甘薯非特异性脂质转移蛋白基因克隆与表达分析(英文稿)

非特异脂质转移蛋白（nsLTP）是植物界普遍存在的一类涉及多种胁迫反应的可溶性蛋白。为了阐明甘薯中非特异性脂质转移蛋白基因IbLTP1和IbLTP2在盐胁迫反应中的功能,本研究运用PCR技术,对IbLTP1和IbLTP2基因进行了克隆,并通过生物信息学方法分析了序列结构、蛋白质保守结构域和系统进化关系;利用qRT-PCR方法检测了这两个基因在不同组织中的表达模式以及盐胁迫条件下的表达差异;将IbLTP1和IbLTP2基因克隆到大肠杆菌的原核表达载体pET32a中,对重组菌BL21（pET32a-LTP）的耐盐性进行分析。序列分析表明：IbLTP1和IbLTP2编码区均不含内含子并都具有等位基因。IbLTP1和IbLTP2基因的蛋白质序列分别包括114和94个氨基酸残基并且不含色氨酸残基,蛋白序列N端含有信号肽序列。保守结构域和系统进化分析结果表明：IbLTP1和IbLTP2均含有nsLTP蛋白的保守结构域,IbLTP1属于Type Ⅰ而IbLTP2属于Type Ⅱ。实时荧光定量PCR分析表明：IbLTP1在幼叶中表达量最高,根中表达量最低;而IbLTP2在茎中表达量最高,成熟叶中表达量最低。在NaCl胁迫条件下,IbLTP1和IbLTP2表达量在根中基本无变化而在茎和叶中上调。大肠杆菌BL21（DE3）中异源表达IbLTP1和IbLTP2基因能够提高转基因菌株对NaCl的耐受性。因此,本研究推测IbLTP1和IbLTP2基因可能在甘薯盐胁迫反应中发挥了作用。     

小桐子非特异性脂质转移蛋白A的基因克隆及其表达和功能分析

基于我们最近获得的小桐子低温驯化转录组和数字基因表达谱数据,本工作研究了低温驯化条件下差异表达变化较大的非特异性脂质转移蛋白A基因JcnsLTPA。克隆到该基因的cDNA序列全长833 bp,开放阅读框长度513 bp,编码170个氨基酸,存在ATT_LTSS典型保守功能基序。其启动子区域中鉴定到了TATA框、CAAT框、CATA框、W框等顺式作用元件以及CRT/DRE低温响应元件。半定量RT-PCR分析表明,该基因在茎、根、叶中都有表达,以茎中表达量最高、且受低温诱导最显著。同时,酵母表达JcnsLTPA也提高了重组酵母菌的抗低温能力。这些结果充分说明了小桐子JcnsLTPA是与抗冷性密切相关的基因,可以用于小桐子的抗冷性遗传改良。     

丹参非特异性脂质转移蛋白基因（SmLTP1）的克隆及其表达分析

对丹参EST序列进行Blast分析,获得一个新的非特异性脂质转移蛋白基因,命名为SmLTP1（GenBank注册号为EF187461）。该基因cDNA全长593bp,包含一个长为357bp的开放读码框,编码118个氨基酸。生物信息学结构分析表明,该蛋白具有植物nsLTP的典型结构,即4对二硫键,4个a-螺旋,1个可结合和容纳脂肪酸分子的类似口袋状的疏水结构。实时荧光定量PCR分析结果表明,SmLTP1基因在丹参不同组织器官中差异表达,其表达受病原菌和茉莉酸甲酯的诱导,显示SmLTP1基因在植物防御反应中发挥作用。     

水稻非特异性脂质转移蛋白的原核表达、纯化及抑菌功能

将编码水稻非特异性脂质转移蛋白 (nonspecificlipidtransferprotein ,nsLTP)基因 (LTP110 )的克隆到硫氧还蛋白融合表达载体PET32a( )中 ,在BL2 1(DE3)trxB-宿主菌中实现了融合蛋白的高表达。通过Ni2 chelatingSepharosefastflow柱纯化融合蛋白后 ,通过肠激酶酶切再过该亲和柱得到了重组LTP110。CD谱扫描表明重组蛋白质与体内提取的nsLTP二级结构相似 ;荧光脂质结合实验表明该蛋白质具有结合脂肪酸分子的活性。对该蛋白质的抑菌功能进行研究后表明 ,LTP110具有抑制稻瘟病菌孢子萌发的功能 ,在较低浓度即能发挥活性     

