显示,rLj-RGD1能以剂量依赖方式抑制HepG2细胞碱性成纤维生长因子（bFGF）诱导的迁移与浸润.Hoechst染色和DNA Ladder等细胞凋亡实验表明,rLj-RGD1能够以剂量依赖方式诱导HepG2细胞发生凋亡.细胞黏附实验表明,rLj-RGD1以剂量依赖方式抑制HepG2细胞与玻连蛋白(vitronectin, VN)的黏附.上述结果表明,rLj-RGD1具有抑制人肝癌HepG2细胞增殖、迁移和浸润的功能,并可诱导其发生失巢凋亡. 本研究结果提示,rLj-RGD1具有典型的RGD毒素蛋白抗肿瘤功能,其未来具有成为抗肿瘤药物的潜力.     

重组肽rLj-RGD4对小鼠黑色素瘤B16细胞活性的影响

该研究在前期重组日本七鳃鳗RGD3毒素蛋白(recombinant Lampetra japonica RGD3,rLj-RGD3)工作基础上,设计并人工合成分子克隆,获得去纯化标签的rLj-RGD4。该论文采用小鼠黑色素瘤(B16)为肿瘤细胞模型,对rLj-RGD4是否抑制B16细胞增殖、迁移、浸润与凋亡进行了研究。研究结果表明,采用不同浓度的rLj-RGD4经MTT方法检测发现,rLj-RGD4对B16细胞的增殖有抑制作用,IC50为9.6μmol/L;使用Transwell法和细胞划痕实验结果证实,rLj-RGD4对B16细胞的迁移和浸润都具有抑制作用,且呈剂量依赖方式;B16细胞经鬼笔环肽-FITC染色结果显示,rLj-RGD4肽对B16细胞骨架发生破坏;Hoechst 33258法和TUNEL-FITC法结果显示,rLj-RGD4可诱导B16细胞发生凋亡;运用Western blot对其诱导B16细胞发生凋亡的作用机制研究结果显示,随着rLj-RGD4浓度的增加cleaved-caspase-8和cleaved-caspase-3的水平显著增加,B淋巴细胞瘤-2(B cell lymphoma/leukaemia-2,Bcl-2)基因水平量显著减少。由此可见,rLj-RGD4具有显著促B16细胞凋亡的作用,具有抑制增殖与侵袭的功能,有可能成为一个具有抗肿瘤作用的候选药物。     

rLj-RGD3全RGD缺失基因重组突变体——rLj-112的分子克隆及其广谱抑真菌活性

Lj-112是日本七鳃鳗RGD毒素蛋白野生型Lj-RGD3的RGD全缺失基因突变体,其一级结构具有富组氨酸的特点．富组氨酸糖蛋白具有抑菌功能．为了研究Lj-112是否具有抑菌作用,使用基因合成和原核表达的方法,获得了纯化重组蛋白rLj-112,将其对不同菌种进行抑菌试验.结果表明,以野生型rLj-RGD3、RGD模体与组氨酸全缺失突变体rLj-26为对照,rLj-112有较广谱的抑菌活性,其中对白念球菌的最低抑菌浓度（MIC）为7 μmol/L,对稻瘟病菌的MIC值为7.5 μmol/L,对毛癣菌和禾谷病菌的MIC值分别为11.9 μmol/L和29.9 μmol/L．可见,rLj-112能作为抗真菌药物候选,为提高农作物的生产质量和减轻人类感染疾病的用药压力奠定了基础．     

骆驼蓬籽蛋白提取物体外抑癌活性的研究

目的:探讨骆驼蓬籽蛋白提取物的体外抑癌活性.方法:采用MTT法检测硫酸铵沉淀的骆驼蓬籽蛋白提取物体外抗肿瘤活性,应用流式细胞术和Annexin V/PI双荧光染色法检测其对细胞凋亡的影响.结果:80%硫酸铵饱和度下的蛋白提取物对宫颈癌HeLa、食道癌Ecal09和肝癌BEL-7404细胞的IC50分别为72.11±3.88μg/mL、257.58±1.16μg/mL和174.07±1.32μg/mL.对HeLa细胞的抑制率与空白对照组相比有显著性差异(P＜0.01),呈现较好的量效关系,且有促进细胞凋亡的作用.结论:骆驼蓬籽蛋白中对HeLa细胞增殖具有较好的抑制活性,可能是通过诱导细胞凋亡来发挥其抗肿瘤作用.     

