米尔顿姬小蜂rDNA ITS1和ITS2的序列分析及其分子鉴定

本研究测定了米尔顿姬小蜂Anselmella miltoni Girault的rDNA ITS1和ITS2序列,以探讨其分子鉴定方法。米尔顿姬小蜂的ITS1和ITS2侧翼区（18S和5.8S）序列相对稳定,ITS1和ITS2序列存在种间差异。根据18S rDNA部分序列,利用DNAMAN的Maximum Likelihood方法构建了与膜翅目其它科的系统发育树。根据米尔顿姬小蜂ITS1和ITS2序列设计了特异性引物,应用特异性引物对样品进行了PCR扩增,扩增效果理想,采用上述特异性引物可从单头米尔顿姬小蜂稳定地扩增出明显的目的DNA条带。因此,可以采用ITS1和ITS2区的特异性对米尔顿姬小蜂进行快速的分子鉴定。     

基于rDNA ITSl和ITS2序列的褐飞虱、白背飞虱和灰飞虱的分子鉴定

本研究测定了褐飞虱 Nilaparvata lugens、白背飞虱 Sogatella furcifera 和灰飞虱Laodelphax striatellus 的rDNA ITSl和ITS2的序列,以探讨这3种稻飞虱的分子鉴定方法.3种飞虱的ITSI和ITS2侧翼区(18S,5.8S和28S)序列相对稳定,但ITS1和ITS2序列在3种飞虱中变异较大.ITS1在所分析的438个位点中可变位点达294个,ITS2在分析的403个位点中可变位点为177个.根据3种飞虱rDNA的ITS1和ITS2序列设计了特异性引物,应用特异性引物对样品进行了PCR扩增,分析发现3种飞虱ITS1区的特异性引物扩增效果不理想.而ITS2区的特异性引物可以稳定地扩增出明显的目的DNA条带.因此,采用ITS2区的特异性引物可以对3种飞虱进行快速的分子鉴定.     

基于rDNA ITS1和ITS2序列的褐飞虱、白背飞虱和灰飞虱的分子鉴定

本研究测定了褐飞虱Nilaparvata lugens、白背飞虱Sogatella furcifera和灰飞虱Laodelphax striatellus的rDNA ITS1和ITS2的序列, 以探讨这3种稻飞虱的分子鉴定方法。3种飞虱的ITS1和ITS2侧翼区（18S, 5.8S和28S）序列相对稳定, 但ITS1和ITS2序列在3种飞虱中变异较大。 ITS1在所分析的438个位点中可变位点达294个, ITS2在分析的403个位点中可变位点为177个。根据3种飞虱rDNA的ITS1和ITS2序列设计了特异性引物, 应用特异性引物对样品进行了PCR扩增, 分析发现3种飞虱ITS1区的特异性引物扩增效果不理想, 而ITS2区的特异性引物可以稳定地扩增出明显的目的DNA条带. 因此, 采用ITS2区的特异性引物可以对3种飞虱进行快速的分子鉴定。     

通用引物双重PCR在节肢动物物种鉴定中的应用

【目的】本研究旨在使用基于线粒体基因通用引物的双重PCR技术同时扩增单一样本中两条标记基因,从而达到简化节肢动物物种鉴定流程的目的。【方法】在一次PCR实验中同时加入可扩增线粒体COI基因和16S rDNA两个不同分子标记的引物,对3纲8目14科的14种节肢动物物种标本的基因组DNA进行扩增;扩增产物经电泳和胶回收后测序,并BLAST在线搜索相似序列,验证基于通用引物的双重PCR在不同的动物类群中用于物种鉴定的有效性。【结果】应用基于COI和16S rDNA的引物从分属于3纲8目14科的14种节肢动物基因组DNA中均可成功扩增目的基因;扩增产物测序结果进一步证实了扩增的准确性。【结论】通过本方法进行物种的分子鉴定,不仅可以保证物种鉴定的高准确率,还可以明显减少时间与DNA样本量的消耗,这对需要快速准确鉴定物种或珍稀的材料样本十分重要。     

