低免疫原性的新型葡激酶ΔNMSak在大肠杆菌中的高效表达和分离纯化

为了降低野生型葡激酶 (wild- type staphylokinase,wt- Sak)的免疫原性 ,对已构建的葡激酶N端缺失突变体 (ΔNSak) c DNA进行改造 ,将其主要的抗原决定簇编码序列突变为丙氨酸密码子 .该突变体 (ΔNMSak) c DNA与原核表达载体 p LY- 4重组后 ,转化大肠杆菌 JF1 1 2 5.经温度诱导 ,ΔNMSak获得高效表达 ,重组蛋白占全菌总蛋白的 60 % ,以包涵体形式存在 .包涵体经洗涤 ,8mol/L尿素溶解 ,稀释复性 ,离子交换色谱一步分离至电泳纯 ,纯度达 95%以上 ,分子量与理论值相符 ,比活性 8.5× 1 0 4 HU/mg.经 ELISA法、发色底物法测定 ,ΔNMSak与 wt- Sak制备的兔抗wt- Sak抗血清的免疫反应性显著降低 ,经抗血清温育后 ,wt- Sak活性下降程度远高于 ΔNMSak.ΔNMSak、wt- Sak分别免疫豚鼠 ,以 ELISA法测定豚鼠血清中相应抗体的效价 ,ΔNMSak组的抗体效价明显低于 wt- Sak组 ,表明 ΔNMSak的免疫原性显著下降 .     

低免疫原性的新型葡激酶ΔNMSak在大肠杆菌中的高效表达和分离纯化

为了降低野生型葡激酶 (wild- type staphylokinase,wt- Sak)的免疫原性 ,对已构建的葡激酶N端缺失突变体 (ΔNSak) c DNA进行改造 ,将其主要的抗原决定簇编码序列突变为丙氨酸密码子 .该突变体 (ΔNMSak) c DNA与原核表达载体 p LY- 4重组后 ,转化大肠杆菌 JF1 1 2 5.经温度诱导 ,ΔNMSak获得高效表达 ,重组蛋白占全菌总蛋白的 60 % ,以包涵体形式存在 .包涵体经洗涤 ,8mol/L尿素溶解 ,稀释复性 ,离子交换色谱一步分离至电泳纯 ,纯度达 95%以上 ,分子量与理论值相符 ,比活性 8.5× 1 0 4 HU/mg.经 ELISA法、发色底物法测定 ,ΔNMSak与 wt- Sak制备的兔抗wt- Sak抗血清的免疫反应性显著降低 ,经抗血清温育后 ,wt- Sak活性下降程度远高于 ΔNMSak.ΔNMSak、wt- Sak分别免疫豚鼠 ,以 ELISA法测定豚鼠血清中相应抗体的效价 ,ΔNMSak组的抗体效价明显低于 wt- Sak组 ,表明 ΔNMSak的免疫原性显著下降 .     

Arg77和Glu80定点突变同时去除葡激酶中的T和B细胞抗原表位

【目的】对葡激酶的T和B细胞抗原表位重叠的关键氨基酸Arg77和Glu80进行定点突变以降低葡激酶的免疫原性。【方法】基于Arg77和Glu80的溶剂可及表面积设计葡激酶的突变体;突变体在大肠杆菌DH5α中进行表达。经过三步层析法纯化后,分析突变体的纤溶活性和免疫原性。【结果】免疫学实验提示,葡激酶导致Th2免疫反应;Glu80突变为丙氨酸和丝氨酸减少了溶剂可及表面积,同时去除了部分T和B细胞抗原表位;Arg77突变为天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸仅去除了部分T细胞抗原表位;6个组合突变体中,Sak(R77Q/E80A)和Sak(R77Q/E80S)有效去除了部分B和T细胞抗原表位,降低了葡激酶的免疫原性;Sak(R77Q/E80A)and Sak(R77Q/E80S)的纤溶活性和催化效率与r-Sak相当。     

