布鲁氏菌2308ery基因启动子缺失株的构建及鉴定

目的:构建布鲁氏菌2308株ery基因启动子缺失株。方法:用PCR方法从亲本株2308上扩增ery基因启动子侧翼序列,将该片段与pMD19-T连接,亚克隆为自杀载体pGEM-7zf-Δery-sacB。将自杀载体电转化布鲁氏菌感受态细胞中经同源重组后,分别用100 mg/L氨苄和7%蔗糖筛选。对获得的基因缺失株进行RT-PCR鉴定和遗传稳定性检测。结果:成功获得ery基因启动子缺失株,2308Δery基因启动子缺失株未扩增出eryA基因。并且该缺失株在10代以内未发生回复突变。结论:成功构建2308Δery基因启动子缺失株,为研究布鲁氏菌的毒力基因及其流产机制奠定基础。     

AmoA、AmoE和AmoF蛋白在嗜水气单胞菌铁载体合成中的作用研究

铁载体被认为是嗜水气单胞菌的毒力因子之一, 其由amoCEBFAGH七个基因编码, AmoCGH在前人的研究中已证实参与铁载体的合成。RT-PCR实验表明amoAEF基因的表达受到铁的调控。为进一步探究amoAEF基因的功能, 利用融合PCR和基因同源重组原理, 以自杀性质粒PRE112为载体构建基因缺失株ΔamoA、ΔamoE和ΔamoF。通过CAS平板检测实验以及arnow实验来检测野生株WT与各基因缺失突变株铁载体的合成情况, 并比较野生株与各缺失株在低铁培养基中的生长差异。结果显示, 成功构建了基因缺失株ΔamoA、ΔamoE和ΔamoF; 在富铁条件下, 基因缺失株ΔamoA、ΔamoE和ΔamoF的生长与野生株无显著性差异, 但在低铁条件下, 基因缺失株ΔamoA、ΔamoE和ΔamoF的生长能力、铁载体合成能力显著低于野生株。可见, amoA、amoE和amoF基因是嗜水气单胞菌铁载体合成的关键基因, 其缺失会导致细菌在低铁环境中的生长受到抑制。     

RsbV基因缺失对单核细胞增生李斯特菌毒力的影响

[目的]探讨RsbV基因缺失对单核细胞增生李斯特菌(LM)毒力的影响.[方法]运用基因重叠延伸PCR( SOE-PCR)技术扩增出LM-XS5野毒株的RsbV基因缺失片段,然后用同源重组方法构建RsbV基因缺失株;通过肝脾细菌计数、LD50的测定和毒力基因转录水平的检测(qRT-PCR),研究LM野毒株和缺失株在毒力上的差异.[结果]RsbV基因缺失株LD50是野毒株的104倍(P＜0.01);缺失株在小白鼠肝和脾内的载菌量均明显减少(P＜0.05);实时荧光定量PCR检测结果发现,缺失株4个毒力因子的表达水平均显著低于野毒株(P＜0.05);缺失株免疫小白鼠后对野毒株的攻毒具有良好的免疫保护作用.[结论]RsbV对LM的4个毒力基因inlA、LLO、PlcA和PrfA的表达具有调控作用;RsbV基因缺失株毒力明显减弱,但仍保留了较强的免疫原性.     

橙色红曲菌As3.4384 orf7基因缺失株的构建及其功能分析

红曲菌能产生多种有益的次级代谢产物,但红曲菌也产生一种对人和哺乳动物肝和肾有毒害的毒素,即桔霉素。因此控制毒素的产生是保障红曲产品安全性所必须的。故对桔霉素的合成途径及相关的基因做深入了解。6个桔霉素合成相关的基因成簇位于21 kb的DNA片段上。克隆了一个新基因(orf7基因),其位于该基因簇的外侧。采用基因敲除技术,构建红曲菌orf7基因缺失菌株。并采用紫外分光光度法检测orf7基因缺失菌株的红曲色素产量,HPLC法检测其桔霉素产量。orf7缺失菌株产红曲色素能力与出发菌株As3.4384相比没有变化;产桔霉素培养13~19 d,桔霉素的产量与出发菌株As3.4384相比增加了 142.4%。从而证实orf7基因与桔霉素代谢相关。     