日本七鳃鳗Arg-Gly-Asp毒素蛋白Lj-RGD3野生型与RGD全缺失突变体Lj-112的抗血管新生作用

七鳃鳗Arg-Gly-Asp (RGD) 毒素肽Lj-RGD3与富含组氨酸糖蛋白HRG具有序列同源性,而RGD毒素蛋白及HRG都具有抑制血管新生的活性,但作用靶点不同。为研究Lj-RGD3结构与功能的关系,对野生型Lj-RGD3及其RGD全缺失突变体Lj-112进行了抗血管新生功能研究。将3个RGD模体的全缺失突变体基因Lj-112全序列合成后构建于pET-23b载体,对野生型Lj-RGD3及突变体 Lj-112蛋白进行IPTG诱导表达,重组蛋白经组氨酸亲和层析纯化;采用MTT法测定野生型和突变体蛋白对人     

三叶因子Bm-TFF2突变体在原核体系中的表达及促细胞迁移活性

大蹼铃蟾三叶因子Bm-TFF2具有较人TFF2更强的促细胞迁移和抗凋亡活性。该研究利用RT-PCR方法扩增得到野生型Bm-TFF2的基因,然后分别构建N端、C端和分子中两个精氨酸突变的突变体,最后连接表达载体产生pET32a(+)/Bm-TFF2突变型重组质粒,转入大肠杆菌中,经37℃培养,IPTG诱导,其融合蛋白主要存在于包涵体中,用组氨酸标签的亲合柱纯化溶解后的包涵体上清,进一步用RP-HPLC纯化得到硫氧还蛋白(TRX)/Bm-TFF2突变型融合蛋白。通过SDS-PAGE和Westernblotting检测分析其纯度和特异性。最终,从1L培养基中得到20mg纯度为95%的三种重组突变型融合蛋白。三种突变型重组蛋白都具有剂量依赖性的促细胞迁移活性,并且其活性无显著差异。该研究为进一步研究Bm-TFF2结构和功能的关系以及揭示其作用的分子机制奠定了基础。     

重组蛋白rLj-112对人非小细胞肺癌A549细胞增殖、迁移和凋亡的影响及其机制研究

该文研究了重组蛋白r Lj-112对人非小细胞肺癌A549细胞增殖、迁移和凋亡的影响及其作用机制。采用MTT(四甲基偶氮唑蓝)法检测r Lj-112对人非小细胞肺癌A549细胞增殖的影响,采用Transwell方法检测r Lj-112对A549细胞迁移和侵袭的影响,Hoechst和吉姆萨染色的方法检测r Lj-112对A549细胞凋亡的影响;采用Western blot法检测r Lj-112对A549细胞信号通路相关蛋白质水平的影响。结果表明,r Lj-112能够抑制A549细胞的增殖,半抑制浓度IC50值为1.64μmol/L;r Lj-112能抑制A549细胞的迁移和侵袭并呈剂量依赖性;r Lj-112能诱导A549细胞的凋亡;r Lj-112处理过的细胞cleaved-caspase3蛋白质和cleaved-PARP蛋白质水平升高,证明r Lj-112通过caspase3/PARP途径执行对A549细胞的凋亡的诱导,p-AKT、p-PI3K和p-Erk1/2的水平下降,提示r Lj-112的作用方式与PI3K/AKT相关信号通路有关。     

人朊蛋白不同N-糖基化修饰突变体的构建及其在哺乳动物细胞中表达

构建并表达人朊蛋白N-糖基化修饰位点突变的真核表达载体,有助于进一步研究朊蛋白N-糖基化修饰的生物学功能。定点突变野生型人朊蛋白基因PRNP,将获得的突变体亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1中,并在人宫颈癌细胞株HeLa中瞬时表达各种朊蛋白糖基化修饰位点突变体,利用免疫印迹和糖苷酶消化等糖蛋白分析方法鉴定表达产物的糖基化形式。经Western blot鉴定,野生型和突变型朊蛋白表达产物出现不同形式的泳动特征,分别出现特异性糖基化修饰的多个条带,单糖基化修饰的两条条带和无糖基化修饰的一条条带。经PNGase F糖苷酶消化,野生型和糖基化单点突变型表达产物均能被糖苷酶消化,其分子量下移,去糖基化突变型表达产物的分子条带位置不变。通过突变野生型人朊蛋白基因PRNP的N-糖基化修饰位点,获得单糖基化修饰和去N-糖基化修饰的6种人朊蛋白突变体,并能够在HeLa细胞株中瞬时表达单糖基化修饰和去N-糖基化修饰朊蛋白,为进一步研究朊蛋白的相关功能建立良好基础。     