米尔顿姬小蜂线粒体16S rRNA与COⅠ基因片段序列测定及分析

【背景】米尔顿姬小蜂是一种入侵我国台湾地区的植食性小蜂,能够严重影响水果的产量和食用价值。目前在我国大陆没有分布,由于其个体微小,与近似种区别较小,通过传统的形态学分类方法难以鉴定,因此有必要研究其基因片段序列,探讨分子鉴定方法。【方法】利用PCR方法扩增并测定了米尔顿姬小蜂线粒体16SrRNA和COⅠ基因的部分序列,并对各序列的碱基组成进行了分析。然后根据COⅠ基因部分序列,利用DNAMAN的Maximum Likelihood方法构建了米尔顿姬小蜂与膜翅目其他科的系统发育树。【结果】16SrRNA基因的PCR扩增产物为426bp,COⅠ基因的PCR扩增产物为488bp。通过测序获得米尔顿姬小蜂16SrRNA和COⅠ基因部分序列,序列分析表明,16SrRNA和COⅠ基因的A+T含量均较高,存在较强的A+T偏向性。系统发育树显示,米尔顿姬小蜂与蚜小蜂科的Encarsia berlesei亲缘关系最近,与姬小蜂科的Chrysocharis nautius、C.eurynota亲缘关系较远。【结论与意义】本研究为米尔顿姬小蜂的分子鉴定提供了依据。     

米尔顿姬小蜂线粒体16SrRNA与COI基因片段序列测定及分析

【背景】米尔顿姬小蜂是一种入侵我国台湾地区的植食性小蜂,能够严重影响水果的产量和食用价值。目前在我国大陆没有分布,由于其个体微小,与近似种区别较小,通过传统的形态学分类方法难以鉴定,因此有必要研究其基因片段序列,探讨分子鉴定方法。【方法】利用PCR方法扩增并测定了米尔顿姬小蜂线粒体16SrRNA和COI基因的部分序列,并对各序列的碱基组成进行了分析。然后根据COI基因部分序列,利用DNAMAN的MaximumLikelihood方法构建了米尔顿姬小蜂与膜翅目其他科的系统发育树。【结果】16SrRNA基因的PCR扩增产物为426bp,COI基因的PCR扩增产物为488bp。通过测序获得米尔顿姬小蜂16SrRNA和COI基因部分序列,序列分析表明,16SrRNA和COI基因的A＋T含量均较高,存在较强的A＋T偏向性。系统发育树显示,米尔顿姬小蜂与蚜小蜂科的Encarsiaberlesei亲缘关系最近,与姬小蜂科的Chrysocharisnautius、C．eurynota亲缘关系较远。【结论与意义】本研究为米尔顿姬小蜂的分子鉴定提供了依据。     

