FGF5在青年羊驼背部和耳部皮肤中的表达和定位

羊驼是毛用型经济动物,其耳部和背部的毛发品质和生长周期存在差异. 据研究成纤维细胞生长因子5（fibroblast growth factor 5, FGF5）在多种哺乳动物中影响毛发长度. FGF5基因的突变导致小鼠、狗和猫隐性的长发表型,其也参与了家兔绒毛长度的变异. 本实验旨在研究FGF5在青年羊驼皮肤中的表达和定位,以及在羊驼背部和耳部皮肤中的差异比较,探讨其在羊驼毛发生长发育过程中的作用及其相关机制. 实验采用实时荧光定量PCR、Western印迹和免疫组织化学等技术,对FGF5在青年羊驼背部和耳部皮肤中的mRNA、蛋白表达水平和定位进行了研究. 实时荧光定量PCR结果显示,FGF5在青年羊驼耳部皮肤组织中相对基因表达量是羊驼背部皮肤组织的25265倍(P<001); Western印迹结果显示,羊驼皮肤组织粗蛋白提取物中存在与兔抗FGF5多克隆抗体发生免疫阳性反应的蛋白条带,羊驼耳部皮肤平均蛋白表达量显著高于背部;免疫组织化学结果显示,FGF5在羊驼皮肤的毛根鞘,毛母质细胞和毛髓质等部位均表达,根据光密度值得出,该蛋白在羊驼背部和耳部皮肤中的表达差异极显著（P<001）. 试验结果提示FGF5可能抑制了羊驼毛发的生长.     

青年羊驼耳部和背部皮肤组织中miRNA差异表达研究

羊驼是毛用型经济动物,其耳部和背部的毛发品质和生长速度存在差异.MicroRNA(miRNA)是新发现的一类在转录后水平调控基因表达的非编码RNA分子,为比较miRNA在羊驼耳部和背部皮肤的表达差异,从而探讨miRNA在羊驼皮肤和毛囊发育过程中的调控作用,本实验提取羊驼皮肤总RNA,制备了羊驼皮肤miRNA芯片,通过与Affymetrix多物种miRNA芯片跨物种杂交对耳部和背部皮肤的miRNA进行筛选,并通过实时荧光定量PCR进行了验证,同时利用在线生物信息软件预测miRNA靶基因.结果显示,羊驼耳部和背部皮肤中高表达差异2倍以上的miRNA有39个,实时荧光定量PCR检测let-7b和miR-24在2个部位皮肤中的差异表达量与miRNA基因芯片结果一致;预测到let-7b和miR-24的靶基因中包含有与毛囊生长发育和毛发品质相关的基因,提示这些miRNA可能参与羊驼皮肤和毛囊的生长发育、更新以及毛发品质的调控.     

KRT71决定羊驼毛弯曲度的形成

角蛋白71（Keratins 71,KRT71）属于人类Ⅱ型上皮角蛋白,是毛囊特异性的上皮角蛋白基因。相关研究表明,在其他物种中,KRT71与被毛卷曲相关,KRT71在卷曲的被毛形成过程中起着重要的作用。现眼观羊驼背部、耳部和腿部毛发的弯曲程度不同,但KRT71与其被毛的弯曲度是否相关尚不清楚。本研究利用PCR技术克隆KRT71基因全CDS区。通过实时荧光定量PCR技术检测基因的表达。免疫组化、Western 印迹对KRT71蛋白在羊驼背部、耳部和腿部皮肤组织中的表达量进行分析,以探讨KRT71与羊驼毛发弯曲度的关系。结果显示,羊驼的KRT71基因的CDS区共有1 578 bp,编码525个氨基酸;免疫组化结果显示,KRT71在羊驼的背部、耳部和腿部均有表达,并且主要特异性表达于毛囊的内根鞘;实时荧光定量PCR和Western印迹结果显示,KRT71的mRNA和蛋白量均呈现背部﹥腿部﹥耳部的趋势;相较于耳部,背部和腿部的表达量较高。实验结果提示,KRT71的表达量与毛纤维的弯曲度呈正相关,KRT71可能在羊驼毛纤维的弯曲度形成过程中发挥着一定的作用。     

