猕猴桃果实乙烯受体基因Ad-ETR1的克隆及其表达

以"布鲁诺"美味猕猴桃(Actinidia deliciosa cv.Bruno)果实为材料,根据其它植物乙烯受体氨基酸保守区序列,设计简并引物,通过RT-PCR扩增出1个657bp大小的cDNA片段(Ad-ETR1)该片段编码219个氨基酸,与其它植物乙烯受体及其基因的氨基酸及核苷酸同源性在72%～90%之间.Northern杂交结果表明,猕猴桃果实成熟衰老进程中Ad-ETR1 mRNA的积累趋于增加.这种积累的最大值出现在乙烯进入跃变之后;乙烯处理可以促使Ad-ETR1 mRNA最大值提前出现,乙酰水杨酸(ASA)处理则显著抑制Ad-ETR1表达.     

烟草乙烯受体类似物NTHK2全长基因的克隆及其激酶结构域生化特性

应用5＇-RACE方法克隆到烟草NTHK2的全长cDNA.其全长cDNA共有3 216bp,其中5'非编码区为509bp,3＇非编码区为427bp,编码区为2 280bp,编码产物为760个氨基酸.NTHK2氨基酸序列与植物中的许多杂合型的两组分乙烯受体基因有较高的同源性,具有推测的组氨酸激酶结构域和接受域;但是,在激酶结构域中没有保守的组氨酸,而是被一个天冬氨酸残基所替代.为了研究其生化特性,在酵母中以融合蛋白的形式表达了激酶结构域.体外激酶分析表明,当有Mg2+存在的情况下NTHK2能够自我磷酸化.进一步的研究应阐明NTHK2在植物体内是否能够作为乙烯受体,参与乙烯的信号传导过程.     

烟草乙烯受体类似物NTHK2全长基因的克隆及其激酶结构域生化特性

应用5′-ARCE方法克隆到烟草NTHK2的全长cDNA。其全长cDNA共有3216bp,其中5′非编码区为509bp,3′非编码区为427bp,编码区为2280bp,编码产物为760个氨基酸。NTHK2氨基酸序列与植物中的许多杂合型的两组分乙烯受体基因有较高的同源性,具有推测的组氨酸激酶结构域和接受域。但是,在激酶结构域中没有保守的组氨酸,而是被一个天冬氨酸残基所替代。为了研究其生化特性,在酵母中以融合蛋白的形式表达了激酶结构域,体外激酶分析表明,当有Mg^2 存在的情况下NTHK2能够自我磷酸化。进一步的研究应阐明NTHK2在植物体内是否能够作为乙烯受体。参与乙烯的信号传导过程。     

水稻花药绒毡层特异表达基因RA39的克隆与表达特性分析

利用cDNA减法杂交,差异杂交筛选和RACE等技术。从水稻（Orza sativaL.ssp.japonica)中克隆了一个新的绒毡层特异性cDNA,其编码基因被命名为RA39。该cDNA长1013bp。编码由298个氨基酸残基组成的多肽RA39是一个单拷贝基因。在绒毡层细胞中特异性表达。在小孢子母细胞减数分裂期的绒毡层细胞中有较高的表达活性。用PSORT和PPSEARCH软件进行的结构分析揭示出RA39蛋白的N端是一个由17个氨基酸残基组成的信号肽,该蛋白包含一个跨膜区和一个胞质尾区两个主要结构域以及多个蛋白激酶的磷酸化位点。     

