磷酯脂酶C—γ1在人早期胚胎组织细胞中表达的免疫细胞化学研究

采用免疫细胞化学方法探讨了磷酸脂酶C-γ1（PLC－γ1）在人早期胚胎组织细胞中的表达,发现在胚胎龄为52－76天的多种细胞中均有表达,以软骨、软骨膜及肌组织反应最强。结果提示,PLC－γ1相关的细胞内信号传递途径对于人早期胚胎细胞的发育、增殖具有重要的生物学意义。     

小鼠胚胎性癌细胞研究的一些近况

胚胎性癌细胞(Embryonal Carcinoma,简称EC细胞)是畸胎癌的恶性干细胞,它既有恶性生长性质,又有类似于早期正常胚胎细胞的多能性,能分化为神经、皮肤、肌肉、软骨和腺管等组织。EC细胞注射到同系小鼠腹腔后,可在腹水中分化并聚积成结构类似于早期胚胎的细胞群,称为拟胚体。     

Cx43在人胚胎早期食管上皮组织中的表达

目的:探讨间隙连接蛋白Cx43在人胚胎早期食管上皮组织中的表达规律.方法:应用免疫组织化学SABC法检测第2、3、4三个月龄段人胚胎食管上皮层Cx43蛋白的表达.结果:第2～4个月龄段,食管上皮层均有Cx43蛋白阳性的细胞分布.第2个月胚龄段,Cx43蛋白在人胚胎食管上皮基底层呈强阳性表达,由基底层向管腔面,细胞阳性强度逐渐降低;第3个月胎龄段,Cx43蛋白阳性细胞在食管上皮层广泛分布;第4个月胎龄段,Cx43蛋白在食管上皮层近基底面部分细胞呈弱阳性表达.结论:Cx43蛋白在人胚胎早期食管上皮层细胞的生长发育过程中起重要的作用.     

FEZF 1在人胚胎干细胞早期神经分化过程中的作用研究

研究模型的缺乏和人源细胞的伦理问题极大地限制了人早期神经发育机制的研究.人胚胎干细胞具有体外无限增殖和分化为人体内各种细胞的能力,为研究人神经发育提供了重要的工具.本研究利用化学成分确定的神经诱导体系和高通量筛选策略,发现Fez锌指家族1(FEZF1)在人胚胎干细胞神经分化过程中快速表达,且先于人神经前体细胞标志基因PAX6的表达,提示FEZF1是人早期神经发育中的重要调控因子.随后利用CRISPR/CAS9技术构建了FEZF1敲除的人胚胎干细胞株,发现敲除FEZF1阻碍了人胚胎干细胞的神经分化进程.此外,FEZF1敲除抑制了人胚胎干细胞神经分化过程中多能性的丢失,部分揭示了FEZF1缺失引起神经发育缺陷的机制.然而,单独过表达FEZF1并不能驱动人胚胎干细胞的神经分化,表明FEZF1是神经分化的必需调控因子,却不足以启始人胚胎干细胞的神经分化.总之,本研究发现了FEZF1是人早期神经分化的重要调控因子,为理解人神经发育奠定了理论基础.     

人胚胎干细胞和拟胚体基因表达谱的初步分析

利用人类全基因组Affymetrix芯片检测人胚胎干细胞与其自发分化7d的拟胚体之间的差异表达基因.结果显示:与未分化的人胚胎干细胞相比.在分化7d的拟胚体中表达下调2倍及以上的已知和未知基因共有1100个,表达上调2倍及以上的已知或未知基因共有2283个.利用Gostat对这些差异表达基因进行功能分析,发现它们分别与细胞的生物代谢过程、信号传导通路、系统发育、细胞分化、分子功能及亚细胞组分相关.胚胎干细胞具有自我更新能力,是研究早期胚胎发育理想的细胞模型,因此对差异表达基因的功能研究有助于了解维持人胚胎干细胞自我更新的分子机制以及胚胎发育早期的分子事件.     

PD-L1表达调控通路-治疗肿瘤潜在的新途径

癌细胞表面能表达多种免疫抑制蛋白,程序性死亡分子受体1配体(programmed death ligand-1,PD-L1)是关键蛋白之一,可与免疫细胞(如T细胞、B细胞、树突状细胞和自然杀伤性T细胞)表面的程序性死亡受体-1(programmed death ligand,PD-1)结合,激活PD-1的免疫抑制作用,通过RAS/Raf/MEK/ERK、磷脂酶C-γ(phospholipase C-γ,PLC-γ)、磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B(PI3K-AKT)等通路下调机体免疫细胞功能,协助癌细胞进行免疫逃逸。故近年来应用免疫检查点PD-1、PD-L1抑制剂成为治疗恶性肿瘤的新手段。研究表明,PD-L1的表达受多种信号通路、相关蛋白和转录因子的调控,故本文就PD-L1的表达调控进行综述,寻求PD-L1表达调控通路能否作为抗肿瘤治疗新的靶点。     