GPR143在绵羊皮肤组织中的表达及定位分析

G蛋白偶联受体143(G-protein coupled receptor143, GPR143)在黑素体的生物合成中起重要作用,本文旨在研究GPR143基因在不同毛色绵羊皮肤组织中的差异表达及定位,探索GPR143基因与毛色形成的相关性。通过qRT-PCR方法和免疫印迹方法分别检测不同毛色绵羊皮肤组织中GPR143基因mRNA水平和蛋白水平的表达差异;运用免疫荧光法对不同毛色绵羊皮肤组织中的GPR143基因进行定位并对结果进行光密度值分析。qRT-PCR结果显示,GPR143基因在黑色绵羊皮肤组织中mRNA相对表达量为白色绵羊的7.84倍,二者差异极显著(P<0.01);免疫印迹结果显示,黑色绵羊皮肤组织中GPR143蛋白表达量是白色绵羊的1.3倍,二者差异显著(P<0.05)。免疫荧光结果显示,GPR143蛋白的主要表达部位为绵羊皮肤组织毛囊外根鞘和表皮层,经光密度值分析后发现,GPR143在黑色绵羊皮肤毛囊外根鞘和表皮层的表达量显著高于白色绵羊。本研究结果表明不同毛色绵羊皮肤组织均能表达GPR143基因,但黑色绵羊皮肤组织中该基因的mRNA和蛋白水平都显著高于白色绵羊,说明GPR143的mRNA和蛋白在黑色绵羊皮肤组织中表达上调,在白色绵羊皮肤组织中表达下调。GPR143基因可能通过调控MITF水平和黑素体的数量、大小、运动和成熟进而参与绵羊毛色的形成过程。     

早孕小鼠子宫内膜mTOR基因表达增高

利用实时荧光定量PCR、原位杂交法、免疫组化(SP法)和Western印迹法分别检测未孕、假孕及孕d3、d4、d5、d6、d7小鼠子宫内膜哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian tar get of rapamycin,mTOR)mRNA和蛋白质的表达,研究mTOR基因在早孕小鼠子宫内膜的表达规律.结果显示妊娠子宫内膜组织mTOR的表达较未妊娠的子宫内膜组织显著增加(P＜0.05);着床窗期表达最高(d4,d5),且与其他妊娠各期比较差异有统计学意义(P＜0.05);原位杂交和免疫组化分析显示mTOR mRNA和蛋白质表达主要在子宫内膜基质细胞,与上皮细胞各组比较差异有统计学意义(P＜0.05).研究表明mTOR在子宫内膜基质细胞的规律性表达所调控的细胞生长、增殖和分化可能是胚胎正常着床的分子机制之一.     

不同毛色绵羊皮肤中MC1R的差异表达及定位

MC1R基因与黑色素细胞的功能、皮肤的色素沉着和皮肤癌风险相关。本研究MC1R基因在不同毛色绵羊皮肤组织中的差异表达及定位,以探索MC1R基因对皮肤色素生成方面的重要作用,确定其与毛色形成的相关性。采用荧光定量PCR方法和免疫印迹方法分别检测不同毛色绵羊皮肤中MC1R基因m RNA水平和蛋白水平的表达差异;运用免疫组织化学法对不同毛色绵羊皮肤组织中的MC1R基因进行定位。荧光定量PCR结果显示MC1R m RNA在所有绵羊皮肤组织中都表达,在全黑绵羊皮肤中的相对表达量为537.91±150.36**,在花黑和花白绵羊皮肤中的相对表达量分别为27.95±9.3**和4.19±0.57**,而在全白绵羊皮肤中的相对表达量为1.03±0.27;免疫印迹结果显示所有绵羊皮肤组织蛋白中均存在与MC1R反应的阳性条带,MC1R在全黑绵羊皮肤组织中的相对蛋白含量为6.3±0.21**,在花黑和花白绵羊皮肤组织中的相对蛋白含量分别为2.74±0.24**和1.55±0.1**,而在全白绵羊皮肤组织中的相对蛋白含量为1±0.15;免疫组织化学结果显示MC1R蛋白主要表达部位为绵羊皮肤组织毛囊的基质、根鞘等区域。试验表明不同毛色绵羊皮肤组织均正常表达MC1R基因,但其表达水平存在差异,全黑绵羊皮肤中MC1R m RNA和蛋白的表达量显著高于其它三种毛色绵羊,综上可知MC1R基因影响绵羊黑白花毛色的形成,而且真黑素的合成依赖于MC1R的表达水平。     

