一种克隆PCR产物的新方法

一种克隆ＰＣＲ产物的新方法周复春,李学伍,吴斌,陈焕春（华中农业大学牧医系,武昌）基因克隆和分离是分子生物学和细胞生物学研究必不可少的组成部分。ＰＣＲ基因扩增可以产生微克级的特异性刀ＮＡ片段,可以简化从基因组ＤＮＡ克隆单拷贝基因片段的步骤。到达这种数...     

PCR产物克隆方法的新进展

ＰＣＲ产物克隆方法的新进展陈尚武,马涧泉（中山医科大学生化教研室．广州）随着ＰＣＲ技术的发展和普及,克隆ＰＣＲ产物已广泛应用于分子生物学的各个领域。通常ＰＣＲ产物不具有粘端,只能进行平端连接的克隆,由于ＴａｑＤＮＡ聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性...     

荧光定量PCR 法检测肿瘤细胞端粒酶活性的变化

目的：利用荧光定量PCR法检测端粒酶抑制剂作用于人肝癌细胞SMMC-7721后端粒酶活性的变化,探讨其抑制端粒酶活性的可能机制,为端粒酶抑制剂的临床应用提供理论依据。方法：利用荧光染料SYBR—Green I建立一种新的端粒酶活性检测方法：FQ—TRAP法。利用FQ—TRAP法检测端粒酶抑制剂作用后肿瘤细胞端粒酶活性变化。结果：端粒酶抑制剂作用后,肝癌细胞端粒酶活性都有变化,其中以ASODN,EGCG,AZT抑制效果较明显。结论：端粒酶FQ—TRAP法是一种特异性、灵敏度、重复性都较好,可快速、简便及定量检测人端粒酶活性的方法,端粒酶抑制剂作用后癌细胞端粒酶活性的变化,为端粒酶抑制剂的临床应用提供理论依据。     

基因扩增产物的固相杂交-酶联显色方法的建立

建立基于基因扩增技术的简便、快速的病毒核酸定量检测方法．将标记有生物素的寡核苷酸引物所扩增的病毒基因产物,与通过共价键结合在微孔反应板上的特异性探针进行快速杂交,然后通过辣根过氧化物酶标记的抗生物素进行酶联显色,读取光密度值．应用本方法对血清中乙型、丙型肝炎病毒核酸定量检测,灵敏度分别可达１－５拷贝／反应．此方法简便、快速、特异性好、敏感性高、半定量指标客观,可广泛应用于肝炎病毒感染的临床诊断和疗效评价．     

用PCR检测细胞培养中支原体污染

细胞培养中支原体污染已经成为严重的问题.为了扩增6种支原体(精氨酸支原体,口腔支原体,人型支原体,猪鼻支原体,发酵支原体及莱氏支原体)核糖体RNA操纵子的16s和23s DNA间区,设计了三个通用PCR引物(F1,F2及R1).当以6种支原体DNA为模板时,引物F1和R1产生340到468bp的片段,引物F2和R1产生145到211bp的片段,当用Hela细胞或E.coli DNA作为模板,用引物F1和R1时,在电泳中未观察到特定区带.此法最小能检出8.5fg精氨酸支原体DNA,相当于13个精氨酸支原体.这说明,当这些支原体污染细胞培养时,能用PCR法检测出来.     

PCR法快速检测临床标本中结核杆菌DNA

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）快速检测临床标本（脑脊液、胸水、腹水、血、痰液）中的结核杆菌ＤＮＡ,特异性扩增片段１２３ｂｐ,为结核杆菌的特异性重复序列ＩＳ６１１０部分基因。ＰＣＲ检测人型结核杆菌的敏感性达１０ｆｇＤＮＡ。临床标本的ＰＣＲ检测阳性率（２３．３％）明显高于抗酸染色涂片（２．９％）和细菌培养（５．７％）的阳性率（Ｐ〈０．０５）。通过设立对照系统及对扩增产物酶切分析,表明该法无假阴性结果（特异     

一种提高PCR产物定向克隆效率的新方法

介绍一种在对PCR产物进行定向克隆之前先用T4DNA聚合酶将PCR产物末端进行补齐,然后进行限制性酶切和克隆,能显著提高克隆效率的新方法。     

快速可靠的双链PCR产物直接测序法

利用T7DNA聚合酶在低温下仍具较高活性的特点,在热变性后低温下进行测序反应,使用该方法对多种PCR产物进行序列分析均取得较好的结果．     

多孔板-MTT比色法测定植物抗菌成分对细菌的抑制活性

多孔板-MTT比色法测定植物抗菌成分对细菌抑制活性的步骤为：每孔加入浓度为10^6cfu／mL的供试菌液90灿,然后加入不同浓度的药液10μL,28℃暗培养24h后,每孔中加入5mg／mL的MTT溶液10μL,继续培养4h后加入10％二甲基亚砜100μL,振荡30min,在570nm处测定溶液的吸光值。采用以上方法,测定植物抗菌成分蓝桉醇对辣椒斑点病黄单胞菌（Xanthomonas vesicatoria）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的半抑制浓度（IC50）分别为0．158和0．395mg／mL,小檗碱对溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus）的IC50为0．587mg／mL。结果表明,多孔板-MTT比色法能快速、微量地测定植物成分对细菌的抑制活性。     