西伯利亚蓼非特异性脂质转移蛋白基因PsnsLTP的功能分析

通过在农杆菌介导下,利用西伯利亚蓼非特异性脂质转移蛋白基因(植物表达载体：pROKII-PsnsLTP)对烟草进行遗传转化,经卡那霉素抗性分化筛选及PCR鉴定,获得6个转基因烟草株系。接种烟草炭疽病病菌和猝倒病病菌后观察转基因植株和野生型的表型差异,在NaCl、CdCl₂、7.5% PEG6000的胁迫下进行表型观察和生理指标的测定。结果显示：与野生型烟草相比,T1代转基因植株已具有较强的耐烟草炭疽病和猝倒病的能力;其超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）活性显著增强,丙二醛（MAD）含量显著降低,且幼苗具有较好的生长性状。由此证明,西伯利亚蓼非特异性脂质转移蛋白PsnsLTP增加了转基因烟草抵御生物胁迫和非生物胁迫的能力,这些工作为深入研究PsnsLTP基因的抗逆机制提供了参考。     

西伯利亚蓼非特异性脂质转移蛋白编码序列的克隆及其盐胁迫下的表达

根据西伯利亚蓼地下茎抑制消减文库(SSH)中获得的非特异性脂质转移蛋白(non-specific lipid transfer protein, nsLTP)EST序列,应用RACE技术克隆了具有Poly A的全长cDNA序列.该序列全长604 bp,其5′非翻译区65 bp,3′非翻译区227 bp,开放阅读框编码103个氨基酸残基;序列分析表明,该基因具有N端信号肽,具有nsLTP家族共有的典型保守区域,属nsLTP家族基因,命名为PsnsLTPs;荧光定量PCR分析表明,PsnsLTPs在西伯利亚蓼叶、茎、地下茎中均有表达.在3%NaHCO3诱导表达下,该基因在地下茎中表达明显受盐胁迫的诱导,推测该基因在抵御盐胁迫时具有重要作用.     

非特异性脂质转移蛋白突变体的构建及在两种硫氧还蛋白表达载体中的表达比较

对水稻非特异性脂质转移蛋白(Nospecific lipid transfer protein,nsLTP) LTP110中结构重要的5个氨基酸位点进行了定点突变,测序结果证实了突变体构建成功。在尝试了多种大肠杆菌表达系统进行表达之后,发现硫氧还蛋白融合表达载体适合于LTP110野生型及突变体的表达。将编码野生型LTP110及突变体Y17A,P72L,R46A,D45A,C50A蛋白的cDNA顺序克隆进两种硫氧还蛋白表达载体并对其表达情况进行了比较：pTrxFus载体可以在宿主菌GI724中以较低水平表达野生型LTP110及突变体Y17A,P72L,R46A融合蛋白,但不能表达D45A和C50A融合蛋白;pET32a(+)载体可以在宿主菌BL21 (DE3) trxB-中以可溶蛋白的形式表达野生型及所有突变型融合蛋白,且表达量比在pTrxFus载体/GI724突主菌中表达量高。对pET32a(+)载体中表达的LTP110融合蛋白进行了纯化,并利用带有荧光标记的脂肪酸分子对其测活,结果表明表达的野生型LTP110分子具有结合脂质的活性。     

芹菜NHL-like蛋白基因克隆与表达分析

植物生长发育过程中会遭遇各种病原物的攻击,植物为了应对这些危害并适应外界的生存竞争,逐渐演化出了复杂的防御机制。NHL基因家族庞大,部分NHL基因受病原物诱导后会过量表达,增强植物对多种病原菌的抗性,是与植物防御机制密切相关的蛋白。本研究以津南实芹和美国西芹2个芹菜品种为试验材料,分别克隆出NHL-like蛋白基因AgNHL。序列分析表明,上述2种芹菜的AgNHL基因序列均含636 bp的开放阅读框,编码211个氨基酸。2种芹菜碱基序列,只有第36位不同,津南实芹为T,美国西芹为C,2种碱基序列相似性高达99.84%,编码的氨基酸序列相同。进化分析显示,2种芹菜的NHL-like蛋白与葡萄、大豆等植物的相似度较高,在第80~185氨基酸间含一个LEA-2蛋白保守结构域。荧光定量PCR结果表明,AgNHL基因主要在芹菜茎中表达,根中表达量最低,有明显组织特异性,品种差异也很显著。对2种芹菜分别进行4℃低温、38℃高温、20%PEG处理、0.2 mol/L NaCl处理2 h表达分析显示,低温、盐处理下该基因表达量明显上升。     