水稻逆境响应基因OsMsr15的表达分析与克隆

应用Affymetrix水稻表达芯片,分析了苗期和孕穗期的培矮64S水稻基因在高温、干旱和低温逆境处理条件下的表达模式,发现多个与逆境反应相关基因.其中,OsMsr15(Oryza sativa L.multiple stresses responsivegene 15)受高温、干旱和低温胁迫诱导,表达水平均显著上调.实时定量PCR分析结果与芯片数据基本吻合.序列分析表明,该基因无内含子,ORF(open reading frame)全长为717 bp,编码一个由238个氨基酸残基组成、具有典型C2H2结构域的锌指蛋白,推测相对分子质量约为2.46 kD,pI值约为8.90,蛋白分子的氨基端和羧基端分别存在一个推测的核定位信号B-box和EAR(ERF-associated amphiphilic repression)基序.对OsMsr15可能的启动子区域进行分析,发现多种与逆境诱导相关的调控元件.该基因编码的蛋白在不同物种中存在高度相似性,显示OsMsr15基因可能作为一个保守的耐逆基因,参与植物的多种耐逆反应过程.     

PTHrP受体胞外区基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

PTHrP(甲状旁腺激素相关蛋白,Parathyroid hormone related protein)与多种肿瘤的生物学行为有关,尤其对肿瘤的骨转移起重要作用。应用其可溶性受体阻断它的病理作用是一个非常值得研究的课题。从肾癌组织中提取RNA,采用逆转录PCR (RT-PCR)方法获得PTHrP受体N端胞外区543碱基对的带信号肽的cDNA片段。将其核苷酸序列与国外发表的资料相比,基因中第262位核苷酸由T变为C,相应密码子由TAC变为CAC,导致氨基酸变异,即由酪氨酸变为组氨酸。将获得的受体基因克隆到原核表达载体pET-3a,在大肠杆菌得到高效表达,经ELISA证实表达产物可与PTHrP特异性结合。体外生物学活性检测表明表达产物可阻断PTHrP的生物学活性。     

水稻花药绒毡层特异表达基因RA39的克隆与表达特性分析

利用cDNA减法杂交、差异杂交筛选和RACE等技术,从水稻(Oryza sativa L. ssp. japonica)中克隆了一个新的绒毡层特异性cDNA,其编码基因被命名为RA39.该cDNA长1 013 bp, 编码由298个氨基酸残基组成的多肽.RA39是一个单拷贝基因,在绒毡层细胞中特异性表达,在小孢子母细胞减数分裂期的绒毡层细胞中有较高的表达活性.用PSORT和PPSEARCH软件进行的结构分析揭示出RA39蛋白的N端是一个由17个氨基酸残基组成的信号肽,该蛋白包含一个跨膜区和一个胞质尾区两个主要结构域以及多个蛋白激酶的磷酸化位点.     

蚓果芥乙烯受体基因的克隆与进化分析

采用已报道的十字花科植物乙烯受体基因(Ethylene Receptor 1,ETR1)通用引物,以蚓果芥基因组DNA为模板,经PCR分析BhETR1的多态性,进而从分子水平上阐明蚓果芥的进化特征.结果表明:(1)已克隆得到的14条ETR1基因序列,长度为1 644～1 661 bp;经Bioedit软件比对,14条核苷酸序列之间相似性为93％～98％,蛋白氨基酸序列相似度为78％;采用DnaSP v5程序分别统计BhETR1序列多态性,发现14条BhETR1序列形成了14种单倍型.(2)从GenBank数据库下载蚓果芥近缘物种ETR1序列进行进化分析,系统发育分析表明蚓果芥14条ETR1序列形成3大分支;根据分支进化关系,每支中分别选取克隆2(c2)、克隆29(c29)、克隆35(c35)与拟南芥ETR1(AtETR1)和琴叶鼠耳芥ETR1(AlETR1)的序列进行比对,其一致性均为78％,说明BhETR1是一个乙烯受体类似(ETR1-like)基因,而蚓果芥自身14条序列的高度异质性表明蚓果芥的遗传背景相对复杂.     