复合干扰素突变体在毕赤酵母中的表达、纯化及活性分析

根据毕赤酵母密码子偏性合成了复合干扰素突变体基因 ,克隆至分泌型酵母表达载体pMEX9K ,将重组载体pMEX CIFNm用SacⅠ线性化后 ,转化毕赤酵母GS115 .转化子经诱导后 ,培养上清有抗病毒活性的蛋白产生 .经过离子交换 ,疏水层析 ,凝胶过滤三步层析纯化 ,得到了纯度大于95 %的重组复合干扰素突变体 ,经N端氨基酸序列分析表明 ,该蛋白N端序列与理论值一致 ,质谱测定分子量为 19 3kD ,与理论值一致 .用细胞病变抑制法测定其活性 ,并结合Lowry法蛋白定量计算其比活性为 6× 10 8IU mg ,与复合干扰素的比活相当 .     

重组溶葡萄球菌酶在牛奶中的性质研究

溶葡萄球菌酶(Lysostaphin)是一种能高效裂解葡萄球菌细胞壁的肽链内切酶,已有研究表明其能够有效预防和去除奶牛乳腺中葡萄球菌的感染,但该酶在牛奶中的性质研究还缺少详细的研究数据.现对重组溶葡萄球菌酶在牛奶中的一些性质进行研究.检测了加入溶葡萄球茵酶后牛奶性状的变化和重组溶葡萄球菌酶在牛奶中的酶活的稳定性以及溶葡萄球菌酶在牛奶中的抑、杀菌活性.结果显示,重组溶葡萄球菌酶未改变牛奶的外观性状;并且重组溶葡萄球菌酶在39℃牛奶中可以稳定存放至少20 h以上,酶活性保持稳定;同时重组溶葡萄球菌酶在牛奶中对金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌仍然保持了良好的抑杀菌效果.该研究为今后溶葡萄球菌酶用于奶牛乳腺炎的治疗提供参考依据.     

葡萄球菌激酶作为新型溶栓剂的研究进展

近年来对溶栓剂的研究取得了很好的成果,主要集中在单链尿激酶型纤溶酶原激活剂(scuPA),组织型纤溶酶原激活剂(tPA),葡萄球菌激酶(SaK)等。葡萄球菌激酶(SaK)是一种激活溶纤维蛋白的制剂,它与纤溶酶原(Plg)形成1∶1的复合体,使后者转变为纤溶酶(Pli)后激活其他分子变为Pli。从葡激酶的溶栓作用机制,包括与纤溶酶(原)等因子的结合作用,葡激酶的高级结构,抗原性等问题以及近年来有关葡激酶作为新一代溶栓的研究进展进行了综述,并指出进一步利用蛋白质工程,对葡激酶进行分子改造的设想。     

Effect of site-specific PEGylation on the fibrinolytic activity,immunogenicity, and pharmacokinetics of staphylokinase

The bacterial plasminogen-activator staphylokinase （Sak） is a promising thrombolytic agent for treating acute myocar- dial infarction. To effectively reduce the immunogenicity of Sak while maintaining its fibrinolytic activity, site-specific PEGylation was performed in the present study. The che- moselective cysteine PEGylation site was selected within an immunodominant region （amino acid residues 71-87） using an in sUico approach. The PEGylated Sak variants pre- pared in this study showed a purity of 〉97.0%. PEGylation at Position 80 resulted in a Sak variant Sak（E80C-PEG） which has similar fibrinolytic activity and thermostability compared with the native recombinant staphylokinase （r-Sak）. The immunogenicity of Sak（E80C-PEG） in guinea pigs was greatly reduced compared with the native r-Sak. Furthermore, preliminary pharmacokinetic results sug- gested that the plasma clearance of Sak（E80C-PEG） from the blood stream of rabbit was significantly decreased com- pared with that of r-Sak, resulting in a 2.8-fold increase of initial half-life and a 3.8-fold increase of systemic availabil- ity. In summary, these results demonstrated that site-specif- ic PEGylation yielded a novel Sak variant Sak（E80C-PEG） with remarkable advantages over the unmodified Sak.     