锦鲤Hepcidin基因的克隆及其组织特异性表达分析（英文）

【目的】克隆锦鲤Hepcidin全长c DNA序列(k-hepc),并获得此基因在鱼体内的表达模式。【方法】利用RT-PCR和RACE PCR的方法,从锦鲤肝脏中克隆锦鲤Hepcidin的全长c DNA,进行序列测定和分析;锦鲤经肌肉注射维氏气单胞菌0、4、8、12、24和48 h后,分别取其肝、脾、肾、肠、脑、心、肌肉和鳃组织,采用实时荧光定量PCR的方法,以β-actin为内参基因,检测k-hepc基因的表达量。【结果】锦鲤抗菌肽(Gen Bank登录号KC795559)全长755 bp,编码序列276 bp,编码91个氨基酸,包括信号肽、原肽和成熟肽,成熟肽C端含有8个半胱氨酸,可形成4个分子内二硫键。与已报道的普通鲤鱼Hepcidin氨基酸序列的一致性为93%,与其他鱼类Hepcidin氨基酸序列的一致性为29%-93%。在本研究所检测的正常锦鲤的组织中,k-hepc均有表达,其中在肝组织中表达量最高,鳃组织中表达量最低。经维氏气单胞菌感染后,k-hepc在肝和心组织中的表达量明显增加,在其余组织中变化不显著。【结论】k-hepc编码的蛋白是Hepcidin家族的成员之一。锦鲤Hepcidin的表达主要受内在调节因素影响。     

沙鞭PvDREB基因克隆与表达特异性分析

基于沙鞭的三代转录组数据,该研究利用PCR技术克隆DREB基因,并对其进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR分析该基因的表达模式以及在20%PEG-6000模拟干旱胁迫处理下的表达特征,以探讨干旱胁迫下沙鞭DREB转录因子的功能和作用,为揭示PvDREB基因响应沙鞭的耐旱分子机制奠定基础。结果表明：(1)成功克隆获得一个沙鞭DREB基因,命名为PvDREB;PvDREB基因编码区长度831 bp、编码276个氨基酸,含有典型的AP2转录因子保守结构域;PvDREB蛋白是亲水性蛋白,不具有信号肽结构,存在跨膜结构和可能的糖基化及磷酸化位点。(2)系统进化分析显示,PvDREB基因与毛竹的DREB亲缘关系较近。(3)亚细胞定位预测表明,PvDREB蛋白定位于线粒体和细胞核中。(4)qRT-PCR显示,沙鞭根、茎和叶中PvDREB均可诱导表达但差异较大,且在茎中表达量最高,叶中次之,根中最低,具有明显的组织特异性;20%PEG-6000模拟干旱下,PvDREB基因在叶中的表达量随干旱胁迫时间增加而增加,12 h时达到最高,之后逐渐下降。研究推测,沙鞭PvDREB基因受干旱胁迫诱导表达,且...     

植物脂质转移蛋白

脂质转移蛋白(lipid transfer proteins,LTPs)是植物生命活动中一类重要的活性蛋白质,在体外能够可逆地结合和转运多种脂质分子.目前已从多种植物中分离到LTPs基因.随着研究的深入,其不同水平的转录本在不同植物的不同发育阶段和生理条件下的不同组织中被发现,但LTPs体内确切的生理、生化功能和作用机制尚不明确.现介绍目前这一领域细胞与分子生物学方面的研究进展,并结合本课题组的研究结果进行了相关探讨,为进一步研究LTPs在植物生殖发育、抗性和防御反应及信号转导中的作用机制提供了新的线索.     

绿豆非特异性脂转移蛋白结构与功能的关系分析

利用硫酸铵沉降、弱阳离子色谱、强阳离子交换色谱、高效液相离子交换色谱和凝胶色谱等方法从绿豆中分离纯化非特异性脂转移蛋白nsLTP,并培养出绿豆nsLTP的晶体。对绿豆非特异性脂转移蛋白结构与功能关系作了分析报道。     

溶藻弧菌HY9901 AcrA基因克隆与序列分析（英文）

Touchdown PCR扩增溶藻弧菌HY9901 AcrA基因部分序列, 得一460 bp片段, 再以反向PCR和巢式PCR联合扩增其侧翼序列, 拼接得一由1101 nt组成, 共编码366 aa的完整基因。该基因演绎的氨基酸序列与几种弧菌的同源性都比较高, 与创伤弧菌YJ016、副溶血弧菌RIMD 2210633、灿烂弧菌12B01、霍乱弧菌O1 N16961同源性分别为76%、73%、71%和70%。     

