Rhox5基因真核表达质粒的构建及其在NIH3T3细胞中的稳定表达

目的:构建同源异性框基因Rhox5的真核表达质粒,转染NIH3T3细胞,建立稳定过表达Rhox5的细胞系。方法:PCR方法扩增Rhox5的全长cDNA序列,PCR产物双酶切后和人工合成的HA抗原表位标签共同克隆至pcDNA3.1(-)哺乳动物细胞表达载体中,构建pcDNA-Rhox5-HA融合表达质粒。脂质体法将经过测序成功的pcDNA-Rhox5-HA融合质粒和pcDNA3.1空载体分别转染NIH3T3细胞,潮霉素B筛选后建立阴性对照pcDNA3.1 in NIH3T3和稳定过表达Rhox5的Rhox5-HA in NIH3T3细胞系。RT-PCR和western blotting方法检测Rhox5-HA在稳定转染细胞系中的表达情况。结果:成功构建了pcDNA-Rhox5-Myc重组质粒,获得稳定过表达Rhox5的NIH3T3细胞系。RT-PCR和Western blotting结果表明,构建的稳定细胞系中成功表达Rhox5-HA融合蛋白。结论:Rhox5基因真核表达质粒的构建及其在NIH3T3细胞中的稳定表达为进一步体外研究Rhox5蛋白单独的功能及其与其他分子间功能性相互作用奠定了实验基础。     

IFITM1基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的:获得IFITM1基因片段并构建真核表达质粒.方法:采用RT-PCR技术扩增IFITM1,将扩增产物连接至pcDNA3.1载体,对重组质粒进行测序验证,结果:构建了真核表达质粒pcDNA3.1-IFITM1,通过酶切、测序等方法验证完全正确.结论:成功构建了IFITM1基因的真核表达质粒,为下一步探讨IFITM1基因在子宫颈癌HeLa细胞中的作用提供了实验基础.     

禽流感病毒HA基因真核表达质粒的构建与表达

血凝素蛋白（HA）基因是禽流感病毒（AIV）重要的保护性抗原基因.为了研究 HA基因疫苗,用PCR扩增H5亚型AIV HA基因,将其克隆到质粒pcDNA4/HisMax和pRc/CMV上得到真核表达质粒pC4H5和pCMVH5.采用Tfx^TM-20、Superfect转染试剂和电转染法转染HeLa细胞,转染后的HeLa细胞经蛋白质印迹和血凝试验检测HA蛋白及其活性.结果表明,Superfect转染和电转染均能正确表达HA蛋白并具有生物学活性,蛋白质印迹检测到HA和HA裂解的HA1和HA2,与AIV 的HA、HA1、HA2蛋白的分子质量一致.从血凝试验结果看,Superfect和电转染表达的HA均具有血凝活性,而经Superfect转染的pC4H5的表达量是pCMVH5的8倍,表明pC4H5是一高效的真核表达质粒.     

结核分枝杆菌Rv1884基因真核表达质粒的构建及表达

目的:构建结核分枝杆菌Rv1884基因真核表达载体。方法:PCR扩增Rv1884基因,测序正确后克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-);经酶切鉴定正确的重组质粒酶以阳离子聚合物转染P815细胞后,以RT-PCR方法检测mRNA的表达,以间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达。结果:构建了重组质粒pcDNA-Rv1884;RT-PCR结果证明Rv1884可在P815细胞中转录;用间接免疫荧光检测,表达有Rv1884蛋白的细胞着染。结论:构建了结核分枝杆菌Rv1884基因的真核表达载体pcDNA-Rv1884,Rv1884基因可以在P815细胞中表达。     

IBDV多聚蛋白基因真核表达质粒的构建与表达

将IBDV上海超强毒株的多聚蛋白基因(vp2-4-3)克隆入真核表达载体pALTER-MAX,构建成功pALTER-MAX-VP2-4-3真核表达质粒,经纯化后,pALTER-MAX-VP2-4-3在LipofectamieTM 2000介导下转染Vero细胞、11日龄鸡胚的绒毛尿囊膜(CAM)和肌肉注射2日龄的雏鸡,1周后,分别提取细胞或组织中的总DNA或总RNA,用DIG标记探针均可检测到阳性杂交信号;转染的Vero细胞飞片和肌肉冰冻切片,进行免疫荧光检测均呈现阳性结果;转染的鸡胚CAM匀浆上清,用兔抗IBDV超强毒的高免血清,经Dot-ELISA检测呈现阳性.表明转染后基因获得表达,表达的蛋白具有免疫反应性.     