磷脂酶C-γ_2对鼠成纤维细胞株迁移能力的影响

通过对敲除磷脂酶 C-γ1 基因的鼠成纤维细胞株及其转染磷脂酶 C-γ2 基因后的迁移指标的统计学分析 ,揭示出磷脂酶 C-γ1 和γ2 在 PDGF引起的细胞迁移信号传导中均有正调控作用 ,前者作用显著而后者作用微小 ,并且仅在磷脂酶 C-γ1 功能缺失的条件下方可发挥出来 ;同时进一步证明敲除磷脂酶 C-γ1 基因的细胞株中 ,未见出现磷脂酶 C-γ2 的代偿 ,说明磷脂酶 C-γ2 与 γ1 在功能上不可相互取代 ,反映了一种信号可由多种途径传导即细胞信号传导的交互性、冗余性     

前蛋白转换酶Furin和PC7在小鼠母胎界面的动态表达及其在胚胎粘附和扩展中的作用

通过免疫组化、免疫荧光和小鼠胚胎-子宫内膜上皮细胞共培养体系,研究了前蛋白转换酶Proprotein Convertases (PCs)家族中的Furin和PC7在小鼠妊娠早期子宫和胚胎中的表达及对胚胎植入的影响.结果显示:Furin和PC7在妊娠D1-D4小鼠子宫的腺上皮和D5-D7小鼠子宫的蜕膜、腺上皮高表达;PC7在植入前胚胎的2-细胞和4-细胞期表达很低,8-细胞期表达开始增加,囊胚期滋养外胚层有显著的高表达.Furin的抑制剂Dec-RVKR-CMK可显著抑制共培养体系中胚胎的粘附和扩展.以上结果表明,Furin在植入期胚胎的粘附和扩展中发挥重要作用.此外,Furin和PC7可能参与子宫内膜蜕膜化和早期胚胎发育.     

过表达FOXN1基因诱导人胚胎干细胞向胸腺上皮细胞定向分化的研究

通过在人胚胎干细胞中过表达转录因子FOXN1(forkhead box protein N1),观察细胞形态变化并检测标志基因的表达,成功地将其定向分化为胸腺上皮细胞。利用TALEN介导的同源重组在人胚胎干细胞中敲入FOXN1-m Cherry报告元件,使其能够指示内源FOXN1的表达。通过Teton诱导表达慢病毒系统在人胚胎干细胞系X-01中过表达FOXN1,发现人胚胎干细胞逐渐分化,细胞形态变扁平,细胞体积变大,表现出类似胸腺上皮细胞的形态。RT-PCR结果表明,过表达FOXN1后胸腺上皮细胞的标志基因TBX1、HOXA3、EYA1、K5、K8和内源FOXN1的m RNA水平都显著上调,并且随着诱导时间的延长而增加,在第12 d达到最高。对诱导后第12 d所得的细胞进行免疫染色可观察到K5(keratin 5)和K8(keratin 8)的表达,其中19%的细胞表达K5,45%的细胞表达K8。上述结果表明,通过过表达FOXN1可诱导人胚胎干细胞定向分化为胸腺上皮细胞。     

RNA结合蛋白CELF4对小鼠早期胚胎发育的作用

目的 观察RNA结合蛋白CELF4在小鼠早期胚胎中的分布与表达,初步探讨CELF4对小鼠早期胚胎发育的作用.方法 利用免疫荧光和Real-Time PCR检测CELF4在小鼠早期胚胎中的定位和mRNA表达,利用显微注射技术在1-细胞胚中注入CELF4抗体,观察其对小鼠体外早期胚胎发育的影响,以及对2-细胞期ZGA标志基...     

小鼠早期胚胎发育过程中细胞凋亡及凋亡基因表达的检测

小鼠早期胚胎发育过程中凋亡现象大量存在,细胞凋亡与凋亡基因表达有关。应用彗星电泳法检测小鼠早期胚胎凋亡情况;应用巢式RT-PCR、免疫组化的方法检测了Bcl-2家族成员(Bax、Bcl-2、Bak、Bcl-xl)的表达变化情况。结果显示:随着胚胎细胞数目的增加,凋亡比率逐渐增大;Bax表达量在整个过程中基本不变,Bcl-2表达量逐渐上调,Bak、Bcl-xl的表达量逐渐降低。对小鼠早期胚胎发育过程中的基因表达研究对于揭示早期胚胎发育的机制有重大的意义。     