钙调素对钙调素结合蛋白-10和玉米非特异性脂转移蛋白与脂质结合活性的影响

荧光标记的脂质结合实验表明,钙调素结合蛋白-10（CaMBP-10）具有典型的植物非特异性脂质转移蛋白与脂质结合的特性。进一步实验研究了钙调素（calmodulin,CaM）对CaMBP-10和玉米nsLTP与脂质结合的活性的影响,结果显示无论在有钙和无钙条件下,CaM对两者的影响均有不同之处,W-7和TFP能消除CaM的影响。提示CaM不仅与CaMBP-10和玉米nsLTP特异性相互作用,而且对2种脂转移蛋白可能具有不同的调节机制。     

骆驼蓬脂转移蛋白基因克隆、表达及体外抗癌活性分析

[目的]构建骆驼蓬脂转移蛋白(Ph LTP)原核表达载体,并研究表达产物的体外抗癌活性。[方法]采用RT-PCR法从骆驼蓬(Peganum harmala)叶中扩增Ph LTP基因,将其成熟肽片段克隆至p ET-30a载体上,构建表达载体p ET-30a-Ph LTP,将重组质粒转化E.coli BL21进行原核表达,通过镍柱纯化获得重组骆驼蓬脂转移蛋白(r Ph LTP),经SDS-PAGE和Western blot分析鉴定,用MTT法检测其体外抗癌活性。[结果]成功构建骆驼蓬脂转移蛋白c DNA表达载体p ET-30a-Ph LTP,其在E.coli中以可溶性融合蛋白形式表达,分子量约为18 k Da。经镍柱纯化后重组蛋白r Ph LTP能够显著抑制宫颈癌He La、黑色素瘤B16和食管癌Eca-109细胞的生长,IC50值分别为16.76±1.23、38.92±2.16和9.01±1.01μg/m L。[结论]克隆了骆驼蓬脂转移蛋白基因并在原核表达系统中成功表达,r Ph LTP所显示的显著抗癌活性预示其具有临床应用的潜能。     

核糖体失活蛋白及其在黄瓜中的表达分析（英文）

核糖体失活蛋白是一类具有高度特异性r RNA N-糖苷酶活性的蛋白,它们能够使原核或真核细胞的核糖体失活因而具有细胞毒性.由于其独特的生物学性质,核糖体失活蛋白被认为在农业和医学中都有着巨大的应用潜力.我们之前的研究表明,黄瓜的基因组中共包含2个2类核糖体失活蛋白基因,分别命名为Cumsa AB1和Cumsa AB2.以蓖麻毒蛋白Ricin为代表,2类核糖体失活蛋白通常由2条二硫键连接的肽链组成:具有N-糖苷酶活性的A链与具有凝集素活性的B链.本文研究了黄瓜中核糖体失活蛋白的表达情况.亚细胞定位研究表明Cumsa AB1经过蛋白分泌通路表达于细胞外,这与蛋白质序列分析显示的Cumsa AB1包含一个信号肽而不含转膜区域相一致.对黄瓜的不同生长阶段的不同组织中的转录水平分析表明,Cumsa AB1在大部分组织中以极低的水平表达,而Cumsa AB2表达水平则明显更高,尤其在第一片真叶阶段和刚开花的植物中.最后,我们使用分子模拟对黄瓜中核糖体失活蛋白的结构及糖结合位点进行了分析.本研究对黄瓜中核糖体失活蛋白的亚细胞定位、表达水平和可能的蛋白质结构进行了研究,为其进一步的生物学功能研究提供了重要信息.     

玉米非特异性脂转移蛋白的cDNA克隆和表达及表达产物的钙调素结合活性分析

用RT-PCR法克隆了成熟的玉米非特异性脂转移蛋白的cDNA,将它连接到表达质粒上并转化至大肠杆菌中表达。以钙调素凝胶覆盖法和钙调素亲和层析下拉实验对表达产物进行分析,证明它具有结合钙调素的活性,并且这种结合不依赖于Ca^2＋,与前期研究中钙调素结合蛋白-10和拟南芥非特异性脂转移蛋白1的结合特性相同。采用基因删除和缺失突变的方法研究玉米非特异性脂转移蛋白与钙调素结合的结构域,结果表明钙调素结合于47-60位氨基酸,预测的蛋白质二级结构为碱性双亲α-螺旋结构。     