沙眼衣原体真核表达质粒pcDNA4/CT703的构建及其表达

目的：构建含沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis, Ct）基因CT703的真核重组表达质粒pcDNA4/CT703,并检测其在HeLa细胞中的表达.方法：利用RT-PCR扩增CT703基因,然后将其亚克隆到真核表达载体pcDNA4,PCR、双酶切和测序检测重组质粒.将正确的重组质粒瞬时转染HeLa细胞,免疫荧光和Western Blot实验检测重组质粒目的蛋白表达. 结果：经PCR、双酶切和测序鉴定后,成功构建了真核重组表达质粒pcDNA4/CT703,将其转染HeLa细胞后,免疫荧光和Western Blot实验能检测到目的蛋白的表达.结论：成功构建了重组质粒pcDNA4/CT703,并能在HeLa细胞中表达,为进一步研究CT703的功能奠定了基础.     

猪瘟病毒E2基因真核表达质粒的构建及基因疫苗的研究

构建了猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)主要保护性抗原E2基因4种不同的真核表达质粒.小鼠免疫试验表明,E2基因上不同的功能区对基因疫苗的免疫应答有很大影响,有信号肽序列的E2基因可诱导产生特异性免疫反应,且无跨膜区序列的E2基因所诱导的免疫应答反应比有跨膜区序列的强,而无信号肽序列的E2基因则不能诱导产生CSFV特异性的免疫反应.攻毒保护试验表明,免疫家兔最少可抵抗10个最小感染剂量(MID)的猪瘟兔化弱毒苗(Hog cholera lap-inized virus, HCLV)的攻击;免疫猪可抵抗致死剂量的CSFV石门株强毒的攻击.     

pcDNA3.1(+)-CTGF真核表达质粒构建及其在人成骨样细胞SaOS-2细胞中的表达*

目的:构建结缔组织生长因子(CTGF)的pcDNA3.1(+)真核表达质粒(pcDNA3.1(+)-CTGF),并检测其在人成骨样细胞SaOS-2中的表达,为进一步研究CTGF基因在骨发育和骨修复中的机制提供技术支撑。方法:采用PCR方法体外克隆CTGF基因全序列,将其用同源重组技术连接到线性pcDNA3.1(+)载体上,构建pcDNA3.1(+)-CTGF真核表达质粒,并对该质粒进行测序鉴定;鉴定无误后转染至SaOS-2细胞中,观察其48 h的表达情况。结果:基因测序证实pcDNA3.1(+)-CTGF真核表达重组质粒构建成功,与对照组相比,转染SaOS-2细胞48 h后的CTGF表达水平显著上调,达到对照组的4.8×10⁵倍(P＜0.01)。结论:成功构建了pcDNA3.1(+)-CTGF真核表达质粒,并能在人成骨样细胞SaOS-2中稳定表达,为深入研究CTGF基因对骨生成的调控机制奠定了基础。     

PPARγ基因真核表达载体的构建及其在乳腺癌MDA-MB-231细胞中的表达

目的:构建以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组表达质粒pEGFP-C1-PPARγ,观察小鼠PPARγ基因在MDA-MB-231细胞中的表达及定位.方法:采用克隆和亚克隆技术构建小鼠PPARγ基因真核表达栽体,脂质体Lip2000介导转染MDA-MB-231细胞,real-time PCR和western-blot验证其mRNA和蛋白的表达,荧光显微镜观察该基因亚细胞定位.结果:酶切和测序结果证实重组质粒含有PPARγ编码区序列且插入方向正确,转染后观察该基因亚细胞定位于胞核,胞质有弥散分布.结论:成功构建了小鼠PPARγ基因真核表达载体,该基因在MDA-MB-231细胞中成功表达,PPARγ基因主要集中表达于胞核.     

PPARγ基因真核表达载体的构建及其在乳腺癌MDA—MB-231细胞中的表达

目的：构建以绿色荧光蛋白（GFP）为报告基因的重组表达质粒pEGFP—C1—PPARγ,观察小鼠PPARγ基因在MDA-MB-231细胞中的表达及定位。方法：采用克隆和亚克隆技术构建小鼠PPARγ基因真核表达载体,脂质体Lip2000介导转染MDA—MB-231细胞,real—time PCR和western—blot验证其mRNA和蛋白的表达,荧光显微镜观察该基因亚细胞定位。结果：酶切和测序结果证实重组质粒含有PPAIh编码区序列且插入方向正确,转染后观察该基因亚细胞定位于胞核,胞质有弥散分布。结论：成功构建了小鼠PPARγ基因真核表达载体,该基因在MDA—MB-231细胞中成功表达,PPARγ基因主要集中表达于胞核。     