中国新发现芙新姬小蜂孤雌产雌品系的分子鉴定及其内共生菌Rickettsia的检测

【目的】芙新姬小蜂Neochrysocharis formosa(Westwood)是世界上蔬菜潜叶蝇的优势寄生蜂。2015年6月,我们在北京发现该寄生蜂存在孤雌产雌品系(thelytokous strain),为在中国首次发现。由于芙新姬小蜂孤雌产雌品系和两性品系(arrhenotokous strain)难于从形态上进行区分,本研究旨在从分子水平对这两种品系进行鉴定,为孤雌产雌品系的后续研究和应用奠定基础。【方法】以芙新姬小蜂孤雌产雌品系TH-China和两性品系AR-China的室内饲养种群为研究对象,分别扩增芙新姬小蜂两种品系的核糖体基因(28S rDNA和ITS-1基因)和线粒体COⅠ基因序列,比较两种品系的遗传分化;采用Rickettsia特异性引物NforRick1/NforRick2扩增其16S rDNA,克隆测序并进行BLAST比对;检测在TH-China卵巢管、幼虫、蛹和成虫,以及AR-China成虫中是否含有诱导形成孤雌产雌特性的内共生菌Rickettsia。【结果】分别以引物LCO1490/HCO2198和COⅠ1/COⅠ2扩增的两段COⅠ基因序列为分子标记建立的系统发育树表明,芙新姬小蜂两种品系分别聚为2个分支,品系间的遗传距离分别为0.039和0.023;以ITS-1基因为分子标记时,两种品系间有21个差异位点,遗传距离为0.008;以28S rDNA为分子标记时,两种品系间无差异位点。从TH-China的Rickettsia中扩增的16S rDNA序列与日本报道的芙新姬小蜂孤雌产雌品系内共生菌Rickettsia sp.的16S rDNA序列(Gen Bank登录号:AB185963)100%一致。芙新姬小蜂TH-China卵巢管、幼虫、蛹和成虫中均含有Rickettsia,而AR-China成虫不含Rickettsia,推测Rickettsia是孤雌产雌特性的形成原因。【结论】线粒体COⅠ基因可将芙新姬小蜂孤雌产雌品系和两性品系分为2个明显的遗传支系,而核糖体基因28S rDNA和ITS-1基因在两种品系间没有遗传分化或不能形成2个遗传分化支系。     

玉米象Sitophilus zeamais DNA条形码研究

【目的】玉米象Sitophilus zeamais(Motschulsky)为世界性分布仓储物害虫,食性极广,在我国多数省(区)均有分布。由于该虫与米象Sitophilus oryzae(Linnaeus)形态极似,很难区别;目前唯一可靠的鉴别特征是雌、雄外生殖器,且要实现准确鉴定必须要有成虫标本,还要经过一系列的繁琐操作,鉴定难度较大,因此需要探索更加便捷高效的鉴定技术。【方法】利用分子生物学手段,通过提取玉米象的基因组DNA,使用通用引物PCR扩增ITS1、ITS2、Cytb、COⅠ、COⅡ基因并测序,通过基因序列相似性来实现快速鉴定,进而获得用于快速鉴定的DNA条形码。【结果】通过形态特征,初步确定玉米象所属大致类群;通过分子生物学手段,获得了多个基因的碱基序列作为玉米象的DNA条形码。【结论】获得多条序列用来鉴定玉米象的DNA条形码,实现玉米象快速准确鉴定,为玉米象的识别鉴定提供基础数据。     

苹果炭疽菌的分子鉴定与检测

测定苹果炭疽菌rDNA全序列,比对苹果炭疽菌和其它炭疽菌ITS序列以及构建系统关系树,发现苹果炭疽菌与胶孢炭疽菌的ITS序列相似性高达99．8％,并与胶孢炭疽菌聚在一起,可以明确苹果炭疽菌应属于胶孢炭疽菌。进一步的序列比对发现,苹果炭疽菌的18S rDNA3’端比其它胶孢炭疽菌多出一段379bp的序列,根据这一特有片段设计引物CgF1与通用引物ITS4配对,结果仅能从苹果炭疽菌中扩增出1232bp的特异性条带。用苹果炭疽菌接种离体苹果,以接种发病的病组织总DNA为模板,利用引物CgF1／ITS4进行PCR扩增,同样可以扩增出1232bp的特异性条带,而健康苹果组织DNA中未能扩增出任何条带,表明该方法可用于苹果炭疽菌的鉴定和快速检测。     

