PUMA-BH3结构域短肽的原核表达、纯化及促凋亡活性鉴定

Bcl-2家族蛋白质在线粒体途径凋亡的调控机制中起着重要的作用,p53正向细胞凋亡调控因子（p53 up-regulated modulator of apoptosis protein,PUMA)是该家族的一种只含有BH3同源区域的促凋亡蛋白。为得到PUMA的BH3结构域短肽并检测其生物学活性,将人工合成的编码PUMA-BH3肽的DNA片段克隆到质粒pTYB2上,构建出表达PUMA-BH3-内含肽-几丁质结合域融合蛋白的原核表达载体pTYB2-PUMA-BH3,转化大肠杆菌BL-21(DE3)中IPTG诱导表达。表达的融合蛋白经几丁质亲和层析、二硫苏糖醇（DTT）的柱内还原,直接获得可溶性PUMA-BH3肽。通过研究重组PUMA-BH3肽在体外条件下对线粒体活力、线粒体肿胀度以及细胞色素c释放的影响来鉴定其生物学活性。结果表明,获得的可溶性PUMA-BH3肽能作用于离体线粒体,引起线粒体活力降低,线粒体肿胀并能诱导细胞色素c释放。环孢菌素A对此有一定的抑制作用,提示PUMA-BH3肽对线粒体的上述作用是通过促进通透性转运孔( PTP)开放实现的。经原核表达及纯化,获得了具有促凋亡活性的PUMA-BH3肽,为进一步研制控制凋亡过程的药物奠定了基础。     

Oct-4/Sox-2 协同调控下游基因表达的分子机制

Oct-4属POU家族蛋白,是一类在动物早期胚胎发育过程中起重要作用的转录因子,参与维持细胞的全能性及未分化状态。Oct-4蛋白的主要结构特征为具有POU家族特有的保守结构域（POUS）和POU同源异型结构域（POUHD）,这两个结构域可与DNA上特定区域形成双向结合,进而对基因转录进行调控。Sox-2是另一种转录因子,其HMG结构域可结合在DNA的特定序列上,并可通过与Oct-4的POUs结构域之间的蛋白质．蛋白质相互作用形成POU／HMG／DNA三元复合体以调控下游靶基因的表达。文章就POU家族成员Oct-4和HMG-box家族成员Sox-2在动物早期胚胎发育中调控部分下游基因表达的分子机制进行了概述。     

E1A激活基因阻遏子过表达抑制体外人血管平滑肌细胞凋亡

为探讨E1A激活基因阻遏子（cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG）对人血管平滑肌细胞（vascular smooth muscl ecells,VSMCs）凋亡的影响及调控机制,应用正、反义重组逆转录病毒表达载体pLNCX,（＋）／CREG及pLXSN（-）／CREG制备稳定感染人胸廓内动脉平滑肌细胞克隆株（human internal thoracic artery-Shenyang,HITASY）细胞模型,观察CREG蛋白过表达及表达抑制对平滑肌细胞凋亡的影响。荧光显微镜下观察DAPI染色后凋亡细胞核形态,AnnexinV／PI流式细胞术检测细胞凋亡率,RT-PCR技术分析凋亡相关基因caspase-9mRNA的表达,蛋白质印迹法分析p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPK）、磷酸化p38MAPK（phosphorylated p38 mitogen-activated proteinkinase,P-p38 MAPK）的表达变化。研究结果显示,CREG蛋白过表达明显抑制血清饥饿诱导的HITASY细胞凋亡的发生;同时细胞中p38MAPK、P-p38MAPK的表达增加。相反,抑制CREG蛋白表达则引起正常血清培养状态下VSMCs的自发凋亡明显增加,同时细胞内p38MAPK、P-p38MAPK表达显著下降。进一步研究发现,预先应用特异性抑制剂SB203580阻断p38MAPK信号转导通路后,CREG蛋白过表达引起的细胞凋亡抑制作用被明显减弱,血清饥饿后CREG蛋白过表达引起的HITASY细胞凋亡现象明显增加。上述结果提示,CREG蛋白过表达可以抑制体外培养的VSMCs凋亡,p38MAPK信号转导通路可能介导CREG蛋白对VSMCs凋亡的抑制作用。     