pcDNA3.1/CXCR7真核细胞表达载体的构建及其在内皮细胞中的表达鉴定

目的:CXCR7是基质衍生因子1(stroma derived factor-1,SDF-1)的新受体,且该受体在血管新生部位的内皮细胞中表达上调,故本研究拟构建CXCR7的真核表达载体pcDNA3.1/CXCR7,并检测其在人脐静脉内皮细胞中的表达.方法:采用RT-PCR法从人肝癌细胞HepG2的cDNA中扩增出约1100 bp的CXCR7基因片段.采用KpnI、XbaI将目的基因和载体pcDNA3.1进行双酶切,将酶切产物加入T4 DNA连接酶16℃连接过夜.将连接产物转化到感受态大肠杆菌中.挑取阳性克隆、提质粒,用双酶切、质粒DNA PCR扩增及DNA序列分析鉴定正确后,采用阳离子脂质体LipofectamineTM 2000将其转染人脐静脉内皮细胞(HUwc),通过western-blot检测目的基因在内皮细胞中的表达.结果:阳性克隆经双酶切法鉴定含有CXCR7基因片段,质粒DNAPCR扩增出与CXCR7同等大小的基因片段,基因测序结果与GenBank中序列相同.转染HUVEC后,细胞中CXCR7的表达水平显著上升.结论:成功构建了CXCR7的真核表达栽体,可在内皮细胞中正常表达并.为进一步研究其作用机制奠定了基础.     

真核表达质粒pcDNA3.1-CSRP2-HA的构建及鉴定

目的:构建并鉴定真核表达质粒PcDNA3.1-CSRP2-HA。方法:据GeneBank中人CSRP2 CDS序列设计并合成引物,提取A549细胞总RNA,并将其逆转录成cDNA作为模板,进行PCR扩增,获得CSRP2目的基因后,再与PcDNA3.1-HA载体进行连接重组,构建PcDNA3.1-CSRP2-HA真核表达质粒,经限制性内切酶消化、PCR及DNA序列测序分析等方法鉴定后,瞬时转染入A549细胞,Western blot法检验CRP2蛋白表达。结果:成功构建PcDNA3.1-CSRP2-HA真核表达质粒,Western-blot结果显示PcDNA3.1-CSRP2-HA能够在A549细胞中表达。结论:PcDNA3.1-CSRP2-HA真核表达质粒构建并鉴定成功,为后续研究CRP2在炎症诱发氧化损伤机制中的转录调控作用奠定了基础。     

小鼠EVL 基因的克隆和真核表达载体的构建

目的:构建小鼠EVL(Ena/VASP like)基因的真核表达载体,为深入研究EVL的功能奠定基础.方法:采用PCR方法,从小鼠cDNA文库中,扩增出1245bp的EVL编码区片段,经电泳、胶回收后连接入pMD- 18T载体中,测序鉴定正确.用BamHI和HincⅡ双酶切,定向克隆EVL编码区片段到真核表达载体pcDNA3.1中,用限制性内切酶酶切鉴定重组质粒正确后.将重组质粒转染入HELA细胞中,以RT-PCR检测EVL的mRNA的表达,以Western Blot检测EVL蛋白的表达.结果:酶切鉴定结果显示小鼠EVL编码区基因被成功克隆入真核表达载体pcDNA3.1中;RT-PCR和Western Blot结果以及免疫荧光染色显示Hela细胞中有EVL的mRNA和蛋白的表达.结论:成功获得pcDNA3.1 -EVL的真核表达载体,为进一步深入研究EVL蛋白的功能奠定了基础.     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因真核表达质粒的构建和表达

目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白真核表达质粒,并在HepG2细胞中稳定表达.方法:采用RT-RCR方法从丙型肝炎患者血清中得到HCVC区的cDNA序列,然后克隆入pcDNA3.0载体,构建真核表达质粒pcDNA-HCV,并进行酶切鉴定和测序鉴定;采用脂质体转染技术将pcDNA-HCV稳定转染于HepG2细胞系,并用G-418进行筛选;采用Western Blotting方法和免疫细胞化学方法检测HepG2细胞中HCV核心蛋白表达情况.结果:从HCV感染者血清中扩增得到的503bpHCV cDNA序列.属于HCV 1型基因C区,并成功构建了真核表达质粒pcDNA-HCV.经Western blotting和免疫细胞化学检测,稳定转染的HepG2细胞中有HCV核心蛋白的表达.结论:成功构建HCV核心蛋白真核表达质粒pcDNA-HCV,并可以在真核细胞HepG2中稳定表达.     