甜瓜乙烯受体基因Cm-ETR1 cDNA的克隆及表达特性分析

乙烯感知和信号转导的初始成分是乙烯受体,为探明甜瓜乙烯受体基因Cm-ETR1在甜瓜果实成熟过程中的作用,以甜瓜品种河套蜜瓜为材料,根据GenBank中登录的甜瓜乙烯受体基因Cm-ETR1的cDNA序列(登录号为AF054806),设计合成特异性引物,采用RT-PCR技术克隆得到Cm-ETR1基因全长cDNA序列,提交到GenBank中(登录号为EF495185)。序列分析表明,序列长度为2 256 bp,编码区为2 223 bp,编码740个氨基酸,与已报道的cantalupenis甜瓜ETR1基因的cDNA序列完全一致。Cm-ETR1蛋白的系统进化树分析结果表明,该乙烯受体蛋白在各物种间高度保守,与黄瓜乙烯受体蛋白相似性最高,一致性为99%,与龙眼乙烯受体蛋白相似性最低,一致性为86%。定量PCR分析结果显示,随着甜瓜果实内源乙烯合成量和成熟程度的增加,Cm-ETR1基因的表达量同步增加,在果实乙烯跃变期,Cm-ETR1的表达量也达到最高值,内源乙烯合成量与Cm-ETR1基因表达量间呈显著正相关,表明Cm-ETR1基因在甜瓜果实成熟过程中可能具有重要的作用。     

人趋化因子受体CXCR4基因的克隆及原核表达

目的:构建人CXCR4原核表达载体并在大肠杆菌中进行表达。方法:从健康人外周血单个核细胞提取总RNA,以RT-PCR获得CXCR4基因全长1059bp的完整编码序列,将其克隆入载体pMD-18T中,经限制性内切酶和菌落PCR分析并测序证实的阳性重组子与表达载体pET-28a( )连接并转化大肠杆菌BL21(DE3)。结果:12%SDS-PAGE分析表明,在30℃以IPTG诱导获得分子量为43ku的His-CXCR4融合蛋白表达带,诱导4h后此蛋白表达量约为全菌总蛋白的25%。结论:成功获得人CXCR4基因融合蛋白。     

水稻多逆境诱导基因OsMsr4的克隆与表达分析

为深入了解水稻逆境反应的分子机理和发现新的耐逆相关功能基因,采用Affymetrix水稻表达芯片分析超级稻两优培九母本培矮64S(Oryza sativa L.)不同生长发育时期、不同组织器官全基因组在低温、干旱、高温逆境胁迫下的表达水平,筛选出多个多因子诱导高表达特异基因(待另文发表).OsMsr4是其中一个在多种逆境条件,各生长发育时期与组织器官,其表达量均显著上调的基因,用实时定量PCR方法对其表达水平进行了进一步的分析,所得结果与基因芯片结果基本吻合.用 PCR方法扩增获得长为550 bp全长基因序列,其编码的144个氨基酸残基形成Cys2His2型双锌指结构蛋白,并且锌指结构的α-螺旋区含有植物锌指蛋白特定的保守序列QALGGH.因此,OsMsr4有可能是TFⅢA型锌指蛋白,作为转录因子参与各种环境胁迫应答反应,调控多个逆境相关基因表达.     

VEGF受体KDR胞外区基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达

VEGF(血管内皮细胞生长因子,Vascular Endothelial Growth Factor)是刺激内皮细胞增殖和新生血管形成的最重要因子,与多种实体瘤的生长和转移密切相关。应用其可溶性受体阻断它的病理作用是一个非常有前景的课题。将VEGF受体KDR胞外区前三个Loop 969碱基对的cDNA片段克隆到杆状病毒表达载体pFastBacI,与杆状病毒表达载体Bacmid同源重组后,转染昆虫细胞SF9,获得重组杆状病毒并证明了目的基因的高效表达。经Western blot证实表达产物的特异性。经ELISA和体外生物学活性检测表明表达产物可阻断VEGF的生物学活性,抑制鸡胚CAM血管的生长。     