ASPP2过表达可增强DRAM介导的自噬对HepG2细胞的促调亡作用

p53凋亡刺激蛋白2（apoptosis stimulating protein 2 of p53, ASPP2）能特异性地与p53蛋白结合并增强其促凋亡功能,进而发挥抗肿瘤作用.最近文献提示,自噬对肿瘤发生、发展及肿瘤细胞对抗肿瘤药物的反应都具有重要作用.在本研究中,甲基磺酸(MMS)处理HepG2细胞24 h后,用calcein AM/PI和M30染色检测细胞凋亡,可引起早期（M30免疫组化阳性）和晚期细胞凋亡（PI染色阳性）. 给HepG2细胞转染GFP-LC3质粒后,发现MMS处理24 h可引起自噬的发生. ASPP2腺病毒（rAd-ASPP2）感染HepG2细胞引起ASPP2过表达后,再用MMS处理24 h,能引起更明显的早期、晚期细胞凋亡和自噬. 荧光定量PCR检测发现,rAd-ASPP2诱导了更高的BCL-2相关X蛋白基因（BAX）和p53蛋白的目的基因p53诱导的自噬调节蛋白（p53-induced modulator of autophagy,DRAM）的表达. 但仅用rAd-ASPP2处理HepG2细胞不能引起自噬和凋亡.利用2条DRAM特异性的siRNA下调DRAM的表达,发现rAd-ASPP2引起的自噬被完全抑制, 早期和晚期凋亡均部分被抑制,同时BAX 的mRNA水平也明显下降. 以上结果说明,ASPP2可通过上调BAX和DRAM基因的转录而促进MMS引起的HepG2细胞凋亡; 另外,DRAM介导的自噬是ASPP2促进MMS引起的肿瘤细胞凋亡的机制之一. 该研究可为肝癌的基因治疗提供新的思路.     

p62蛋白功能及相关信号通路研究

p62是一种多功能蛋白,其蛋白分子包含多个结构域,通过与不同蛋白质结合形成细胞中重要的信号中心,从而调控多种信号通路,影响细胞的生长、衰老,甚至死亡等生理过程。p62蛋白通过对mTORC1信号通路的影响在氨基酸信号通路中发挥着关键的调控作用。p62蛋白是自噬体与底物之间的适配蛋白,在细胞自噬过程中起到分子调节器的作用。p62蛋白具有质核穿梭功能,在DNA损伤修复和氧化应激反应中具有重要作用,其异常积累会引起细胞的恶性转变,导致肿瘤的发生。现综述p62在调节多种信号通路,如自噬、氨基酸感知、凋亡及肿瘤发生等过程中的作用。     

肿瘤细胞中存活蛋白与p53的相互作用

存活蛋白(survivin)作为凋亡抑制蛋白(IAP)家族的最小成员,在肿瘤组织中高表达,且具有严格的细胞周期依赖性,而p53作为细胞周期中的负调节因子,参与了细胞周期调控和细胞凋亡等重要的生物学功能。最近研究表明,存活蛋白与p53的相互作用在肿瘤的发生发展中具有重要作用。该文将从细胞周期与细胞凋亡的角度对存活蛋白/p53通路在肿瘤中的研究进展进行阐明。     

Bcl-2家族中唯BH3域蛋白的研究进展

Bcl-2家族蛋白质在细胞凋亡的调控机制中起着重要的作用,该家族包括唯BH3结构域的蛋白质（only BH3 domain protein）,如Bid、Bik、Puma、Nova、Bmf等。随着凋亡研究的深入,在哺乳动物中现已发现10多种唯BH3结构域的蛋白质,并且在凋亡中发挥重要的作用。本文主要论述唯BH3域蛋白的作用机制及其应用的研究进展。     

