人转化生长因子β1cDNA在COS—7细胞中的表达

在测定了ＴＧＦβ１全长序列的基础上,构建了两个ＴＧＦβ１的表达载达ｐＣＭＶβ和ｐＳＶＬβ;分别从转录水平和翻译水平检测了这两个载本在ＣＯＳ－７细胞中的表达。同时利用ＣＯＳ－７短暂表达系统,建立了ＴＧＦβ１的生物测活法;并分别研究了上清收获时间、表达载体、转染方法对ＴＧＦβ１表达的影响。     

转译优化对EPO基因在COS7细胞中表达的影响

利用ＣＯＳ７细胞暂时表达系统,研究转译起始序列对ＥＰＯ－ｃＤＮＡ表达的影响。通过ＤＮＡ重组技术,构建了原ＥＰＯ－ｃＤＮＡ表达载体ｐＣＳＶ－ＥＰＯ（１）,其转译起始序列为５＇ＡＡＴＴＣＡＴＧＧ３＇。同时通过定点突变技术,将起始序列改变成５＇ＣＣＡＣＣＡＴＧＧ３＇,而构建了另一表达载体ＰＣＳＶ－ＥＰＯ（２）。后经序列分析证明无误后和前均通过ＤＥＡＥ－ｄｅｘｔｒａｎ法转染ＣＯＳ７细胞上清,测定结果为     

SV40载体在COS7细胞中的复制及外源基因的表达

为评价SV4 0载体 COS7稳定表达系统的可能应用价值 ,将含人组织型纤溶酶原激活剂 (t PA)编码区的SV4 0载体pctPA转染COS7细胞 ,并以G4 18选择培养 2 8d ,得到稳定的抗性细胞库 .Southern印迹和溶圈法分别分析该细胞库在随后的细胞传代中细胞内附加体拷贝数及t PA表达水平的变化 .在经选择培养 2 8d的COS7细胞库中 ,质粒pctPA以染色体外附加体的形式存在 (30 0拷贝 细胞 ) ,t PA的表达水平为 1 1μg d(10 6细胞 ) .在随后 3个月的动态观察中 ,随着细胞传代 ,该COS7细胞库tPA的表达水平虽逐渐递减 ,但在第 1个月内可保持在 1μg d(10 6细胞 )以上 .基于SV4 0载体 COS7稳定表达系统无需筛选克隆 ,在稳定的抗性细胞库形成后的 1个月内可能保持目的基因的高水平表达 ,因而较适合于需同时制备多种重组蛋白的实验 .     

人转化生长因子β1 cDNA在COS－7细胞中的表达

在测定了ＴＧＦβ１全长序列的基础上,构建了两个ＴＧＦβ１的表达载体ｐＣＭＶβ和ｐＳＶＬβ;分别从转录水平和翻译水平检测了这两个载体在ＣＯＳ－７细胞中的表达。同时利用ＣＯＳ－７短暂表达系统,建立了ＴＧＦβ１的生物测活法;并分别研究了上清收获时间、表达载体、转染方法对ＴＧＦβ１表达的影响     

SMAD3介导TGF-β1抑制MMP9在COS7细胞中的表达

用明胶酶谱的方法检查了野生型和Smad3ex8 ex8纯合突变小鼠血清中基质金属蛋白酶(MMP9)的活性 .发现突变小鼠血清中MMP9的含量较正常小鼠的明显增高 ,提示SMAD3有抑制MMP9表达的功能 .通过细胞转染实验证实 ,TGF β1和野生型的SMAD3可以抑制COS7细胞分泌MMP9,而C端缺失的突变型Smad3基因过表达可以解除这种抑制作用 ,说明SMAD3介导TGF β1信号抑制MMP9在COS7细胞中的表达 .     

pEGFP-植酸酶基因质粒重组构建及其在COS7细胞中表达分析

采用PCR技术扩增细菌酸性植酸aPPA2基因ORF序列,其DNA分子为1 299 bp,编码432氨基酸,蛋白质分子量约为48 kD a。此植酸酶基因被克隆到pEGFP-N3表达载体的BamH1和Pst1克隆区域,重组的pEG-FP-aPPA2重组质粒经转化到哺乳类培养细胞COS7中。重组的pEGFP-N3-aPPA2在COS7细胞中正常表达并检测出高的植酸酶活性。本研究提出的pEGFP-N3-aPPA2重组质粒构建和在哺乳类COS7细胞表达体系为植酸酶生产提供了新的技术线路。     

脊髓损伤修复相关10号蛋白在COS7细胞中的表达、纯化与鉴定

目的:在COS7细胞中表达脊髓损伤修复相关10号蛋白(SCIRR10),并对表达产物进行纯化和鉴定。方法:在实验室前期研究基础上,用PCR方法扩增SCIRR10基因,将其克隆入pcDNA3.1/myc-HisA穿梭质粒中,转染COS7细胞进行表达;对表达产物用金属螯合层析方法纯化,并进行SDS-PAGE和Western印迹检测。结果及结论:构建了含有SCIRR10基因的穿梭质粒pcDNA3.1/myc-His-SCIRR10,并使其在COS7细胞中得到表达,纯化后的重组蛋白SCIRR10-His-myc的纯度在80%以上,可用于下一步的实验研究。     

