蛛丝蛋白研究及其应用前景

蛛丝是由高度特化的上皮细胞分泌的多聚蛋白纤维组成的,这些多聚蛋白质纤维又是由存在着高度重复序列的水溶性的蛋白单体聚合而成的,蛛网牵引丝的强度,韧性和模系数都可与人工合成的高性能的纤维相媲美,故称生物钢,已经在哺乳动物细胞中获得表达的有60,110和140kD等几种不同分子量的重组蛛丝蛋白,而且表达的这些重组蛋白质都是分泌性的,利用表达的这些重组蛋白质经过抽丝和牵拉等工艺之后获得的人造蛛丝具备了天然蛛丝的各项机械性能,作为一种新兴的生物材料,具有巨大的开发应用前景。     

高分子量RGD-蛛丝蛋白重组体的构建、高密度发酵及纯化

蜘蛛丝是自然界综合性能优良的天然蛋白质纤维之一,因其具有良好的生物相容性和可降解性在生物医学领域具有潜在的应用前景。在本室已经构建的RGD-蜘蛛拖丝蛋白基因16多聚体基础上,通过首尾相连、倍加等方法进一步多聚化,得到RGD-蜘蛛拖丝蛋白基因32和64多聚体,分别将这两种多聚体与原核高效表达载体pET-30a( )连接,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,得到的32多聚体表达重组子命名为pNSR32,64多聚体表达重组子命名为pNSR64。通过酶切、琼脂糖电泳鉴定及对目的片段的测序均与理论值相符。将32和64多聚体基因序列注册GenBank,序列号分别为DQ469929和DQ837297。重组体pNSR32和pNSR64经IPTG诱导表达,SDS-PAGE图谱显示表达产物分子量分别为102kD和196.6kD,与天然蛛丝蛋白分子量接近并与理论值相吻合。高分子量的蛛丝蛋白在原核生物成功实现高效表达,在国内外尚未见报道。在此基础上对pNSR32工程菌进行高密度发酵,建立了简单高效的目的蛋白纯化工艺。     

乳糖诱导高分子量重组蛛丝蛋白发酵培养基优化

在M9培养基的基础上,以乳糖为诱导剂,对基因重组蛛丝蛋白工程菌pNSR32/BL21(DE3)的发酵培养基进行了优化。利用单因子实验和正交试验优化出表达高分子量重组蛛丝蛋白的最优培养基配方,结果表明：优化的碳源为0.3%的甘油,氮源为3%的酵母膏、0.75％的蛋白胨和0.05％(NH4)2SO4及少量的无机盐。优化培养基有利于菌体的生长和目的蛋白的表达,表达重组蛛丝蛋白达总蛋白量的20%。     

布氏锥虫自噬蛋白ATG12的表达、纯化及二级结构预测

[目的]表达纯化布氏锥虫自噬蛋白TbATG12,并对其二级结构进行预测。[方法]克隆TbATG12编码序列,采用酶切连接方法构建表达载体TbATG12(pET-28a),转化进入BL21(DE3)表达菌株诱导蛋白表达,利用Ni^(2+)-NAT亲和层析及分子筛层析方法纯化蛋白。采用核磁手段,采集一维和二维谱图,利用JPred 4预测其二级结构。[结果]16℃、0.5 mmol/L IPTG诱导20 h,TbATG12以可溶蛋白形式存在。纯化后蛋白纯度可达95%。TbATG12谱峰分布均匀,强度较强,二级结构预测其含有3个α-螺旋和5个β-折叠,为后续解析TbATG12溶液结构提供指导。[结论]克隆、表达纯化得到纯度>95%可溶TbATG12蛋白,二级结构预测和比对发现其结构在进化上很保守。     

蛛丝蛋白的研究进展及应用前景

蛛丝蛋白是一种很特殊的纤维蛋白。由丙氨酸组成的β－折叠和富含脯氨酸的α－螺旋,及其紧密堆砌的二级结构使之成为一种半结晶状态的分子弹簧结构,决定了蛛丝具有强度高,韧性大等一些重要特点。对其蛋白质序列的组成与结构人们已基本研究清楚;蛛丝蛋白基因部分序列的克隆已取得成功,在基因表达方面也取得了一些进展。虽然由于蛛丝蛋白基因序列的高重复性、不稳定性和较长的基因序列,使得对蛛丝蛋白的全基因克隆变得困难重重,但是蛛丝蛋白独特的结构和性质,使其在医学领域尤其是组织工程方面有着诱人的前景。     