Cloning and Expression of EGFR Tyrosine Kinase and Construction of the Screening Model for the Enzymatic Inhibitors

表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)属受体酪氨酸激酶(Tyrosine kinase,TK)家族,其胞内的酪氨酸激酶在细胞信号转导通路中具有十分重要的作用。许多肿瘤的发生、发展都与EGFR胞内酪氨酸激酶的异常表达密切相关。因此,EGFR胞内酪氨酸激酶的抑制剂有可能成为治疗肿瘤的有效药物。本研究从人脐静脉内皮细胞(HUVEC) 提取总RNA,采用RT-PCR获得EGFR酪氨酸激酶催化域的编码基因。将其克隆至载体pET-30a,在E.coli BL21(DE3)中进行了成功表达,采用Ni-NTA亲和层析对其进行了纯化。通过对酶的活性的测定,证明重组EGFR酪氨酸激酶蛋白具有利用ATP催化底物发生磷酸化反应的激酶活性。以该重组激酶为靶位构建了酶抑制剂筛选模型,拟对微生物代谢产物进行筛选。     

东亚飞蝗主要过敏原精氨酸激酶基因的克隆表达、纯化及免疫原性鉴定

本研究克隆了东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis(Meyen)精氨酸激酶(arginine kinase,AK)基因全长,表达并纯化重组AK蛋白,研究重组蛋白的免疫反应性。东亚飞蝗AK基因开放阅读框全长为1 068 bp,编码355个氨基酸,与GenBank中已登录的东亚飞蝗AK(DQ513322)基因同源性为98%,重组质粒pET-28a-AK在E.coli中获得高效表达,重组蛋白相对分子质量(Mr)约为40 000,主要以可溶性形式表达,经亲和层析获得重组蛋白。通过免疫印迹分析结果表明,重组AK蛋白可被过敏性患者血清识别,免疫原性良好。结果表明我们成功获得东亚飞蝗精氨酸激酶全长基因并表达出重组AK蛋白,重组AK蛋白具有良好的免疫反应性。     

重组酿酒酵母腺苷激酶的表达、纯化和鉴定

腺苷激酶 (adenosinekinase ,AK)是控制细胞中腺苷浓度的一种关键酶 ,在许多细胞和组织中发挥着重要的生理效应子作用。从酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)中克隆了腺苷激酶基因 (ak) ,并将其接入大肠杆菌pET16b表达质粒中进行表达。重组蛋白质经部分纯化后 ,测定其酶动力学常数 ,结果表明该酶对腺苷的Km 值为 (3.5± 0 .2 ) μmol L ,对ATP的Km 值为(10 0 .0± 11.0 ) μmol L ,对腺苷的kcat值为 (15 30± 2 0 )min- 1 ,对ATP的kcat值为 (14 4 8± 2 5 )min- 1 。该酶对其他核苷和脱氧核苷的Km 值测定数据表明 ,从酵母中克隆得到的该重组腺苷激酶具有较高的底物特异性。     

环境保护及农业废物利用

951818利用工程化大肠杆菌株产生和释放多酸酸盐[英]/Yamada,K.…,Appl.Environ.Microbi01.一1994,60(10).一3485～3490[译自DBA,1994.13(24),94一14416] 含有质粒基因(编码磷酸专一性转运(Pst)系统和多磷酸盐激酶(poly PK))的重组大肠     

葡激酶及其化学修饰研究进展

葡激酶(SAK)是一种由金黄色葡萄球菌分泌的含有136个氨基酸残基的蛋白质,大量研究证明它具有潜在的溶血栓特性。但葡激酶是一种外源蛋白,注入体内会引起不良反应,解决这些问题的重要途径就是对蛋白质进行化学修饰。本综述SAK的结构、洛栓机理、化学修饰及临床研究等。     

MKK6重组腺病毒的构建与制备

构建腺病毒穿梭载体pAd RSV ,并将p3 8MAPK (mitogen activatedproteinkinase)的上游激酶MKK6(mitogen activatedproteinkinasekinase 6)及其持续激活和无活性的突变体基因亚克隆到该穿梭载体 .通过与腺病毒DNA(pJM17)在能够表达E1的HEK 2 93细胞同源重组生成了能够表达MKK6信号分子的重组腺病毒 .PCR结果表明 ,这些重组腺病毒DNA的插入片段大小是正确的 .而且 ,通过感染COS 7细胞 ,用免疫激酶活性测定证实这些重组的腺病毒能够表达具有功能的蛋白质 .     