利用28S rDNA种特异引物鉴定新菠萝灰粉蚧

【目的】新菠萝灰粉蚧Dysmicoccus neobrevipes Beardsley是近年来口岸中经常截获的检疫性有害生物,其与近似种形态差异小,极易随进境果蔬及种苗传播蔓延,但却难以快速准确鉴定。【方法】以新菠萝灰粉蚧为靶标,进境水果中常截获的其他6种粉蚧为对照,利用扩增粉蚧的28SrDNA通用引物扩增7种粉蚧基因部分序列,同时应用Primer Premier 5软件设计新菠萝灰粉蚧28S rDNA种特异引物1对(D.neo-28SF/R)。【结果】获得了新菠萝灰粉蚧及其他6种粉蚧的28SrDNA基因部分序列;种特异引物(D.neo-28SF/R)能稳定扩增出片段大小为235 bp条带,且该引物只对新菠萝灰粉蚧具有扩增能力,对其他6种粉蚧不具有扩增效果;对不同寄主来源新菠萝灰粉蚧亦具有同样的扩增效能。【结论】利用基于28S rDNA种特异性PCR方法,建立了新菠萝灰粉蚁快速分子检测技术。该技术方法完全可用于新菠萝灰粉蚧的准确识别,对有效阻截其进一步扩张蔓延具有重要实践意义。     

红色毛癣菌菌株的特异性PCR鉴定方法研究

目的建立一种快速的红色毛癣菌分子生物学鉴定方法。方法根据红色毛癣菌保守区域-真菌核糖体DNA（rDNA）的转录间隔区（ITS）设计特异性引物,采用上游：ITS19865＇GAC ACC AAG AAA AAA TTC TCT GAA GA3＇,下游：ITS24415＇GTC CTG AGG GCG CTG AA3＇为引物对45株红色毛癣菌、5株须癣毛癣菌和1株紫色毛癣菌菌株的DNA进行PCR扩增,观察产物电泳带型的差异。结果 45株红色毛癣菌均能扩增出目的片段,5株须癣毛癣菌和1株紫色毛癣菌均无目的片段扩增出。结论红色毛癣菌可用特异引物PCR方法快速鉴定。     

临床常见镰刀菌的鉴别

目的从分子生物学角度寻找一种快速准确鉴定临床常见镰刀菌的方法。方法将受试镰刀菌接种于PDA培养基,观察其菌落及镜下形态,在此基础上PCR扩增受试镰刀菌的rDNA ITS并测其序列,在GenBank核酸序列数据库进行同源序列搜索及分析。选择限制性内切酶Dra Ⅱ和Cfr13 Ⅰ进行RFLP。设计了茄病镰刀菌的种特异性引物Sol1、Sol2,初步验证其特异性。结果形态学鉴定结果显示,茄病镰刀菌所占比例最高,除2株串珠镰刀菌外,其余镰刀菌ITS序列分析的结果与形态学鉴定结果一致。茄病、层生和串珠镰刀菌的Dra Ⅱ、Cfr13 I酶切带形互不相同。用Sol1、Sol2扩增受试菌的rDNA ITS,只有茄病镰刀菌为阳性。结论rDNA ITS序列测定及其PCR-RFLP可用于初步鉴别几种临床常见镰刀菌,合适的种特异性引物可以初步快速鉴定茄病镰刀菌。     

玉米叶蝉缨翅缨小蜂Anagrus dmitrievi(膜翅目,缨小蜂科)DNA条形码研究

[目的]玉米叶蝉缨翅缨小蜂Anagrus dmitrievi Triapitsyn&Hu是玉米三点斑叶蝉Zyginidia eremita Zachvatkin卵期的重要寄生性天敌,在玉米三点斑叶蝉生物防治中具有广阔的应用前景.由于该寄生蜂个体微小,通过传统昆虫分类方法难以将其与同类卵寄生蜂准确分类.因此,本研究旨在为玉米叶蝉缨翅缨小蜂的快速准确鉴定提供技术支持.[方法]在室内,采集玉米三点斑叶蝉卯饲养玉米叶蝉缨翅缨小蜂至成虫.根据玉米叶蝉缨翅缨小蜂成虫的体色、触角、翅等形态特征对标本进行鉴定,并利用无损伤法提取样本基因组DNA,通过PCR扩增和测序对COⅠ和ITS2基因进行DNA条形码分子标记试验.[结果]形态学鉴定结果表明饲养获得的寄生蜂标本为玉米叶蝉缨翅缨小蜂.获得了该寄生蜂COⅠ和ITS2的部分序列,相似比对、遗传距离和分子进化树结果表明,玉米叶蝉缨翅缨小蜂COⅠ和ITS2序列分别与NCBI数据库中的同属其他种的相关基因有较高相似性,但存在一定遗传差异,可明显区分.[结论]获得的玉米缨翅缨小蜂的COⅠ和ITS2基因序列可作为玉米叶蝉缨翅缨小蜂的DNA条形码,为后续该寄生蜂的快速准确鉴定提供了分子数据.     