黄粉虫热休克蛋白70基因的克隆、序列分析与表达（英文）

为给黄粉虫Tenebrio molitor抗逆机理研究提供理论依据, 本研究采用PCR和RACE法从黄粉虫幼虫中克隆出一个热休克蛋白70基因Tmhsp70, 并运用半定量RT-PCR法检测其在黄粉虫不同发育阶段的mRNA表达水平。结果表明： 克隆出的Tmhsp70 序列全长2 282 bp, 具有一个富含A的115 bp 5′ 非翻译区和一个1 935 bp的开放阅读框及一个富含A、 T的232 bp 3′-非翻译区。5′-非翻译区含有7个热休克元件nGAAn, 3′-非翻译区末端有长22 bp的Poly(A)尾。Tmhsp70编码的黄粉虫热休克蛋白（TmHSP70）具有3个典型的HSP70特征基序（IDLGTTYS, IFDLGGGTFDVSIL和IVLVGGSTRIPKIQQ）和1个胞质HSP70末端特征基序（EEVD）, 无信号肽和跨膜区域, 包含2个主要的结构域, 即： N-端42 kDa的高度保守ATPase功能域和C-端18 kDa的保守多肽结合功能域。ATPase功能域的三级结构由2个大球形亚功能域组成, 具有1个核苷酸结合中心; 多肽结合功能域形成1个双层4股β-折叠片样的三明治结构和2个α-螺旋, 内含1个多肽结合通道。此外, 黄粉虫Tmhsp70 mRNA的表达具有热激诱导和发育调控的特征。半定量RT-PCR分析表明, 42℃热激1 h的黄粉虫各发育阶段Tmhsp70 mRNA的表达量上升了1.4~26.9倍。25℃下1日龄黄粉虫蛹中的Tmhsp70 mRNA 表达量要高于其余各发育阶段的累积表达量; 42℃热激1 h 后90日龄幼虫中的Tmhsp70 mRNA 表达量最丰富, 既高于30日龄和60日龄幼虫中的累积表达量, 也高于15日龄和30日龄成虫中的累积表达量。这些结果为进一步研究黄粉虫热休克蛋白的结构、 功能和表达调控及其与抗逆性的关系奠定了基础。     

薰衣草非特异性脂质转移蛋白基因nsLTP2-1和nsLTP2-2的克隆与功能分析

非特异性脂质转移蛋白（nsLTP,non-specific lipid transfer proteins）在植物脂质转运和分泌中发挥重要作用。本研究从薰衣草（Lavandula angustifolia）中克隆到2个II型nsLTP基因,命名为nsLTP2-1和nsLTP2-2,并对其进行功能分析。生信分析表明,nsLTP2-1和ns LTP2-2分别编码119个和117个氨基酸,具有脂转移蛋白（LTP,lipid transfer proteins）保守结构域和8个高度保守的半胱氨酸残基;系统进化分析显示它们处于两个分支,与同科的紫苏（Perilla frutescens）相似性最高。基因表达分析显示2个基因均在花蕾中高表达,在叶片、茎和花瓣中几乎不表达,在花萼中的表达存在差异,nsLTP2-1和nsLTP2-2分别在成熟花萼和幼嫩花萼中表达量更高;2个基因在花蕾和叶片中的表达均受到强光诱导,且在花蕾中的表达均受脱落酸诱导,而叶片中nsLTP2-1和nsLTP2-2的表达分别受茉莉酸甲酯和乙烯诱导。亚细胞定位显示2个nsLTPs均定位在细胞膜和细胞壁上,可能与次生代谢物的转运有关。...     

水稻脂质转移蛋白基因的分离和分析

用水稻脂质转移蛋白（ｌｉｐｉｄｔｒａｎｓｆｅｒｐｒｏｔｅｉｎ,ＬＴＰ）的ｃＤＮＡ（ｐＦＤＲＳＣ１１０）为探针,从水稻（ＯｒｙｚａｓａｔｉｖａＬ．ｓｐ．ｉｎｄｉｃａ）“广陆矮４号”基因文库中筛选出ＬＴＰ基因,完成了１．８ｋｂ长片段的序列测定。该基因编码一个１２１个氨基酸组成的肽,编码区中间有一个９０ｂｐ的内含子,基因的调控区除有２个ＴＡＴＡｂｏｘ和ｐｏｌｙＡ加工信号外,还存在多个回文序列和逆向重复序列。该基因编码的蛋白质Ｎ端是由２８个氨基酸组成的信号肽,同源性比较表明它具有典型的植物ＬＴＰ特征。