抗溶葡萄球菌酶N端合成多肽抗体的制备与鉴定

为了制备抗溶葡萄球菌酶N端合成多肽抗体,合成了溶葡萄球菌酶(lysostaphin)分子的3-13位的11个氨基酸的多肽(THEHSAQWLN),并利用戊二醛双功能试剂将人工合成多肤成功地与KLH进行偶联.免疫新西兰兔制备抗lysostaphin合成多肽的抗体,并经亲和层析进行了纯化.对此抗体进行鉴定的结果表明,抗溶葡萄球菌酶合成多肽抗体可与重组溶葡萄球菌酶分子发生特异性反应,并可用于蛋白免疫印迹.该抗体的制备为使用亲和层析纯化溶葡萄球菌酶提供了有用的配基.     

马铃薯成分分析及其淀粉功能特性探究

[目的]以885号、602号和荷兰7号马铃薯为研究对象,分析其主要成分及淀粉冻融稳定性、膨胀度、溶解度和透明度等功能性质。[方法]按照国标测定各成分含量及特性。[结果]水分及淀粉含量均为荷兰7号 885号 602号,还原糖含量最高的是602号,蛋白质含量为荷兰7号 602号 885号,多酚含量为602号荷兰7号 885号,维生素C含量为885号 602号荷兰7号。602号淀粉析水率最低(70. 45%±1. 59%),885号淀粉膨胀度最高(14. 43%±1. 54%);荷兰7号淀粉具有最好溶解度(30. 00%±1. 77%)。602号淀粉透明度最高为(58. 88%±2. 60%)。[结论]不同品种马铃薯的主要成分不同,淀粉膨胀度和溶解度随温度的升高而增大。602号透光率最高、冻融稳定性最好,可作为淀粉加工原料品种。     

一种表达人T淋巴细胞病毒Ⅲ型包膜基因的牛痘病毒重组体

<正>含有完整HTLV—Ⅲ env基因的DNA片段,它们起始于推定的翻译起始密码子,或起始于该密码子前方706bp处,这些DNA片段被置于牛痘病毒启动区控制之下。以其胸腺核苷激酶阴性(TK~-)表型为基础,挑选牛痘病毒重组体的蚀斑法,借助加到琼脂糖覆盖层中的指示剂鉴定表达的β—半乳糖苷酶而形成兰色。用聚丙烯酰胺凝胶电泳法证明,纯化的重组牛头病毒V25和V26感染     

金黄色葡萄球菌核酸酶基因缺失突变株RN4220△nuc1的构建

金黄色葡萄球菌存在两个核酸酶编码基因,一个是葡萄球菌核酸酶(Staphylococcal nuclease,SNase),命名为nuc1,另一个是耐热核酸酶(Thermonuclease,TNase),命名为nuc2,nuc2是一个新的候选基因,以往认为金黄色葡萄球菌中的核酸酶只源于一个编码基因nuc1,为了进一步研究nuc2基因的功能,首先要将金黄色葡萄球菌nuc1基因缺失.研究目的就是通过构建同源重组质粒pBT2莫玭uc1,将其电转入金黄色葡萄球菌菌株RN4220中,获得nuc1基因缺失突变株.经过了7轮培养和筛选,同源重组几率为2%(7/345),筛选出的nuc1突变株用PCR方法和RT-PCR进行了验证,从而获得了nuc1基因缺失突变株RN4220△nuc1.     