miRNA-145-5p调控FMNL2基因对口腔鳞癌干细胞增殖、迁移的影响

摘要 目的：分析miRNA-145-5p调控形成素2（formin-like 2,FMNL2）基因对口腔鳞癌干细胞增殖、迁移的影响。方法：按照脂质体2000说明书对细胞进行转染miRNA-145-5p inhibitor及miRNA-145-5p mimics,按照实验设计,将其分为空白组、沉默组（miRNA-145-5p inhibitor）及过表达组（miRNA-145-5p mimics）。荧光定量PCR法检测miRNA-145-5p、FMNL2表达量,MTT检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞凋亡能力,细胞划痕实验检测细胞迁移能力,采用Western blot法检测各组细胞中Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达量。结果：过表达组miRNA-145-5p、Bax蛋白表达量,凋亡率,细胞G0/G1比例高于沉默组,具有统计学差异（P＜0.05）;过表达组口腔鳞癌干细胞增殖率,FMNL2表达量、MMP-13、β-catenin、Bcl-2、APC蛋白表达量低于沉默组,具有统计学差异（P＜0.05）;过表达组口腔鳞癌干细胞迁移能力弱于沉默组,具有统计学差异（P＜0.05）。结论：miRNA-145-5p通过靶向调控FMNL2,作用于Wnt/β-catenin信号通路调控口腔鳞癌干细胞,进而抑制细胞增殖、迁移。     

人巨细胞病毒即刻早期蛋白IE2在Tet-On系统调控下的表达及其抗凋亡作用

即刻早期蛋白IE2是人巨细胞病毒(HCMV)感染后最先表达的蛋白质,具有调节细胞周期和抑制细胞凋亡的作用。但IE2蛋白的表达水平与其抗凋亡活性之间的关系尚不清楚。本实验通过建立Tet-On系统调控下表达HCMVIE2蛋白的细胞株,在不同诱导条件下检测IE2蛋白对细胞凋亡和p53表达的影响。结果发现IE2蛋白能抑制TNF-α诱导的细胞凋亡,其抑制效应与IE2蛋白的表达量相关,而原位杂交结果显示IE2蛋白不影响p53的表达,提示IE2蛋白可能通过多种途径抑制细胞凋亡。     

Bcl—2家族蛋白与细胞凋亡

Bcl 2家族蛋白是在细胞凋亡过程中起关键性作用的一类蛋白质。在线粒体上 ,Bcl 2家族蛋白通过与其他凋亡蛋白的协同作用 ,调控线粒体结构与功能的稳定性 ,发挥着细胞凋亡“主开关”的作用。Bcl 2家族包括两类蛋白质 :一类是抗凋亡蛋白 ,另一类是促凋亡蛋白。在细胞凋亡时 ,Bcl 2家族中的促凋亡蛋白成员发生蛋白质的加工修饰 ,易位到线粒体的外膜上 ,引起细胞色素c、凋亡诱导因子等其他促凋亡因子的释放 ,导致细胞凋亡 ;而平时被隔离在线粒体等细胞器内的该家族的抗凋亡蛋白成员则抑制细胞色素c和凋亡诱导因子等促凋亡因子的释放 ,具有抑制细胞凋亡的功能。但一旦这类抗凋亡蛋白成员与激活的促凋亡蛋白发生相互作用后 ,便丧失了对细胞凋亡的抑制作用 ,造成线粒体等细胞器的功能丧失和细胞器内促凋亡因子的释放 ,导致细胞凋亡。现以Bcl 2家族调控细胞凋亡的最新研究进展为基础 ,对Bcl 2家族成员及其蛋白质结构、分布和调控细胞凋亡的分子机制进行综述。     

HAX-1研究进展

HAX-1为凋亡调节蛋白,其结构与Bcl-2家族相近,含有BH1、BH2结构域。HAX-1在成年人心肌细胞中通过抑制caspase9的活化从而起到抗凋亡作用,同时也是促凋亡蛋白Omi/HtrA2的底物,在凋亡过程中被其降解。另外,HAX-1能够与蛋白的3＇非翻译区结合,可能参与了对mRNA的调节。HAX-1在机体细胞内广泛表达,与多种蛋白存在相互作用,具有多种生物学功能。简要综述了近年来有关HAX-1蛋白的抗细胞凋亡、参与细胞迁移,以及在病毒感染、疾病中的作用。     