蛛丝蛋白的研究进展及应用前景

蛛丝蛋白是一种很特殊的纤维蛋白。由丙氨酸组成的β-折叠和富含脯氨酸的α-螺旋,及其紧密堆砌的二级结构使之成为一种半结晶状态的分子弹簧结构,决定了蛛丝具有强度高,韧性大等一些重要特点。对其蛋白质序列的组成与结构人们已基本研究清楚;蛛丝蛋白基因部分序列的克隆已取得成功,在基因表达方面也取得了一些进展。虽然由于蛛丝蛋白基因序列的高重复性、不稳定性和较长的基因序列,使得对蛛丝蛋白的全基因克隆变得困难重重,但是蛛丝蛋白独特的结构和性质,使其在医学领域尤其是组织工程方面有着诱人的前景 。     

蜘蛛丝蛋白的模块结构性能和重组表达

蜘蛛丝是一类天然蛋白质纤维,具有独特的机械性能（高强度、高弹性和高断裂功等）和卓著的生物学特性（生物可降解性和与生物组织的相容性等）,在生物医学、材料、纺织和军事等领域都有着很高的潜在应用价值。综述了不同蜘蛛丝蛋白的模块结构特征及与其功能的关系,扼要介绍了目前利用各种基因工程方法表达重组蜘蛛丝蛋白的研究进展。     

拟蜘蛛拖丝蛋白基因重组蛋白的纯化及其抗血清制备

为了制备可用于拟蜘蛛拖丝蛋白体外检测的抗血清,利用前期工作中获得的蜘蛛拖丝蛋白基因重组原核表达载体2S-pET-52b( + ),采用原核表达方法获得大量重组蜘蛛拖丝蛋白2S-His,对此重组蛋白进行His标签特异性的亲和纯化,再依次经SDS-PAGE、切胶和与佐剂混合后作为抗原;皮下多点注射法将抗原注入新西兰大白兔皮...     

重组蜘蛛丝蛋白MiSp NT结构域在不同pH环境下的Trp荧光光谱及圆二色谱分析

为明确蛛丝蛋白NT结构域的生物学功能,首次研究了MiSp NT结构域在不同pH条件下的二聚化动力学及二级结构特性. 基于蛛丝蛋白MiSp全长编码基因,克隆并分别在BL21(DE3)和Rosetta-gami 2(DE3)中重组表达MiSp NT结构域: BL21(DE3)表达水平较高,约35 mg/L LB培养基,表达产物需经短暂超声和2 mol/L尿素促溶;Rosetta-gami 2(DE3)表达产物可溶性较好,但表达水平仅为BL21 (DE3) 一半左右. 融合蛋白经凝血酶介导的2次Ni-NTA纯化,纯度达到95%以上. Trp 荧光光谱分析表明,MiSpNT在pH为7.0左右时开始二聚化,pH5.7时二聚体为主要构象,pH_T约为6.6. MiSp NT在pH 7.5,6.5和5.5条件下的CD图谱相似,均主要为α-helix,表明NT二聚化与二级结构水平的变化没有直接联系. 本研究为进一步探索蛛丝蛋白NT结构域的结构和功能以及成丝机理提供线索.     

拟蜘蛛拖丝蛋白基因人工合成及其原核表达

根据GenBank上蜘蛛拖丝蛋白基因序列(AY555585和AH015065)、拖丝蛋白基因的结构特点和密码子的简并性,设计378 bp的拖丝蛋白基因单体,并对其人工聚合成二聚体.Primer5.0分析结果表明,决定拖丝弹性和抗拉力的氨基酸(Gla和Ala)含量(41.43和18.22)接近天然丝蛋白氨基酸含量(42.81和26.32);利用Antheprot软件对二聚体编码氨基酸的二级结构预测结果显示,与丝蛋白的氨基酸链相近,由2个相同的部分排列而成,即β-片层(占48%)、6个α-螺旋间隔(占15%)、散在的转角(占12%)和若干不规则卷曲(占25%).将二聚体与pET-28a( + )连接构建原核表达载体,IPTG诱导重组菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到相对分子质量为26.6×103 kD的重组蛋白.上述结果为进一步开展有关转蜘蛛拖丝蛋白基因在绵羊被毛中表达的研究奠定了基础.     