sTRAIL基因引起人恶性畸胎瘤细胞与人胚胎干细胞凋亡比较

目的:评估sTRAIL基因引起人胚胎干细胞[human embryonic stem(hES)cells]和人恶性畸胎瘤(human malignant teratoma)细胞NTERA-2凋亡的作用。方法:本室已构建的pAAV-PEG3-sTRAIL质粒,转染NTERA-2和hES细胞,用流式细胞仪和定量PCR检测NTERA-2和hES细胞的早期凋亡及sTRAIL基因的受体的表达。结果:NTERA-2细胞经瞬时转染pAAV-PEG3-sTRAIL质粒后,早期凋亡比例达24.4%±2.1%,sTRAIL的死亡受体DR4、和DR5的表达分别上升2和3倍,而hES细胞转染pAAV-PEG3-sTRAIL质粒后,早期凋亡比例仅2.3%±1.2%,受体DR4、DR5、DcR1和DcR2的表达未有明显变化。结论:pAAV-PEG3-sTRAIL质粒可有效地引起人恶性畸胎瘤细胞NTERA-2的凋亡,但是对人胚胎干细胞尚未发现可见的细胞凋亡现象。     

Ghrelin在绵羊体内卵母细胞和早期胚胎的表达

为了明确ghrelin是否参与了卵母细胞成熟及胚胎早期发育进程,本研究利用免疫荧光技术和实时定量RT-PCR技术检测了绵羊卵母细胞和体内早期胚胎中ghrelin蛋白的表达定位和ghrelin mRNA水平相对表达变化规律。免疫荧光染色结果表明,ghrelin蛋白主要分布于卵母细胞胞质内;实时定量RT-PCR结果揭示绵羊卵母细胞和早期胚胎ghrelin mRNA的相对表达量依据发育阶段的不同而呈现一定变化规律,即在成熟卵母细胞,2细胞胚胎期和8细胞胚胎期显著高于未成熟卵母细胞和4细胞胚胎期(P<0.05),囊胚期表达量最高。卵母细胞和早期胚胎中ghrelin蛋白的表达及ghrelin mRNA特定的表达模式,揭示这一新型分子在绵羊卵母细胞成熟以及胚胎早期发育过程中具有潜在的调控作用。     

人类21号染色体转录调节相关基因作为早期分子诊断标记物的可行性研究

目的分析与转录调节相关的人类21号染色体(HC21)基因在小鼠植入前胚胎发育过程中的表达模式,初步阐明这些基因与早期胚胎发育的关系,发现这些基因作为分子诊断标记物的可行性。方法应用植入前胚胎的GlobalRT-PCR方法,对BACH1、RUNX1、SIM-2、ERG、KIAA0136、GCFC、SON、PKNOX1、HSF2BP和NRIP1小鼠同源基因在植入前发育阶段的表达模式进行研究。结果RUNX1、ERG和SON在整个植入前发育过程中都未见表达。其他基因的表达呈现出阶段特异性表达的特点:BACH1几乎在整个发育过程中都有表达,但是存在着胚胎个体之间的差异,不适于作为分子标记物;SIM-2只在1和2细胞期表达;Kiaa0136在2、4细胞期以外的各个阶段均表达;除了1-和2-细胞期,GCFC在其它阶段普遍表达;PKNOX1只在1、8细胞以及桑椹期表达;而HSF2BP和NRIP1的表达仅见于成熟的卵母细胞和1细胞期胚胎。结论与转录相关的小鼠HC21同源基因大部分参与了早期胚胎发育的转录调节,这些基因的阶段特异性表达说明他们参与了早期胚胎发育的不同转录调节环节,对这些基因的深入研究是认识唐氏综合症发生的分子机制和发现早期分子诊断标记的基础。     

人BAFF转基因斑马鱼的构建及早期免疫基因表达检测

目的建立人BAFF转基因斑马鱼模型,探讨其在自身免疫性疾病发病中的作用。方法RT-PCR法由人淋巴瘤细胞克隆了人BAFF基因全长855bp蛋白编码区域,构建表达人BAFF重组质粒Tol2-hBAFF,体外细胞转染并通过免疫印迹法验证蛋白表达。重组载体经显微注射斑马鱼受精卵后,GFP荧光跟踪并筛选阳性鱼。qPCR法检测早期免疫相关基因表达情况。结果人BAFF-GFP融合蛋白可成功表达,利用Tol2-hBAFF重组质粒显微注射斑马鱼受精卵可获得表达人BAFF的转基因斑马鱼,且表达人BAFF斑马鱼1dpf胚胎中TCRAC明显高表达,而Ikaros则表达量显著降低,表明在斑马鱼胚胎中表达人BAFF蛋白会造成早期淋巴系统中基因的过早表达。结论建立的表达人BAFF的转基因斑马鱼,可为系统性红斑狼疮等与BAFF功能亢进密切相关的自身免疫性疾病的治疗,及相关机制研究提供一种具有诸多优点的新型工具。     