严重寡精症ICSI精子供体的DAZ基因拷贝缺失研究

DAZ基因拷贝缺失与人类的生精障碍有关。为了解中国正常生精男性和ICSI中严重寡精症精子供体DAZ基因拷贝缺失的分布, 探讨DAZ基因拷贝数检测在严重生精障碍精子供体遗传缺陷筛查中的意义, 本研究运用多重PCR和PCR-RFLP技术, 对128例严重寡精症ICSI精子供体和287个正常生精男性的DAZ基因缺失进行了研究。发现DAZ1/DAZ2、DAZ3/DAZ4和全部4个拷贝缺失等3种拷贝缺失类型, 其中全部4个拷贝缺失仅见于严重寡精症患者, 频率为11.7%; DAZ1/DAZ2缺失的频率在严重寡精症患者中显著高于正常男性(9.4% vs 2.8%, P = 0.004); 在严重寡精症患者中DAZ基因拷贝完全缺失与DAZ1/DAZ2缺失的总发生率为21.1%。DAZ3/DAZ4缺失的频率在两组人群中无显著差异(7.0% vs 3.8%, P > 0.05)。这些结果提示, DAZ基因全部拷贝缺失是严重寡精症患者生精障碍的常见遗传病因, 而DAZ1/DAZ2缺失则可能是一种高风险因素。鉴于上述DAZ基因缺失在严重生精障碍精子供体中较高的发生率, 在应用ICSI进行辅助生育前, 建议对严重寡精症的精子供体进行DAZ基因全缺失与DAZ1/DAZ2共缺失筛查, 以评估其男性后代患病的风险。     

Nodal基因5''末端侧翼序列增强子的分析

Ｎｏｄａｌ基因属于ＴＧＦ－β超家族，它在小鼠胚胎早期发育的中胚层形成过程中起着重要的作用。Ｎｏｄａｌ基因缺失的小鼠由于没有中胚层的形成导致死亡。分析了Ｎｏｄａｌ基因的侧翼序列。利用荧光素酶为报告基因，构建了一系列含有侧翼序列亚克隆及基缺失体报告基因质粒，并转化了Ｆ９细胞。分析这些亚克隆及其缺失体对报告基因活性的影响。在Ｎｏｄａｌ基因上约－２ｋｂ处有一个增强子元件存在并鉴定了它的发细胞种类特异性。     

禽致病性大肠杆菌gspL基因缺失株构建及生物学特性

【目的】研究gsp L基因缺失对禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)生物学特性的影响。【方法】利用Red重组方法构建禽致病性大肠杆菌DE17株的gsp L缺失株;分析野生株与缺失株的生长特性、黏附和入侵DF1细胞的差异;采用荧光定量PCR的方法比较野生株和缺失株毒力基因转录水平的变化;比较野生株与缺失株的半数致死量(LD50)差异。【结果】gsp L缺失不影响DE17的生长特性,但其黏附和入侵DF1细胞能力显著下调。荧光定量PCR检测结果表明,缺失株毒力基因lux S,pfs,fyu A和iss转录水平明显上调,tsh的转录水平明显下调,而vat,ibe A,stx2f和omp A的转录水平无显著变化;LD50检测结果表明,缺失株比野生株毒力增强了12倍。【结论】gsp L基因的缺失不影响禽致病性大肠杆菌的生长特性,但能减弱其黏附和入侵能力,且可以正调控禽致病性大肠杆菌部分毒力基因的转录水平,推测gsp L基因可能与APEC对宿主的致病性有关。     

阿维莲霉菌中aveD基因缺失对阿维菌素合成的影响

利用aveD基因的缺失载体pCZ8(pKC1139::△aveD)对阿维菌素（Avermectin）的产生菌阿维链霉菌（Streptomyces avermitilis)76-9的aveD基因进行缺失获得aveD缺失突变株。经摇瓶发酵和HPLC检测,发现该突变株只产生阿链菌素B组分。说明将阿维链霉菌的aveD基因缺失,并不影响下游aveF的表达。缺失突变株的阿维菌素的总产量与出发菌株的总产量基本相同,突变株中B1的产量略有提高,阿维菌素B2的含量显著提高。     

一个BMD家系中DXS 164缺失突变的分析

用DXS164探针在一例BMD家系中发现有缺失突变。这一缺失跨越了p^ERT87-1至p^ERT87-15区域，缺失片段至少在50kb以上。用DMD基因内部的J-Bir和DMD基因两侧的C7和754探针确定缺失片段位于DXS164。本文还对这一家系中一正常男性可能存在754片段的重复进行了探讨。     

东北地区抗肌营养不良蛋白基因缺失的研究及应用

为了解东北地区Duchenne／Becker型肌营养不良症患者基因缺失的分布及进行产前基因诊断,用12对引物以多重PCR法检测120例DMD／BMD患者,并分析缺失型患者dystrophin基因的断裂点分布及各引物优化组合,并将高危男性胎儿行缺失检测。结果表明,缺失检出率为49．2％,66．4％的断裂点位于内含子44～52内,以内含子50为最多(14．8％),4对外显子引物的优化组合为外显子48、51、45和8,总检出率为41．7％;29例高危胎儿中9例男性胎儿为缺失型,缺失位点与先证者相同。通过首次对我国东北地区DMD／BMD患者筛查缺失发现dystrophin基因缺失主要分布于两个热区内,与国内其他地区比较外显子8附近区域可能是该地区缺失断裂的高发区;内含子44～52高度不稳定,其中内含子44的稳定性要高于中央缺失热区的稳定性,内含子50的不稳定性存在地区及种族差异;引物优化组合为检测患者及产前基因诊断提供了捷径,尤其是对散发家系是可行的并且有其优越性。     