蜘蛛拖丝蛋白基因的构建及在大肠杆菌中的表达

蜘蛛大壶腹线产生的拖丝是非常优良的纤维蛋白, 具有独特的强度和弹性。基于拖丝蛋白高度重复序列和部分cDNA序列, 合成蜘蛛拖丝蛋白基因单体, 通过头尾相连的构建策略, 得到拖丝蛋白多聚体, 与原核高效表达载体pET30a(+)连接, 转化大肠杆菌BLR(DE3), 用IPTG诱导表达。 表达产物经His.Bind树脂金属螯合亲和层析一步纯化, 纯度达90%以上, 表达量为20mg/L。SDS-PAGE和蛋白质印迹图谱显示表达产物分子量为37kD, 其值与氨基酸组分分析结果与理论推算值基本符合。      

外源丙氨酸提高蜘蛛牵引丝蛋白天然基因在原核系统中的表达

蜘蛛丝蛋白天然基因的体外表达受诸多因素的限制。本研究在获得生长于中国的Nephila clavipes蜘蛛牵引丝蛋白Spidroin2 cDNA（Genbank Accession No. AF441245）的基础上,利用限制性内切酶双酶切反应构建含有Spidroin2 cDNA的重组表达质粒pET-28b(+)-Sp。将该质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）宿主细胞感受态菌中,以不同浓度的IPTG进行诱导,并通过诱导时间、培养温度、加入外源丙氨酸等途径提高Spidroin2 cDNA的表达量,同时利用多克隆抗体对表达产物进行Western blot检测。重组质粒pET-28b(+)-Sp的测序结果表明Spidroin2 cDNA基因以正确的阅读框插入到原核表达载体中;SDS-PAGE结果表明菌体表达蛋白中存在着大小约为31 kDa的目的蛋白带（加入外源丙氨酸条件下）,Western blot检测结果进一步证实,目的基因在大肠杆菌中得到正确表达。本研究证实,蜘蛛牵引丝蛋白Spidroin2 cDNA可在原核细胞内正确表达,外源丙氨酸的加入对于提高天然蜘蛛丝蛋白基因在原核系统的表达作用明显。     

蜘蛛丝蛋白研究进展

由于蜘蛛丝蛋白分子高度重复的一级结构、特殊的溶解特性和分子折叠行为以及具有形成非凡力学特性丝纤维的能力而引人注目。本文从蛛丝蛋白基因、天然蛛丝形成过程、蛛丝蛋白的基因工程生产及蛛丝蛋白的应用前景等几个方面着重介绍了近20年来对蛛丝蛋白的研究进展。围绕蛛丝蛋白展开的研究将有助于揭示蛋白质一级结构、蛋白质分子折叠与蛋白质大分子特性之间的内在联系。     

悦目金蛛拖丝的超微结构研究

采用非固定的抽丝方法,从一只未麻醉的悦目金蛛(Argiope amoena)的纺器将拖丝抽出,然后用扫描电镜(SEM)对拖丝进行超微结构的观察,结果表明:悦目金蛛拖丝至少具有2根、3根、4根及多根单丝纤维构成的4种不同结构,其中有一种类似弹簧的结构;另外,丝的表面还出现一种小环结构,这两种结构可能是拖丝纤维具有优良机械性能的原因之一。"束状结构"和"小环结构"在文献中未见报道。拖丝的直径范围为0.25~10.77μm;悦目金蛛似乎能调节拖丝的结构和直径,以适应其所面临的即时环境。本文基于上述观察结果并结合前人的研究,提出了蜘蛛拖丝结构-生物学功能多样性假说,对蜘蛛丝的结构与生物学功能之间的关系作了探讨。     

棒络新妇和悦目金蛛丝腺形态初步观察

研究比较了结网型蜘蛛棒络新妇Nephila clavata和悦目金蛛Argiope amoena的丝腺形态特征,为国内蜘蛛丝腺蛋白的研究提供原始的丝腺解剖图,同时结合对2种蜘蛛卵袋的解剖、网的特征和室内捕食黄粉虫Tenebrio molitor幼虫行为的观察比较,探讨了2种蜘蛛丝腺的生物学功能与其生存繁殖策略之间的关系。本文分别观察描述了棒络新妇和悦目金蛛的大壶状腺、小壶状腺、鞭状腺、柱状腺、葡萄状腺和梨状腺共6种丝腺。2种蜘蛛丝腺形态特征基本相似;部分丝腺在形态结构和颜色上有些差异;悦目金蛛的葡萄状腺比棒络新妇发达。观察表明2种蜘蛛的网和卵袋特征差异较大,两者捕食策略也不同,棒络新妇采用咬一捆缚（Bit—Wrapping）策略,悦目金蛛则采用捆缚一咬（Wrapping-Bit）策略。棒络新妇和悦目金蛛的网和卵袋特征与丝腺的颜色相一致。同时,其葡萄状腺数量和大小与其各自的捕食策略相关。