EZH2在衰老细胞中表达下调引起Netrin-1表达增加进而促进交感神经轴突生长

交感神经在一些疾病动物模型和老年小鼠模型组织中呈现发芽生长和密度增加的趋势。这提示,交感神经与衰老密切相关。本研究采用免疫组织化学检测老年小鼠肝、肺、脾组织和人结肠腺瘤组织衰老模型中交感神经标记蛋白酪氨酸羟化酶（TH）的表达情况。结果证实,衰老组织中的交感神经密度显著增加。然而,目前对衰老组织的这种生物学改变机制尚不明确。本研究以人成纤维细胞系2BS为实验材料,经转录组测序发现,分泌性轴突导向因子导蛋白-1在衰老细胞中上调表达。ELISA和实时定量PCR结果显示,在博来霉素、离子射线、癌蛋白RasV12过表达所诱导的早衰及复制性衰老的2BS细胞中,导蛋白-1的蛋白质和mRNA表达量均比年轻对照组高。DNA损伤反应（DNA damage response,DDR）是调控衰老细胞分泌蛋白质表达的重要途径。为明确导蛋白-1在衰老细胞的上调表达是否与DDR相关,使用小分子化合物抑制DDR的重要效应分子ATM（ataxia telangiectasia mutated）和CHK2（checkpoint kinase 2）在博来霉素诱导的衰老2BS细胞中的活性。ELISA和实时定量PCR结果显示,与博来霉素诱导衰老组相比,阻断衰老细胞中的DDR活性未引起导蛋白-1表达水平的改变。提示导蛋白-1在衰老细胞中的表达不依赖于DDR途径。Western印迹检测发现组蛋白甲基转移酶EZH2在衰老细胞中的蛋白质表达明显少于年轻细胞;实时定量PCR结果表明使用小分子化合物抑制EZH2在年轻细胞中的活性引起导蛋白-1表达增加;CHIP实验检测发现,EZH2对年轻细胞的导蛋白-1启动子区DNA片段富集显著而在衰老细胞未见富集。以上结果提示EZH2在衰老细胞中的下调表达是导蛋白-1表达增加的重要原因。大鼠DRG与衰老细胞共培养结果证实,衰老细胞对交感神经具有导向作用,并且该现象依赖于导蛋白-1的分泌。根据以上结果得出结论,导蛋白-1在衰老细胞中的上调表达不依赖于DDR途径而与EZH2的下调表达相关,衰老细胞通过分泌导蛋白-1促进交感神经轴突定向生长。本研究为深入探讨衰老相关疾病的发生机制以及防治提供了新线索,具有一定的科学意义和潜在的转化应用价值。     

细胞凋亡与肿瘤

一、细胞凋亡的机制 （一）凋亡过程中关键的生化事件 （二）Bcl-2家族蛋白 （三）凋亡抑制蛋白家族（IAPs） （四）p53 （五）相关证据 （六）基因敲除和转基因鼠体内实验结果 二、抗癌药物能诱导细胞凋亡,也能直接杀伤细胞 （一）直接毒性作用与诱导细胞凋亡的应激反应 （二）治疗指数与正常细胞的凋亡     

含溴结构域蛋白2结构与功能的研究进展

含溴结构域蛋白2(bromodomain-containing protein 2,BRD2)具有两个串联的溴结构域和一个末端外结构域,是溴结构域和末端外结构域蛋白家族成员之一.BRD2蛋白能够特异性结合组蛋白乙酰化赖氨酸,参与基因的转录调控、染色质重塑和细胞增殖与凋亡等生物学活动.近年来研究表明,BRD2蛋白通过溴结...     