人KRT2促进体外培养的羊驼皮肤黑色素细胞的黑色素生成

基因表达谱显示,绵羊角蛋白2（keratin2, Krt2）的mRNA在不同毛色皮肤的表达不同,暗示Krt2 基因可能对皮肤黑色素生成有一定的影响。为探索角蛋白2对体外培养的羊驼皮肤黑色素细胞黑色素生成的影响,首先采用PCR扩增产物测序,结合DNAMAN 软件比对分析发现,羊驼Krt2 编码序列（cDNA）与NCBI公布的人KRT2高度同源（91%）;将人KRT2添加于培养的羊驼皮肤黑色素细胞,观察人KRT2对羊驼皮肤黑色素细胞黑色素的生成作用。免疫组织化学显示,外源性的人KRT2处理羊驼皮肤黑色素细胞72 h后,黑色素细胞的细胞质中Krt2表达增强。实时定量PCR及Western 印迹实验揭示,与胎牛血清清蛋白处理的羊驼皮肤黑色素细胞比较,1 ng/mL、10 ng/mL和100 ng/mL人KTR2处理的羊驼皮肤黑色素细胞酪氨酸酶（Tyr）、酪氨酸相关蛋白-1（Tyrp1）、小眼畸形相关转录因子（Mitf）基因表达明显上调（P <0.05）;尤其在添加10 ng/mL KTR2的细胞中,3个基因的mRNA相对表达水平升高尤其显著,分别是对照细胞的4倍、10倍和12.9倍（P<0.01）,蛋白质相对表达水平分别是对照细胞的2倍、2.1倍和1.7倍（P<0.01）。分光光度法测量A490结果证明,1 ng/mL、10 ng/mL和100 ng/mL人KTR2处理的羊驼皮肤黑色素细胞产生的黑色素含量分别是对照细胞的1.3倍（P <0.05）、1.8倍（P <0.01）和1.5倍（P <0.05）。上述结果说明,人KTR2处理可通过刺激羊驼皮肤黑色素细胞黑色素合成相关信号通路,促进黑色素的合成。     

新生小鼠不同部位皮肤毛囊早期发育差异的比较

目的观察出生后小鼠不同部位皮肤毛囊早期发育生长差异及细胞色素C的表达分布。方法对新生1~9日龄的KM小鼠背部、尾部和触须部皮肤取材,进行HE染色,用二步法免疫组织化学对组织进行细胞色素C进行表达分布检测。结果新生小鼠不同部位皮肤毛囊发育差异很大,这种差异不仅体现在形态差异上,而发育时间的差异也十分明显。小鼠出生后背部皮肤和尾部皮肤的毛囊发育都经过了一个非线性的发育和生长期,过了非线性的发育和生长期才开始快速生长,相比较尾部发育略迟于背部。触须部毛囊发育特征和背部尾部差异很大,一出生便可看到较成熟的触毛,没有经过稳定期便开始发育。结论通过形态学比较,结合CytC表达分布水平,发现新生小鼠不同部位皮肤毛囊早期发育存在形态和时间上的差异。     