鼻咽癌中Epstein—Barr病毒基因结构特点

鼻咽癌中感染的ＥＢＶ以潜伏态存在,只有少数基因得到表达。我们从分子生物学水平研究其潜伏机制。已知ＲＺＬＦ１基因和ＢａｍＨＩＥＺ片段内部分基因对ＥＢＶ的复制激活起关键作用。我们用体外基因扩增（ＰＣＲ）法扩增ＢＺＬＦ１基因外显子－１序列,并用序列分析法研究了该基因结构特点。此外,检测了ＢａｍＨＩＥＺ片段内的基因缺失,结果发现２１例鼻咽癌（ＮＰＣ）组织中,１１例有ＢａｍＨＩＥＺ片段内缺失,长达２．９９ｋ     

毕赤酵母重组菌株直接基因缺失方法的研究

毕赤酵母重组菌在表达外源蛋白时往往存在比较严重的蛋白降解现象,一种可供选择的解决办法就是将其中起作用的某种蛋白酶基因缺失,但目前国内外研究主要集中于非重组毕赤酵母的基因缺失,直接对重组菌进行基因缺失的研究较少。以现有的毕赤酵母基因重组菌(GS115Hir)为宿主菌,分别采用有标记的插入替换方法和无标记的Pop-In/Pop-Out方法直接缺失其PRC1蛋白酶基因和KEX1蛋白酶基因。缺失菌株经测序分析,结果显示发生了理论的基因缺失。在此基础上本文比较了这两种方法的各自优缺点,探讨了它们的不同的用途,为直接在毕赤酵母重组菌中进行基因缺失提供了有益的参考。     

一种构建马链球菌兽疫亚种血红素受体基因缺失突变株的方法

【目的】探讨一种构建马链球菌兽疫亚种基因缺失突变株的方法。【方法】PCR扩增目的基因,用pJR700温度敏感载体系统,构建目的基因载体;反向PCR扩增目的基因缺失载体片段,连接,产生目的基因缺失载体;电转化缺失重组质粒导入感受态细胞,先在37℃卡拉霉素(kan)培养基中连续培养,然后在30℃不含kan液体培养基中传代,挑取抗生素敏感菌落,PCR扩增检测抗生素敏感菌染色体上目的基因片段和链黑霉素抗性实验确认血红素受体基因缺失。【结果】获得不含抗生素基因的马链球菌兽疫亚种血红素受体基因缺失突变株。【结论】用pJR700温度敏感载体系统,构建马链球菌兽疫亚种基因缺失突变株是可行的。     

中国湖南人群GSTM1和GSTT1基因多态性与肺癌易感性关系的研究

应用病例-对照分析研究(对照组205例,肺癌病例组104例),抽提静脉血基因组DNA,采用PCR及多重PCR方法,检测谷胱甘肽转移酶GSTM1和GSTT1单独及联合缺失基因型的遗传多态性在中国湖南人群中肺癌患者和正常人群体中的分布,探讨这些多态性基因型与肺癌易感性的关系.结果显示GSTM1-/-基因型在湖南地区居民肺癌群体和正常对照人群中的频率分别为62.5%和46.3%(P<0.05);肺癌患者组GSTT1-/-基因型的频率(66.3%)显著高于正常对照组(42.4%)(P<0.05).GSTM1-/-和GSTT1-/-联合基因型在肺癌组和正常对照组中的频率分别为41.3%和22.4%(P<0.05).SPSS11.5软件统计学分析表明,这些基因型在肺癌患者组和正常对照组人群中的发生频率具有显著性差异.由此可知GSTM1基因缺失和GSTT1基因缺失分别与肺癌的易感性相关;GSTM1和GSTT1基因联合缺失与肺癌的发生和发展呈现显著正相关.     