人脐带间充质干细胞作为维持人胚胎干细胞生长饲养层细胞的研究

目的寻找可以维持人胚胎干细胞未分化生长的人源性细胞作为饲养层细胞,从而解决使用鼠源性细胞作为饲养层带来的安全问题。方法尝试以人脐带间充质干细胞作为饲养层细胞来培养人胚胎干细胞,检验其是否可以维持人胚胎干细胞的未分化生长状态。用胶原酶消化法分离人脐带间充质干细胞,光镜下观察细胞形态;流式细胞仪检测其表面标志;诱导人脐带间充质干细胞向成骨细胞和脂肪细胞进行分化。将人胚胎干细胞系H1接种于丝裂霉素C灭活后的人脐带间充质干细胞上,每隔5d进行一次传代。培养20代后,对人胚胎干细胞特性进行相关检测,包括细胞形态、碱性磷酸酶染色、相关多能性基因的表达、分化能力。结果从人脐带中分离出的间充质干细胞为梭形,呈平行排列生长或漩涡状生长;细胞高表达CD44、CD29、CD73、CD105、CD90、CD86、CD147、CD117,不表达CD14、CD38、CD133、CD34、CD45、HLA-DR;具有分化成脂肪细胞和成骨细胞的潜能。人胚胎干细胞在人脐带间充质干细胞饲养层上培养20代后,继续保持人胚胎干细胞的典型形态,碱性磷酸酶染色为阳性,免疫荧光染色显示OCT4、Nanog、SSEA4、TRA-1-81、TRA-1-60的表达为阳性,SSEA1表达为阴性,体外悬浮培养可以形成拟胚体。结论人脐带间充质干细胞可以作为人胚胎干细胞的饲养层细胞,支持其生长,并维持其未分化生长状态。     

基因表达谱分析牛早期胚胎发育过程的调控机理

早期胚胎的死亡会给畜牧业的发展带来巨大的经济损失, 特别是对于母牛生产来说更是如此, 因此研究早期胚胎发育过程具有极为重要的价值。文章从公共数据库GEO中选取了关于牛早期胚胎发育过程的一套基因表达谱数据, 通过显著性分析及聚类分析来研究牛早期胚胎发育过程中不同时期的基因组表达模式。结果表明: 整个牛早期胚胎发育过程大致可划分为3组不同的基因组表达模式阶段; 同时, 差显基因在不同时期表达量的波动情况表明8-细胞期和16-细胞期在牛的整个早期胚胎发育过程的重要性。另外, 通过进一步的功能注释和通路分析表明在牛胚胎早期发育不同阶段时期存在着一些重要因子及相关通路。     

ripply1在斑马鱼早期胚胎背腹发育中的作用

目的探究ripply1基因在斑马鱼早期背腹轴发生过程中的作用。方法利用斑马鱼整封原位杂交技术揭示ripply1基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达模式,通过显微注射技术在胚胎1细胞期注射ripply1的mRNA来高表达Ripply1蛋白并在后期观察胚胎背腹标记基因的变化及胚胎形态变化。利用Tol2转基因技术构建ripply1启动子驱动的GFP转基因鱼。结果原位杂交结果显示ripply1基因在斑马鱼原肠早期胚盾期特异表达在胚盾处,即预定的背部。高表达ripply1后,在胚盾期背部标记基因表达范围扩大,腹部标记基因表达减弱,受精后24小时胚胎表现出严重的背部化表型:头部增大,腹部卵黄延伸减弱,尾部躯干及尾部区域减少,有的甚至形成了第二个体轴。得到的转基因鱼揭示ripply1母源表达,并且转录起始位点上游1200个碱基驱动的GFP能模拟内源基因的表达图式。结论 ripply1可能参与斑马鱼胚胎早期背腹轴的发生。     

异源Oct-4基因启动子在猪、兔和小鼠早期胚胎中的时空表达活性

Oct-4是一种哺乳动物早期胚胎中特异表达的转录因子,它与细胞多能性的维持有关．异源Oct-4基因在早期胚胎中的表达模式尚不明确．构建了一个以完整的牛Oct-4调控区指导GFP表达的转基因结构pOct-4(p)-GFP,通过单精子注射的方法将其导入猪、兔和小鼠的受精卵中,分析其在胚胎发育过程中的表达情况．结果显示：牛Oct-4启动子驱动的GFP基因在3个物种的2-细胞胚胎就已经开始表达,在囊胚期表达加强且只特异表达于内细胞团中,而不表达于滋养层．研究表明：牛的Oct-4启动子在其他物种中也具有表达活性,异源性Oct-4启动子在不同物种的早期胚胎中具有相似的表达模式．