肌球蛋白轻链激酶CaM结合位点突变体的构建

目的:平滑肌肌球蛋白轻链激酶(myosin light chainkinase,MLCK)具有激酶活性和非激酶活性,在平滑肌收缩过程中起着关键酶调控的作用.为探寻MLCK的非激酶活性区域对MLCK活性的影响,本实验利用分子生物学技术构建了肌球蛋白轻链激酶CaM结合位点突变体,并纯化出重组的MLCK表达的蛋白质,为深入研究MLCK的非激酶活性在调节平滑肌收缩过程中的分子机制提供了实验基础.方法:利用野生型MLCK全长的cDNA序列设计CaM结合位点的突变引物,利用PCR技术进行定点突变,获得CaM结合位点的突变体(△CaM/MLCK).在大肠杆茵中表达重组CaM结合位点的突变体(△CaM/MLCK),通过亲和层析及凝胶过滤进行分离纯化重组蛋白,SDS-PAGE检测表达及纯化的重组蛋白.结果:构建重组MLCK钙调蛋白结合位点突变体(△CaM/MLCK),△CaM/MLCK在大肠杆菌中以可溶形式大量表达并得到纯化.结论:成功构建重组MLCK钙调蛋白结合位点突变体(△CaM/MLCK)并获得纯化的表达蛋白质.     

单克隆抗体亲和层析法纯化重组溶葡萄球菌酶

溶葡萄球菌酶能够特异性杀灭金黄色葡萄球菌且不易产生耐药性, 有望成为治疗葡萄球菌属细菌引发感染的特效药物。为获得高纯度的重组溶葡萄球菌酶以达到药用标准, 本研究构建了一种以重组溶葡萄球菌酶单克隆抗体为配体的亲和层析纯化方法。纯化后的重组溶葡萄球菌酶纯度大于95%, 得率大于90%, 即使重复使用30多次, 纯化效率不变。且经比色法鉴定纯化后的重组溶葡萄球菌酶仍具有良好的活性。该方法步骤简单, 纯化效果好, 为生产高纯度重组溶葡萄球菌酶奠定了基础。     

重组葡激酶对小型猪冠脉血栓的溶栓作用研究*

目的: 评价重组葡激酶的溶栓效力,并与相同作用方式的重组链激酶进行比较。方法: 30只中国实验小型猪分成5组,分别为溶剂对照组、阳性药对照组和三个重组葡激酶组,每组6只,采用麻醉动物、手术开胸、直流电刺激形成冠脉血栓;在冠脉血栓形成30 min后开始静脉给药,采用先推注、再蠕动泵恒速输注的方式给药;溶剂对照组静脉推注对照液,阳性药对照组静脉给予重组链激酶4 mg·kg^-1,三个重组葡激酶组分别静脉给予4 mg·kg^-1、2 mg·kg^-1、1 mg·kg^-1重组葡激酶,静脉推注体积为5 ml,1 min内注毕,输注速度为0.5 ml·min^-1,60 min内输毕,120 min后放血处死动物。于给药前及给药后30、60、120 min取静脉血,实验结束后取血栓形成部位的冠脉血管段,分别检测优球蛋白溶解时间(ELT)、血纤维蛋白原含量(Fbg)、纤维蛋白(原)降解产物(FDP)和伤口出血量,检测冠脉血栓溶解率、心肌缺血程度及缺血范围。结果: 与溶剂对照组相比,试验组ELT明显缩短(P＜0.05或P＜0.01),FDP 明显升高(P＜0.05或P＜0.01),较少量实验动物Fbg降解超过20%,对小型猪血压及心率无明显影响。与对照组相比,试验组高、中2个剂量组,最大血栓面积分别减少34.3%、15.4%(P＜0.05)。与等剂量的重组链激酶相比,重组葡激酶对电刺激引起的冠脉血栓具有更强的溶栓作用(P＜0.05或P＜0.01),引起的出血副反应少。结论: 重组葡激酶对小型猪冠脉血栓有较好的溶栓作用,相比重组链激酶,溶栓速度快、具有更高的纤维蛋白专一性,出血副反应较少。综合比较, 2 mg·kg^-1重组葡激酶具有较好的临床疗效和安全性保障。