谷氨酸单钠对大鼠胃窦部生长抑素mRNA表达的影响

目的：探讨谷氨酸单钠（MSG）对大鼠胃窦部生长抑素mRNA表达的影响。方法：采用原位杂交技术检测胃窦部生长抑素mRNA的表达并用计算机图象分析系统进行定量分析。结果：谷氨酸单钠可使胃窦部生长抑素mRNA表达增强。以52天（青春期）最为明显,120天（成年期）次之,11天（新生期）最弱,经统计,差异具有显性（P＜0．01）。结论：谷氨酸单钠可使胃窦部D细胞生长抑素mRNA表达增强,这就能是MSG导致神经内分泌紊乱的机制之一。     

小鼠毛囊不同生长周期中MITF下游色素相关基因的定位表达及相关性分析

小眼畸形转录因子（MITF）不仅是黑色素细胞发育、增殖和存活的必要调节因子,而且对调节相关酶和黑素体蛋白表达来确保黑色素产生具有至关重要的作用。MITF下游色素相关基因在小鼠毛囊生长周期中的表达及相关性仍有待研究。HE染色结果表明不同毛囊时期的小鼠毛囊呈现典型的组织形态学结构;免疫组织化学显示,MITF、GPNMB、OA1、TYR、TYRP2在不同毛囊生长周期中的毛基质及内外毛根鞘均有不同程度的阳性表达。黑色素测定结果表明,在毛囊生长初期和中期,碱性可溶性总黑色素（ASM）、真黑素（EM）以及褐黑素（PM）相对含量高于毛囊生长末期。蛋白免疫印迹结果表明,MITF、GPNMB、OA1、TYR、TYRP2在毛囊生长初期和中期蛋白质相对水平明显高于毛囊生长末期。实时荧光定量PCR结果表明, MITF、GPNMB、OA1、TYR、TYRP2、PMEL在毛囊生长初期和中期,mRNA相对表达量显著高于毛囊生长末期。在不同毛囊生长周期小鼠皮肤的MITF下游色素相关基因表达存在显著差异,表明上述因子在维持黑色素细胞色素生成是不可或缺的因素。     

乳腺癌中EGFR蛋白表达和基因扩增的检测结果比较

目的：比较免疫组织化学技术检测乳腺癌中EGFR蛋白表达和荧光原位杂交检测EGFR基因扩增的结果的符合率,为EGFR靶向治疗病例的选择提供依据。方法：随机选取2005年1月到2011年12月冷水江市人民医院和湖南省肿瘤医院病理科的147例乳腺癌档案病例,采用免疫组织化学技术检测乳腺癌组织中EGFR蛋白表达,荧光原位杂交检测EGFR的基因扩增,比较两种方法阳性结果的符合率。结果：免疫组化染色结果显示EGFR在原发性和转移性乳腺癌中的阳性表达率分别为85%（105/123）和79%1（9/24）,两组比较无显著差异（P〉0.05）。FISH检测结果显示原发性和转移性乳腺癌中分别有12%（15/123）和8%（2/24）存在EGFR基因扩增,两组比较结果无显著差异（P〉0.05）。所有存在EGFR基因扩增的原发性和转移性乳腺癌的EGFR免疫组织化学结果均为阳性。在原发性和转移性乳腺癌中,免疫组化阳性和基因扩增程度间呈显著正相关（P〈0.05）,但免疫组化结果预测基因扩增的特异性较低。结论：免疫组织化学检测EGFR只能作为EGFR靶向治疗病例选择的初步筛选,进一步进行荧光原位杂交检测EGFR基因扩增是必须的。     