副结核荧光PCR试剂盒研制与应用

采用TaqMan荧光标记探针技术原理, 建立副结核分枝杆菌特异的实时荧光PCR快速检测鉴定方法并组装形成临床诊断试剂盒。试剂盒提供荧光PCR与样品核酸提取试剂, 检测全程包括样品处理可在1 d内完成。特异性试验结果表明, 试剂盒对8株副结核分枝杆菌标准菌株的检测均呈典型阳性反应, 对牛分枝杆菌、结核分枝杆菌等其它12种分枝杆菌标准菌株以及大肠杆菌、肺炎链球菌等多种常见微生物均呈阴性反应。试剂盒检测灵敏度可达单个菌细胞、15个基因拷贝, 比常规PCR检测灵敏度提高100倍。对每份添加50~100个菌细胞的20份阴性牛奶样品进行检测, 均呈阳性反应。重复性试验结果显示, 试剂盒组内变异系数为1.41%, 组间变异系数为2.42%。采用所研制的副结核分枝杆菌荧光PCR试剂盒对来自广东地区7个奶牛场的250份牛奶样品和粪便样品、来自10个养猪场的143份猪血清样品, 以及3批次进口食蟹猴共100份血清样品进行检测, 检出牛奶样品中副结核分枝杆菌阳性率为7.7%, 牛粪样品中阳性率为3.7%, 猪血清样品中阳性率为8.2%, 进口猴血清样品中阳性率为3.0%。     

核糖核酸酶保护分析试剂盒的研制与质量检测

目的:开发核糖核酸酶保护分析(RPA)试剂盒,用于组织和细胞mRNA定量分析。方法:参考国外RPA实验方法和试剂盒配方配制RPA试剂盒;以国外同类产品为标准,采用同位素标记探针检测该试剂盒的质量。结果:采用自行研制的核糖核酸酶保护实验试剂盒,检测β-肌动蛋白和亲环蛋白mRNA在小鼠肝脏的表达,其灵敏度与美国Ambion公司的RPAⅢ试剂盒相似。结论:研制的RPA试剂盒可用于组织和细胞mRNA的定量分析,其质量能够达到国外同类产品的标准。     

多孔板-MTT比色法评价植物和微生物代谢产物的抗真菌活性

多孔板-MTF比色法测定植物和微生物代谢产物对真菌抑制活性的步骤为:在多孔板的每孔中依次加入浓度为105孢子/mL的供试真菌孢子悬液90μL,不同浓度的药液10 μL.25℃暗培养48 h,然后每孔中加入8mg/mL的MTT溶液10μL,继续培养10 h后,离心去上清,加入DMS0 150 μL,振荡30 min,离心后上清液在510nm测定吸光值.采用上述条件测定了白屈菜红碱对稻瘟病菌和西瓜枯萎病菌的MIC值分别为80和1.5μg/mL,IC50值分别为21.99和0.78 μg/mL;Diepoxinζ对稻瘟病菌的MIC和IC50值分别为200和96.21 μg/mL.多孔板-MTT比色法为快速有效地筛选和评价植物和微生物抗真菌活性成分创造了条件.     

19-去甲睾酮异源性ciELISA试剂盒的研制及应用

筛选抗19-去甲睾酮（NT）单克隆抗体,建立异源性ciELISA试剂盒。用人工抗原NT-17-BSA免疫Balb/C小鼠,细胞融合技术建立1株抗NT单克隆杂交留细胞NT1-B7,同种型为IgG1 /k,腹水效价达0.64×105,亲和常数（Ka）为4.31×109 L/mol,半数抑制浓度（IC50）为0.55 ng/mL,与群勃龙和雌二醇的交叉反应率（CR）分别为2.2%和1.6%,与其它化合物无CR。异源性ciELISA试剂盒在猪肉、猪尿、牛肉和牛尿四种基质中的检测限分别为0.24、0.23、0.22和0.17 ng/mL,批内和批间相对标准差（RSD）在4.4％～21.8％,添加回收率在85％～110％,4 ℃下保存期至少6个月。NT-Kit的基质pH值适用范围为6.5～7.5,温育过程优化后可节约检测时间30～90 min。试剂盒灵敏度高、特异性强,可应用于样品基质中NT残留检测。     