PFKFB3参与了11'-deoxyverticillin A(C42)诱导的HeLa细胞自噬和凋亡

摘要:【目的】明确糖酵解调节基因PFKFB3参与11-脱氧轮枝菌素A(11'-deoxyverticillin A,C42)诱导HeLa细胞自噬和凋亡中的作用。【方法】利用电镜、荧光显微镜、蛋白免疫杂交、转染、MTS 活性检测、siRNA干扰、定量RT-PCR等对C42处理的HeLa 细胞自噬和凋亡情况进行了检测。【结果】C42能够引起HeLa细胞不同的死亡。敲降自噬关键基因BECN1或LC3后,明显增加PARP-1的切割和促进C42引起的细胞活性丢失。尽管高浓度C42能更明显地抑制细胞增殖,但却不能增加细胞的自噬流;C42促进的自噬能被糖酵解调节基因PFKFB3的抑制剂所降低;而过量表达糖酵解调节基因PFKFB3能促进细胞自噬。【结论】糖酵解调节基因PFKFB3直接参与了C42诱导的HeLa细胞自噬,这种自噬的发生抑制了其诱导的细胞凋亡。     

DNA损伤诱导的长链非编码RNA-UCA1促进HeLa细胞增殖

尿路上皮癌抗原1 (UCA1)是一种长链非编码RNA,在多种肿瘤内高表达.然而,其在宫颈癌细胞和组织中的表达报告颇不一致,且功能尚未确定.本文探索UCA1在宫颈癌HeLa细胞中的生物学功能.实时定量PCR（qRT-PCR）结果显示,UCA1、p21和p53 mRNA在阿霉素（doxorubicin,DOX）或γ射线照射的HeLa细胞中表达上调|相反,敲减p53表达则可抑制DOX诱导的UCA1上调.表明DNA损伤诱导的UCA1可能与p53有关.转染结合CCK8检测HeLa细胞增殖活力结果显示,与对照比较,过表达UCA1促进HeLa细胞增殖,干扰UCA1表达则减缓细胞增殖.此外,流式细胞术结果显示,过表达UCA1导致阿霉素诱导的凋亡率下降;siRNA抑制UCA1表达后引起细胞G2/M期比例上升,S期下降,且阿霉素诱导的细胞凋亡率上升.上述结果说明,DNA损伤诱导的UCA1可促进HeLa细胞增殖,减少细胞凋亡.然而,是否DNA损伤诱导的UCA1上调依赖p53尚需进一步实验证明.     

葡萄球菌肠毒素 B 突变体的构建及其抗肿瘤活性分析

目的：通过对葡萄球菌肠毒素B（SEB）32位His进行定点突变,获得抑瘤效果显著增强的SEB突变体。方法：利用基因定点突变的方法,将SEB的32位His替换为Asn,将重组质粒转入大肠杆菌中诱导表达,用CM弱阳离子层析柱纯化获得重组蛋白,用SDS-PAGE和Western印迹对其进行鉴定,并用增殖实验检测其丝裂原活性,通过MTS法检测其体外抗肿瘤活性。结果：构建并高效表达了突变体蛋白SEB（H32N）,纯化获得了足够纯度的突变体蛋白;体外实验表明,在相同浓度下,SEB（H32N）的丝裂原活性及体外抗肿瘤活性明显优于野生型SEB。结论：同野生型SEB相比,突变体蛋白SEB（H32N）对肿瘤生长的抑制作用得到了提高。     

Sulfiredoxin基因敲低对HeLa细胞恶性生物学行为的影响

Sulfiredoxin（SRX)作为一种重要的抗氧化蛋白质,最近研究发现其对某些肿瘤细胞生物学行为及细胞恶性转化有重要作用,而SRX对宫颈癌细胞恶性生物学行为有何影响尚未见报道.本研究选取宫颈癌HeLa细胞株,分别设为Wild-type（WT）组,Non-target（NT）组,Knock-down（KD）组. 利用siRNA技术干扰SRX基因在HeLa细胞中的内源性表达,采用MTT法、平板克隆形成实验、Transwell实验、流式细胞术分别检测肿瘤细胞增殖力、浸润、迁移能力、细胞凋亡情况,并分别用3组HeLa细胞上清液处理人脐静脉内皮细胞,观察各组条件培养基对内皮细胞血管形成能力的影响.结果表明,与两对照组比较,SRX干扰组细胞增殖力、浸润、迁移力显著降低,且干扰组上清使内皮细胞体外血管形成能力也明显下降（P<0.05）,而凋亡率则明显增加（P<0.05）.而两对照组之间结果均无显著差异（P>0.05）.实验结果表明,SRX基因对宫颈癌HeLa细胞恶性生物学行为具有促进作用,说明SRX可能与宫颈癌恶性进展有密切关系.     