利用焦磷酸测序技术检测H7N9禽流感病毒NA基因分子标签

本研究旨在建立H7N9亚型禽流感病毒NA基因分子标签的焦磷酸测序检测方法,用于H7N9型禽流感病毒的快速检测和鉴定。通过对公开发表的H7N9亚型禽流感病毒NA基因序列进行比对,发现分离株在NA基因特定区域缺失的15个核苷酸可作为H7N9亚型禽流感病毒NA基因特异性的分子标签。通过设计覆盖此区域的特异性扩增引物和测序引物,建立了H7N9型禽流感病毒NA基因焦磷酸测序检测方法。基于NA基因特定缺失区域建立的焦磷酸测序技术能用于H7N9亚型禽流感病毒国内分离株NA基因的快速检测和鉴定,且具有较好的特异性和重复性。通过对3株H7N9亚型禽流感病毒分离株的检测,表明3株H7N9亚型禽流感病毒的NA基因均存在15个核苷酸缺失的分子标签。本研究建立的H7N9亚型禽流感病毒NA焦磷酸测序检测方法,可用于H7N9禽流感病毒的检测和鉴定。     

ABCA1中间缺失突变体的构建及其抗砷性研究

目的:构建缺失ABCA1,ABCA1蛋白胞外第一环第264-520位氨基酸密码子的基因,并真核表达检测其抗砷性变化.方法:应用重叠区扩增基因拼接法的原理,在拼接延伸后,再进行一次PCR扩增,得到缺失第264-520位氨基酸密码子的ABCA1基因,克隆至pcDNA3.1/V5-His真核表达载体.通过激光共聚焦检测突变体细胞定位,MTT加砷后检测突变体生存率变化.结果:成功构建缺失ABCA1蛋白胞外第一环第264-520位氨基酸密码子的基因.共聚焦显微镜观察突变体定位于细胞膜上,随机区组方差分析结果显示ABCA1突变体生存率明显低于ABCA1野生型.结论:ABCA1胞外第一环缺失突变后基本丧失抗砷功能.     

基于隐马氏模型对编码序列缺失与插入的检测(英)

在基因组测序工作完成后,利用计算工具进行基因识别以及基因结构预测受到了越来越多人的重视.人们开发了大量的相关应用软件,如GenScan, Genemark, GRAIL等,这些软件在寻找新基因方面提供了很重要的线索.但基因的识别和预测问题仍未得到完全解决,当目标基因的编码序列有缺失和插入时,其预测结果和基因的实际结构相差很大.为了消除测序错误对预测结果的影响,希望能找出编码序列区的测序错误.基于这种想法,尝试根据DNA序列的一些统计特性,利用隐马尔科夫模型（Hidden Markov Model）,引入缺失和插入状态,然后用Viterbi算法,从中找出含有缺失和插入的外显子序列片段.在常用的Burset/Guigo检测集进行检测,得到的结果在外显子水平上,Sn(sensitivity)和Sp(specificity)均达到84%以上.     

鸡白痢沙门氏菌生物被膜形成相关基因rpoE的鉴定

【目的】通过鸡白痢沙门氏菌基因表达和缺失株生物特性的测定,鉴定其生物被膜形成的相关σ因子。【方法】利用结晶紫染色定量法测定沙门氏菌生物被膜形成能力;通过触酶试验测定rpo S活性,确定rpo S基因依赖性和非依赖性生物被膜形成株;利用建立的荧光定量PCR方法比较rpo S基因非依赖株在指数期和生物被膜形成期6个σ因子的基因表达差异;运用Red同源重组系统构建所鉴定σ因子基因缺失株,并测定野生株和基因缺失株对于环境应激的抵抗力差异。【结果】鸡白痢沙门氏菌S6702能够形成生物被膜,触酶试验阴性,确定S6702为rpo S基因非依赖性生物被膜形成株;荧光定量PCR检测显示,培养4-24 h后S6702中rpo E基因表达量最高;与野生株相比,Δrpo S缺失株保留了生物被膜形成能力,而Δrpo E缺失株不能形成生物被膜。rpo S和rpo E基因缺失株对于环境应激的抵抗力均显著降低。【结论】在rpo S基因非依赖性生物被膜形成株中,rpo E基因为参与生物被膜形成调控的σ因子之一,这一发现可用于进一步研究沙门氏菌生物被膜形成的调控机制。     

小鼠巢蛋白基因结构及其转录调控元件的初步鉴定

通过筛选小鼠基因组ＢＡＣ文库,得到小鼠巢蛋白基因组２３．３ｋｂ ＤＮＡ序列,其中约１５．３ｋｂ已完成测序。与小鼠ｃＤＮＡ序列比较结果表明,小鼠巢蛋白基因包含３个内含子。与大鼠及人巢蛋白基因相比,小鼠巢蛋白基因中３个内含子的位置及大小均很保守。利用神经发育的体外实验模型,检测小鼠巢蛋白基因第２个内含子对荧光素酶报告基因的调控活性。系列缺失质粒转染细胞显示,小鼠巢蛋白基因第２个内含子对报告基因的转录具     

一个BMD家系中DXS164缺失突变的分析

用DXS164探针在一例BMD家系中发现有缺失突变。这一缺失跨越了pERT87-1至pERT87-15区域,缺失片段至少在50kb以上。用DMD基因内部的J-Bit和DMD基因两侧的C7和754探针确定缺失片段位于DXS164。本文还对这一家系中一正常男性可能存在754片段的重复进行了探讨。