猪链球菌2型荚膜基因PCR快速检测方法的建立及试剂盒的研制

根据猪链球菌2型的荚膜基因2H序列设计一对引物,成功地扩增了荚膜基因,并建立了检测猪链球菌2型的PCR方法。用ScaI进行确认,获得了与预期大小一致的389bp和300bp的两个片段。然后对该方法的敏感性、特异性进行了研究。结果表明,敏感程度可达10个细菌;对其他细菌PCR检测结果均呈阴性,表明建立的猪链球菌2型荚膜基因的PCR检测方法,其特异性和敏感性均很高,可作为猪链球菌病快速诊断的方法。在建立PCR方法的基础上,研制成试剂盒,并对试剂盒的特异性、敏感性和稳定性进行了研究。     

大黄鱼虹彩病毒PCR快速检测试剂盒的研制

针对近年来由虹彩病毒所引起的海水养殖鱼类疾病呈日趋严重的态势,该文在证实了引发我国大黄鱼大规模流行病的病原为一种虹彩病毒及测定病毒全基因组序列(111,760bp;GenBank accession numberl．AY779031)的基础上,通过与已报道虹彩病毒核酸序列进行分析比较,结合生物信息学手段,确定了以虹彩病毒ATPase基因保守区序列(295bp)作为扩增靶序列,设计合成了一对特异性引物,通过改进PCR模板的制备方法和优化扩增条件,建立了大黄鱼虹彩病毒PCR快速检测技术,并开发成简便、快速、实用的检测试剂盒,该试剂盒的检测灵敏度相当于30个病毒粒子,模板制备时间约30min、回收率为52％、半个工作日即可得到准确的结果,无非特异性扩增带,适用于大黄鱼虹彩病毒病的早期快速诊断、苗种的检疫及水质环境的监测,目前正在推广应用。     

A new LAMP-based assay for the molecular diagnosis of toxoplasmosis: comparison with a proficient PCR assay

Toxoplasmosis is generally a benign infection caused by the protozoan parasite Toxoplasma gondii but can have severe consequences in fetuses of mothers infected during pregnancy (congenital toxoplasmosis) and immunocompromised individuals. PCR-based diagnostic tests have become crucial for its diagnosis. However, this molecular diagnosis essentially relies upon laboratory-developed methods and suffers from a lack of standardization, leading to great variation in methods and performance among laboratories. With the need for accreditation of clinical microbiological laboratories, the use of commercial PCR kits has become an attractive alternative; but thorough evaluation of newly commercialized kits by proficient groups is necessary before any recommendation can be made to parasitology laboratories by health authorities or learned societies. Here, we compared the performance of an original commercial method, the Iam TOXO Q-LAMP (DiaSorin®), using Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technology, with our reference laboratory-developed method using real-time PCR. The kit was first tested using amniotic fluid (AF) and plasma samples (either negative or spiked with live T. gondii tachyzoites at different concentrations (from 7 to 10⁵?tachyzoites/mL)). It was then assessed using a cohort of 11 AF, five placental and 32 blood clinical samples preserved at ?20?°C. For the processing of placental/blood samples, a pretreatment step was used, which did not strictly follow the manufacturer’s recommendations. The practical ease of use and compliance with good laboratory practices were also evaluated. Although the LAMP assay was less sensitive than the laboratory-developed method at very low parasite concentrations (0.1?T. gondii genome equivalents/mL), the two methods yielded identical results qualitatively and, in some instances, quantitatively, particularly for AF samples.     

鼠棒状杆菌PCR检测方法的建立及其应用

目的建立鼠棒状杆菌PCR检测方法并应用于临床样本检测。方法用脑心浸出液培养基复苏、培养鼠棒状杆菌（corynebacteriumkutscheri,C．kutscheri）并提取基因组DNA作模板;根据GenBank中C．kutsche6的16S基因序列设计合成引物,建立鼠棒状杆菌PCR检测方法并进行敏感性和特异性的评价;人工感染昆明鼠,建立小鼠棒状杆菌感染模型,采集肝脏和肾脏,提取DNA进行检测。结果成功建立了鼠棒状杆菌PCR检测方法,该方法可检测到100个阳性质粒;对小鼠沙门氏菌、肺炎链球菌和巴氏杆菌无交叉反应;全部8个人工感染样本全部检测为阳性。结论建立的鼠棒状杆菌PCR检测方法灵敏度高、特异性好,可作为鼠棒状杆菌感染的快速检测方法。