高糖环境对Mu ller细胞谷氨酸转运体及谷氨酰胺合成酶表达的影响

目的：研究高糖环境对原代培养新生7天SD乳鼠视网膜Muller细胞谷氨酸转运合成系统的影响及其可能机制。方法：新生7天SD乳鼠视网膜Muller细胞原代培养并模拟高糖环境构建乳鼠视网膜muller细胞体外高糖环境模型。处理分为3组：对照组,高糖组,高糖＋白藜芦醇干预组。培养时间为24h,通过westernblot等检测方法,对照观察各组Muller细胞谷氨酸转运体（GLAST）、谷氨酰胺合成酶（GS）的表达情况。结果：模拟高糖环境可以造成新生SD乳鼠视网膜Muller细胞谷氨酸转运体（GLAST）表达的降低（0．225foldVScontrol,P〈0．05）,并导致其表达的谷氨酰胺合成酶（GS）表达水平的显著降低（0．653foldVScontrol,P〈0．05）;而干预药物白藜芦醇作用后可明显逆转新生SD乳鼠Mu ller细胞谷氨酸转运体（GLAST）（1．133foldvSHGgroup,P〈0．05）、谷氨酰胺合成酶（GS）（1．720foldVSHGgroup,P〈0．05）等蛋白的表达水平。结论：模拟高糖环境可以影响视网膜M0ller细胞谷氨酸转运体（GLAST）、谷氨酰胺合成酶的表达,其结局可能导致视神经细胞因谷氨酸堆积而导致的兴奋性毒性,白藜芦醇能提高Mcjller细胞谷氨酸转运体（GLAST）、谷氨酰胺合成酶表达,从而保护视神经细胞。     

Cyclic hair-loss and regrowth in transgenic mice overexpressing an intermediate filament gene.

We have produced transgenic mice containing up to 250 copies of a sheep wool intermediate filament keratin gene to study the effect of its expression on hair structure and development. Several transgenic lines expressed the gene and in the one containing 250 transgenes, a pattern of hair-loss and regrowth was stably established. Successive waves of hair growth follow periods of denuding like the natural progression of hairs in the mouse hair cycle. By in situ hybridization we have shown that the sheep transgenes are expressed at the correct stage in mouse hair development and at a high level. The transgenic hairs contain not only an elevated level of intermediate filament keratin protein but also a decreased level of the filament-associated proteins. This imbalance disrupts the normal ordered array of these proteins in the cells of the hair cortex and leads to weakened fibres which are prematurely lost.     

PPAR-γ/PGC-1α对支气管哮喘豚鼠肺组织Nrf2/γ-GCS-h作用

目的：观察PPAR-γ、PGC-1α、Nrf2和γ-GCS-h在豚鼠支气管哮喘肺组织中表达而探索PPAR-γ/PGC-1α对Nrf2/γ-GCS-h作用。方法：40只健康雄性豚鼠随机化原则分成对照组（A组）、哮喘组（B组）、地塞米松（C组）和罗格列酮治疗组（D组）,每组10只豚鼠,卵蛋白致敏法复制哮喘模型。原位杂交检测PPAR-γ、PGC-1α、Nrf2和γ-GCS-hmRNA表达,免疫组化和Western blot检测四种蛋白表达。结果：PPAR-γ、PGC-1α、Nrf2和γ-GCS-h的mRNA哮喘组表达最低,四组表达差异有统计学意义（P均〈0.01）;免疫组化和Western blot显示PPAR-γ、PGC-1α、Nrf2和γ-GCS-h的蛋白哮喘组表达几乎都呈阴性而且以核内表达为主,四组差异均有统计学意义（P均〈0.01）。PPAR-γ表达与PGC-1α表达呈正相关,γ-GCS-h mRNA表达与PPAR-γ、PGC-1α、Nrf2核内表达均呈正相关,Nrf2表达与PPAR-γ和PGC-1α表达均呈正相关。结论：PPAR-γ、PGC-1α、Nrf2和γ-GCS-h在卵蛋白致敏急性支气管哮喘模型中表达下降;PPAR-γ/PGC-1α可通过上调Nrf2/γ-GCS-h表达提高组织的抗氧化能力,因而PPAR-γ/PGC-1α在哮喘的发病和防治可能起重要的作用。