NOX家族蛋白的研究进展

NADPH氧化酶催化亚基gp91phox（NOX2）及其同源物NOX1、NOX3、NOX4、NOX5、DUOX1和DUOX2统称为NOX家族,它们作为NADPH酶的核心亚基,是该酶发挥作用的关键。NOX家族几乎存在于所有的细胞,吞噬细胞中NADPH氧化酶生成的ROS主要起细胞防御功能,与此不同的是非吞噬细胞中NADPH氧化酶产生的ROS作为信号分子,参与机体内信号转导途径,调节细胞分化、增殖、衰老和凋亡等活动;当NOX家族蛋白异常表达,ROS水平急剧增加时,则能诱导机体内多种疾病的发生。     

FHL1的结构和功能及其与疾病的关系

FHL（four and a half LIM domain）家族是含有4 个半LIM结构域的蛋白家族,现发现该家族由5 个成员,即FHL1、FHL2、FHL3、FHL4、FHL5 /ACT 组成,其表达具有组织特异性.它们通过LIM结构域与某些结构蛋白、激酶、转录调控因子等多种蛋白质相互作用,对某些基因的表达、细胞分化与发育、细胞骨架形成等发挥重要调控作用.FHL1（four and a half LIM domain 1）是FHL家族中表达最广泛的成员,尤其在骨骼肌和心肌中高表达.近年研究表明其参与某些病理过程,与心血管疾病、肌肉疾病、肿瘤疾病等相关.     

滋养层细胞凋亡调控的研究

胎盘滋养层是母体与胎儿之间进行氧气、营养物质和代谢物交换的组织。大量研究证实 ,滋养层细胞凋亡是正常妊娠过程中存在的一种生理现象 ,具有重要的生理意义。滋养层细胞的凋亡受到Bcl 2家族蛋白、Fas FasL系统、p5 3蛋白及细胞因子等多种因素的调控。本文主要介绍滋养层细胞凋亡的调控及滋养层细胞凋亡与妊娠相关疾病的研究进展。     

Bcl-2/Beclin-1复合体在自噬中的调节作用

自噬(autophagy)是一种进化保守的溶酶体依赖性分解代谢途径,是细胞维持自稳态的重要机制之一,并参与多种疾病的发生. Beclin-1作为自噬体成核的关键分子之一,是1个调节自噬的关键靶点. Beclin-1有1个BH3结构域,Bcl-2、Bcl-XL等可以通过这个BH3结构域与Beclin-1结合而影响其活性. 抗凋亡Bcl-2家族蛋白和Beclin-1的表达水平、磷酸化、分子的亚细胞定位以及BH3-only蛋白等,均可调节Beclin-1蛋白和Bcl-2家族蛋白结合水平,进而调控自噬的发生,并可能对细胞最终走向自噬还是凋亡起着关键作用.     

植物NAC转录因子

植物生命过程依赖众多转录因子去调控基因的表达。NAC类蛋白是近十多年来新发现的一类植物特有的、数量较多的转录因子家族。研究发现,拥有一个介导DNA结合的特有的N末端新转录因子折叠结构域和一个具有高度多样性的C端转录功能区是这类转录因子共同的结构特征。NAC转录因子不仅普遍参与了植物生长发育过程的调控,包括茎顶端分生组织、花器官的发育、侧根的形成、细胞次生壁的形成以及叶片衰老等,还参与了胁迫应答、激素调控以及诱导寄主对病原菌侵染产生抗性等过程。本文综述了植物NAC转录因子的结构特征、生物学功能、作用机理以及表达调控等方面的研究进展,对该领域的研究进行了展望。     

调控细胞凋亡的主要基因与因子

细胞凋亡是生物界广泛存在的一种重要的生命过程,许多研究者已从不同角度对其发生机理,影响因子,应用等方面开展了卓有成效的研究,本文主要论述了与细胞凋亡调控有关的ced基因,bcl-2基因,ICE基因,p53基因,Fas基因等,以及与之有关的蛋白,如caspases家族,TRAIL等,随着对细胞凋亡机理研究的不断深入,衰老等生理现象和细胞凋亡相关的疾病和机理将逐步得以阐明,并以此为基础建立相应诊断方法。