单纯疱疹病毒2型感染细胞多肽27真核表达质粒的构建及表达

为了构建单纯疱疹病毒2型(HSV-2)感染细胞多肽27(ICP27)真核表达质粒,应用PCR技术从HSV-2 333株的基因组中扩增ICP27基因,并连接至真核表达载体pEGFPC2,对阳性克隆进行菌落PCR、酶切和测序鉴定后,成功构建了重组质粒pEGFPC2-ICP27。用X fect转染试剂盒将重组质粒pEGFPC2-ICP27转染至Vero细胞中,并用RT-PCR及W estern b lot-ting检测其表达情况。结果显示,ICP27基因在Vero细胞中得到正确表达。真核表达质粒pEGFPC2-ICP27的构建成功,为进一步研究ICP27对宿主细胞的影响奠定了基础。     

小鼠白细胞介素33真核表达质粒的构建及表达

克隆小鼠IL-33基因构建其真核表达质粒,并转染COS-7细胞检测其表达。提取C57BL/6小鼠肺组织总RNA,经反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增小鼠IL-33基因,酶切后插入pcDNA^TM3.1/myc HisA构建其真核表达质粒pcDNA-3.1-IL-33,重组质粒转染COS-7细胞,RT-PCR和免疫印迹法（western blotting）检测目的基因表达。结果显示,pcDNA3.1-IL-33中插入的片段序列测定结果与小鼠IL-33cDNA序列一致,重组质粒转染COS-7细胞后检测到相应mRNA及蛋白表达。成功克隆了小鼠IL-33基因cDNA,并构建其真核表达质粒。     

新型真核表达质粒pcDNA6/myc-his-EGFP B 的构建及其在重组基因表达中的应用

增强型绿色荧光蛋白（EGFP, enhanced green fluorescent protein）、myc抗原和6×His已在众多真核表达载体中用作重组蛋白的表达标记,EGFP能发出的绿色荧光,myc抗原能用相应的抗体检测,6×His能被相应的树脂特异吸附。但目前为止,没有一个质粒表达载体能够同时整合三者的功能。本研究构建了一个能够同时整合EGFP、myc抗原和6×His功能的新型真核质粒表达载体,我们将其命名为pcDNA6/myc-his-EGFP B。值得注意的是,为确保目的基因与EGFP基因融合表达后,融合表达产物各组成部分能够保持原有的生物活性,我们运用LINKER程序在EGFP基因的5'端设计了一段编码八肽的连接DNA序列。将一段含有人白细胞介素2（IL-2, human interleukin 2）信号肽编码序列的基因亚克隆进pcDNA6/myc-his-EGFP B的多克隆位点中,使之与EGFP、myc抗原和6×His融合表达,构建成质粒pMHES。用pcDNA6/myc-his-EGFP B和pMHES转染2.2.15细胞,48 h后成功观察到绿色荧光;用pcDNA6/myc-his-EGFP B尾静脉注射Balb/c小鼠,8 h后在小鼠肝脏冰冻切片中同样观察到绿色荧光。用同源建模软件Modeller8V2模拟IL-2与EGFP、myc抗原和6×His融合表达产物的三维结构,结果表明：IL-2、EGFP、myc和6×His各部分互不干扰,连接八肽具有一定的柔性。以上结果表明pcDNA6/myc-his-EGFP B可望作为外源基因在哺乳动物细胞中表达研究和基因治疗的新型载体。     

一种新型抗菌肽Cecropin B真核表达载体的构建

通过重叠区扩增法人工设计和合成一种新型抗菌肽Cecropin B基因,按正确的阅读框架定向克隆至巴斯德毕赤酵母的高效表达载体pPIC9K上。经PCR鉴定及序列分析,所转化的大肠杆菌DH5ct菌落中含有插入Cecropin B基因的重组质粒pPIC9K—CB,表明成功构建了新型抗菌肽Cecropin B表达载体pPIC9K—CB。     

通用真核质粒表达载体的构建

利用真核基因表达调控的原理,以pSV2-dhfr为起始材料,构建了两个通用的真核质粒表达载体pMAML1-dhfr和pMAML2-dhfr,它们包含人巨细胞病毒立即早期启动子/增强子调控元件,由两个转录方向相同或相反的表达单元组成.以荧火虫荧光素酶基因为报道基因,β-半乳苷酶基因为内对照,借助COS-7短暂表达系统,研究了它们对荧光素酶表达的影响,并比较了它们与出发载体pSV2-dhfr的相对强弱.