Ⅰ型磷酸酶抑制亚基-1对人宫颈癌HeLa细胞增殖的抑制作用

PPI1(Inhibitor-1 ofprotein phosphatase 1)是I型磷酸酶的抑制亚基之一,其活化依赖于35位苏氨酸蛋白激酶(PKA)的磷酸化而发挥抑制作用.本研究目的在于探讨PPIl持续活化型突变体的表达对人宫颈癌细胞株增殖的影响及其可能的作用机制.利用PPI1野生型和活化型突变体表达质粒分别转染HeLa细胞,首先通过H~3TdR掺入实验、迁移实验观察PPI1基因对HeLa细胞增殖能力的影响,研究结果表明:在活化型突变体表达的HeLa细胞株中,细胞~3H掺入量和迁移能力明显受抑.其次通过流式细胞术、Giemsa染色法分析PPIl对HeLa细胞的细胞周期的影响;FACS分析表明HeLa细胞G2/M期比例明显升高;经脱氧胸苷同步化后,该组细胞进入有丝分裂期明显滞后.最后利用Western blot分析PPI1对MAPK信号转导通路的影响,Western blot分析显示该组细胞的ERK磷酸化水平明显下降.研究表明PPI1活化型突变体的表达可抑制人宫颈癌细胞株的增殖,这与其诱导HeLa细胞G2/M期停滞、有丝分裂的进入延缓有关,其中涉及到MAPK信号转导通路的活化受抑制.     

半乳糖凝集素-3(galectin-3)基因沉默对Eca109人类食管癌细胞的影响

半乳糖凝集素-3(galectin-3)是一种多功能的β-半乳糖苷结合凝集素,涉及包括细胞生长、粘附、增殖、进展、转移以及凋亡等多种生物学功能,在恶性肿瘤中高表达。以前的研究已经证实了galecin-3过表达在Eca109人食管癌细胞的生物学作用。本研究试图通过进行小干扰RNA(siRNA)介导的galectin-3沉默,以分析galectin-3沉默对食管癌细胞生物学行为的影响。我们采用Western blotting和RT-qPCR被用来证实在蛋白质和mRNA水平上的galectin-3低表达,使用细胞计数试剂盒-8评估细胞增殖,用Annexin V-PE/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒和流式细胞术检测Eca109细胞的凋亡。研究结果表明,转染后72 h,si Gal-3组Eca109细胞增殖明显低于siRNA对照组和未处理组(p<0.001)。Transwell实验结果显示,与其他组相比,galecin-3的抑制作用显著降低Eca109细胞的迁移和侵袭能力(p<0.05)。与siRNA-对照组和未处理组相比,galectin-3敲低显著增加Eca109细胞的凋亡率(p<0.05)。敲低Eca109细胞中galecin-3的表达后,细胞增殖、迁移和侵袭能力下降,而细胞凋亡增强,说明galectin沉默可作为食管癌治疗的新策略。     

A recombinant trans-membrane protein hMnSOD–R9 inhibits the proliferation of cervical cancer cells in vitro

Human manganese superoxide dismutase (hMnSOD) is a new type of cancer suppressor. Nonamer of arginine (R9) is an efficient protein transduction domain (PTD). The aim of the study was to improve the transduction efficiency of hMnSOD and investigate its activity in vitro. In this study, we designed, constructed, expressed, and purified a novel fusion protein containing the hMnSOD domain and R9 PTD (hMnSOD–R9). The DNA damaged by Fenton’s reagent was found to be significantly reduced when treated with hMnSOD–R9. hMnSOD–R9 fusion protein was successfully delivered into HeLa cells. The MTT assay showed that proliferation of various cancer cell lines were inhibited by hMnSOD–R9 in a dose-dependent manner. In addition, the cell cycle of HeLa cells was arrested at the sub-G0 phase by hMnSOD–R9. hMnSOD–R9 induced apoptosis of HeLa cells in a dose-dependent manner. With hMnSOD–R9 treatment, Bax, JNK, TBK1 gene expression was increased and STAT3 gene expression was gradually down-regulated in HeLa cells. We also found that apoptosis was induced by hMnSOD–R9 in HeLa cells via up-regulation of cleaved caspase-3 and down-regulation phospho-STAT3 pathway. These results indicated that hMnSOD–R9 may provide benefits to cervical cancer treatment.