rDNA ITS序列在ACCC真菌鉴定中的应用

【目的】真菌无处不在,并与人类生活紧密相关。真菌的鉴定是科学研究和资源开发利用的基础。本研究从中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)随机选取已经定名的112株库藏真菌菌株作为实验材料,通过DNA测序,评估核糖体DNA内转录间隔区(rDNA ITS)序列在真菌属级鉴定上的应用。【方法】采用真菌DNA条形码rDNA ITS的序列测定和在GenBank中查寻比对的方法,对这些菌株进行属水平的鉴定复核。【结果】通过研究,供试菌株中有80株的属名与原鉴定相符,同时表明序列中套峰的情况降低与Gen Bank中序列比对的相似性。【结论】rDNA ITS序列测定法可以用于真菌菌株进行属水平的鉴定复核,国家菌种保藏机构应对已入库保藏和即将入库的所有真菌菌株都进行属水平的鉴定复核,并对菌株鉴定结果作审慎处理,原定名的名称及其变更历史应以"曾用名"在数据库中保留。     

基于形态和分子数据的山东梨园新成灾害螨柑橘全爪螨的鉴定

【目的】本研究旨在准确鉴定山东梨园一种新成灾害螨,为其进一步研究和有效防控奠定基础。【方法】采用体视显微镜直接观察雌成螨的形态特征,制作雄成螨的侧面观玻片标本,观察其阳茎形态特征,进行形态鉴定。从单头雌成螨中提取基因组总DNA,以螨类特异性引物扩增线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(cytochrome oxidase subunitⅠ, COⅠ)基因及核糖体DNA第一内转录间隔区(internal transcribed spacer 1, ITS1)和第二内转录间隔区(internal transcribed spacer 2, ITS2)基因并测序,所得序列在NCBI网站上进行Blastn比对,下载与其一致性高的相关基因序列构建系统发育树和计算遗传距离,进行分子鉴定。【结果】结果表明,梨树上害螨的雌成螨背部有粗大突起,可确定为全爪螨属Panonychus害螨。雄螨阳茎特征与柑橘全爪螨Panonychus citri的很相似,其COⅠ, ITS1和ITS2基因序列均与柑橘全爪螨的相应序列具有很高的同源性(核苷酸序列一致性在99%以上),基于COⅠ, ITS1和ITS2基因序列计算的其与柑橘...     

以23S rDNA一个多变区作为分子标记对致病杆菌属细菌进行分类鉴定

【目的】致病杆菌属(Xenorhabdus)细菌是一类重要的生物杀虫剂,斯氏属昆虫病原线虫的共生菌,建立快速准确的分类鉴定方法,对研究开发这类细菌至关重要。【方法】本研究PCR扩增测序了本室保藏的26株,含20种已定名致病杆菌属细菌的一段845 bp的23S rDNA序列,构建了基于这段序列的致病杆菌属系统树并与基于几乎全长16S rDNA序列的相应系统树进行比较,分析了两者作为致病杆菌属细菌分类鉴定分子标记的优缺点。【结果】结果表明,与全长16S rDNA序列相比,所选择的23S rDNA序列片段所含可变位点、简约信息位点比例更高,遗传距离数值跨度大。【结论】上述结果显示该序列片段可用于致病杆菌属细菌进行分类鉴定,特别适用于对野外资源调查中采集到的大量菌株进行快速鉴定。     