人溶酶体酸性b-葡萄糖脑苷脂酶基因的克隆及其在COS7细胞中的表达

从人胎盘组织提取总RNA, 采用RT-PCR扩增人溶酶体酸性b-葡萄糖脑苷脂酶(Lysosomal acid b-glucosidase, GlcCerase)基因编码区的全部序列, 并克隆到pMD-19T载体上, 构建克隆载体pMD-GlcCerase。经测序验证后, 将GlcCerase亚克隆至表达载体pEGFP-C1上, 构建了人GlcCerase绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-GlcCerase。采用脂质体法将其瞬时转染至COS7细胞系后, 在细胞中检测到了GlcCerase基因, 并在细胞裂解产物中检测到了GlcCerase生物活性的表达。GlcCerase基因的克隆及其表达, 为进一步了解GlcCerase基因的功能以及利用转基因动物乳腺生物反应器高效生产GlcCerase奠定了基础。     

过量表达Wnt-1基因诱导P19细胞的神经分化

Ｗｎｔ－１基因在小鼠神经发育过程中起着重要的作用。该基因在胚胎性癌细胞Ｐ１９细胞经分化过程中存在瞬时性表达。利用克隆到的Ｗｎｔ－１基因转染Ｐ１９细胞,可使细胞不经视黄酸诱导,自发向神经细胞方向分化。     

hBMP—2cDNA在COS细胞和小鼠肌肉中的表达

研究了骨形态发生蛋白ＢＭＰ－２ｃＤＮＡ在ＣＯＳ细胞和小鼠肌肉中的表达的情况,从ｐＳＰＳ６５ＢＭＰ－２质粒中回收ＢＭＰ－２ｃＤＮＡ,删除５端的非翻译序列,插入ｐＳＶＬ载体中,构建了含有ＢＭＰ－２全长编码序列的重组表达质粒ｐＳＶＬＢＭＰ－２将表达质粒导入ＣＯＳ－７细胞中,细胞ＲＮＡ点杂交结果表明,转染ＢＭＰ－２基因的细胞内ＢＭＰ－２的ｍＲＮＡ水平明显升高,细胞培养上清的ＥＬＩＳＡ显示,转染ＢＭＰ－２ｃ     

The distribution of circulating receptors on COS 7 cells

Rapidly circulating receptors on the surfaces of migrating or spreading cells are often concentrated toward the cells' leading edges. This polar distribution is the principal evidence that circulating membrane is returned to the surface of these cells at their fronts, where it is proposed to assist the forward extension of the cell. However, when low-density lipoprotein (LDL) receptors are transiently expressed in COS cells-cells which actively spread-their distribution is random, indicating that COS cells do not behave like other motile cells. This anomaly is examined here. I find that COS cell lines expressing either transferrin or LDL receptors do, in fact, usually have polar distributions of both receptors. The transient expression of LDL receptors interferes, in an unknown way, with the polar properties of COS cells. Furthermore, it is shown that whether receptors are located toward the cell's edge or are randomly distributed depends both on the ability of the receptor to circulate and on the state of the particular cell at that time.     

过表达Gpr3诱导猪颗粒细胞G1阻滞及凋亡

G蛋白偶联受体3（Gpr3）属于G蛋白偶联受体视紫质家族成员. Gpr3通过激活Gs蛋白介导的下游信号通路,维持卵泡卵母细胞减数分裂的前期阻滞,但在卵泡颗粒细胞中的作用不清. 为了明确Gpr3在猪卵泡颗粒细胞中的功能,构建了Gpr3基因的真核表达载体,利用过表达的方式激活其介导的信号通路,并利用MTT、流式细胞术和real-time PCR等方法检测了过表达Gpr3对猪卵泡颗粒细胞增殖及凋亡的影响. 结果显示,过表达Gpr3后,猪颗粒细胞的增殖水平显著下调,G0/G1期细胞的百分比增加,S期细胞减少,Cyclin B1和CDK1 mRNA的表达量也显著降低;同时,显著增加了颗粒细胞的凋亡率,在抑制Bcl-2表达的同时,促进了Bax的表达. 结果表明：过表达Gpr3在猪颗粒细胞中具有抑增殖促凋亡的作用,丰富了其在调节卵泡发育过程中的生物学功能.     

外源过表达CPNE5基因增强HEK293细胞对Zeocin的敏感性

目的：探讨Zeocin处理是否能增强CPNE5基因诱导细胞凋亡的作用。方法：分别构建CPNE5基因稳定过表达和抑表达载体,转染HEK293细胞,形成克隆后,用RT-PCR、MTT法分析CPNE5基因过表达和抑表达的HEK293单克隆细胞对Zeocin作用的敏感性。结果：CPNE5基因过表达的HEK293单克隆细胞对Zeocin反应敏感性增加。结论：Zeocin能增强CPNE5基因诱导细胞凋亡的作用。     

Development of a STAT3 reporter prostate cancer cell line for high throughput screening of STAT3 activators and inhibitors

STAT3 is constitutively activated in several cancers, including prostate cancer, and is therefore, a potential target for cancer therapy. DU-145 prostate cancer cells were stably co-transfected with STAT3 reporter and puromycin resistant plasmids to create a stable STAT3 reporter cell line that can be used for high throughput screening of STAT3 modulators. The applicability of this cell line was tested with two known activators and inhibitors of STAT3. As expected, EGF and IL-6 increased STAT3 reporter activity and enhanced the nuclear localization of phosphorylated STAT3 (pSTAT3); whereas Cucurbitacin I and AG490 decreased STAT3 reporter activity dose and time-dependently and reduced the localization of pSTAT3 in the nuclei of prostate cancer cells. Given the importance of STAT3 in cancer initiation and progression, the development of a stable STAT3 reporter cell line in prostate cancer cells provides a rapid, sensitive, and cost effective method for the screening of potential STAT3 modulators.