无绿藻PCR ITS1-ITS2基因分型法的建立及应用

目的建立无绿藻(Prototheca)PCR ITS1-ITS2基因鉴定分型方法,并通过系统发育树以研究各型别无绿藻菌株间的亲缘关系。方法抽提5株无绿藻临床分离菌株的DNA,通过特异性引物扩增ITS1及ITS2区后,根据该区域核苷酸片段的差异进行基因分型,借助MEGA6.0软件建立系统发育树,并通过SSU rDNA测序加以验证。结果 5株菌株中,1株鉴定为P.zopfii hydrocarbonea,2株鉴定为P.wickerhamii。虽然由于数据库中缺乏P.zopfii portoricensis菌株ITS序列导致1、2号菌株不能被鉴定,但ITS区系统发育树中这两株菌仍被归为P.zopfii中独立的一簇,与SSU rDNA系统发育树相近,证明此分型方法无误。结论 PCR ITS1-ITS2基因分型法可作为一种有效基因分型方法用于鉴定和监测无绿藻感染。     

油茶白绢病原菌齐整小核菌分子检测的研究

目的：设计特异性引物建立油茶白绢病齐整小核菌的快速分子检测体系。方法：扩增齐整小核菌核糖体DNA ITS区并测定其序列,比较该序列与GenBank中近似种的ITS序列差异,设计了特异性引物BF1和BR2。结果：该引物可以从齐整小核菌中扩增得到约540bp特异性条带,而扩增其它近似或相关菌株时没有相应的特异性条带。在25μL PCR反应体系中,引物BF1和BR2检测灵敏度为1pg浓度DNA。结论：利用设计的BF1和BR2特异性引物结合PCR方法可快速的扩增出齐整小核菌DNA,检测灵敏度为1pg.但在生产实践中诊断油茶白绢病发病前组织中的齐整小核菌还需要进一步研究。     

应用特异PCR快速鉴定微生物肥料中4种乳酸菌

【目的】植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)和德氏乳杆菌(L.delbrueckii)是微生物肥料生产中常用的乳酸菌,它们表型特征相似,若采用传统方法鉴定则费时费力,为准确、快速地鉴定这些种,建立种特异PCR方法。【方法】利用NCBI中Primer-BLAST(引物设计和特异性检验工具),以GenBank数据库中上述菌种的recA和gyrB为靶基因,设计和筛选种特异性引物从而建立相应特异PCR鉴定方法。【结果】经过乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、片球菌属(Pediococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)和假单胞菌属(Pseudomonas)7个属24个种共40株标准菌株的实验验证,4个目标种分别扩增出唯一的目的产物,而其他种均无目的扩增产物。采用建立的4种特异PCR方法对产品中分离的16株乳杆菌进行鉴定,结果与16S rDNA序列分析、Biolog鉴定结果一致。【结论】建立的特异PCR鉴定方法均具有较高的种内通用性和种间特异性,可快速、准确的用于微生物制剂中植物乳杆菌、德氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌的检测和鉴定,具有较好的应用前景。     

绵羊胚胎性别鉴定试剂盒的研究

根据绵羊Y-染色体的特异序列和常染色序列分别设计了确定公羊Y-染色体特异序列的3对特异性引物和内标基因的4对特异性引物。单重PCR扩增绵羊基因组DNA,筛选出了3对Y-染色体特异引物和3对羊DNA特异内标引物。将不同的绵羊Y-染色体特异引物与内标引物组合,利用多重PCR扩增绵羊基因组DNA,筛选出了1个可用于羊早期胚胎性别鉴定的PCR引物组合:A0/C1。按照最优PCR扩增DNA条件配制了绵羊PCR性别鉴定试剂盒并成功应用于绵羊血液、已知性别的绵羊成纤维细胞和胚胎,表明本研究建立的体系完全可用于绵羊早期的胚胎性别鉴定。