水稻LRR型类受体蛋白激酶胞外区的原核表达及多克隆抗体制备

前期研究表明,水稻根尖细胞质膜类受体蛋白激酶OsRLK的表达受盐胁迫诱导.为了进一步研究该激酶的生理功能,通过反转录PCR得到OsRLK胞外区cDNA片段,将其亚克隆至pET29a原核表达载体并在大肠杆菌中实现了高表达,表达量约为细胞总蛋白的30%.重组蛋白经SDS-PAGE分离,染色切胶收集后,作为抗原免疫新西兰家兔,分离抗血清,经纯化得到1:20 000效价的多克隆抗体.Wescem blot结果显示,该抗体能特异识别在原核表达系统内表达的抗原,以及水稻根尖细胞质膜组分中的LRR型类受体蛋白激酶,并且在蛋白质水平证实该激酶为盐胁迫响应蛋白.     

草鱼瘦素受体基因片段序列的克隆及其组织表达分析

根据斑马鱼、大西洋鲑和人等物种巴知的瘦素受体基因核苷酸保守区序列设计一对简并引物,通过RT-PCR法从草鱼肝胰脏中首次克隆获得草鱼瘦素受体基因的片段序列.该片段序列长713 bp,编码237个氨基酸,氨基酸序列分析表明草鱼瘦素受体基因片段氨基酸序列与其他物种的相似性在35％ -86％之间.通过邻接法(Neighbor Joining,NJ)构建系统进化树显示,鱼类的瘦素受体独立聚成一支,草鱼与金鱼、斑马鱼聚成一支,再与日本青鳉、黑点青鳉、红鳍东方鲀和大西洋鲑聚成一支.通过实时荧光定量PCR分析草鱼瘦素受体基因的组织差异表达,结果表明,草鱼瘦素受体基因在肝胰脏、肌肉、脑、心脏、脾和肠系膜脂肪组织中均有表达,其中在脾脏组织中表达量最多,显著高于其他组织(P＜0.05),其次是心脏、脑、肌肉和肠系膜脂肪组织,在肝胰脏组织中表达量最低,且显著低于其他组织(P＜0.05).     

TNF受体（P55）胞外区基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

TNF与多种疾病密切相关。为了获得大量具有生物学活性的可溶性TNF受体用以拮抗TNF的毒性作用,在原核表达系统中表达了TNFR（P55）的胞外区与TrxA的融合蛋白。将TNFR（P55）胞外区去信号肽的前三个结构域基因克隆入融合蛋白表达载体pET-32a,在大肠杆菌BL21（DE3）中高效表达了TrxA-TNFR融合蛋白。表达产物以包涵体形式存在,经过变性和复性,并经镍金属鳌和柱亲和层析纯化,得到了纯度较高的可溶性受体蛋白的初纯品。免疫学实验及L929细胞体外实验均表明：该蛋白具有TNFR（P55）特异的抗原性、与TNF结合的活性以及良好的抑制TNF的TNF生物学活性。     

水稻精细胞差异表达基因RSG6的克隆和初步研究

用水稻 (OryzasativaL .)精细胞优势表达克隆BF4 75 2 0 7为探针 ,筛选水稻精细胞cDNA文库 ,得到一全长为1176bp的序列 ,其开放读码框编码 2 81个氨基酸 ,与已知蛋白质无明显同源性 ,属于一新发现的基因 ,GenBank登录号为AF4 4 2 4 90。Southern杂交显示该基因可能含有内含子。RT_PCR结果显示该基因在根、叶、二细胞花粉、成熟花粉、授粉子房和精细胞中均有表达 ,但在精细胞中的表达量要高得多 ,是精细胞差异表达基因。将此基因命名为RSG6 (ricespermgene 6 )。将RSG6的编码区克隆到表达载体pQE30上 ,构建重组质粒。在大肠杆菌M15中表达出N端融合了 6×His的融合蛋白。用纯化的融合蛋白免疫家兔 ,制得高效价、高特异性的抗体     

乙烯受体差异性协作与Raf-like蛋白CTR1负调控的乙烯信号转导

以拟南芥为模式植物研究植物激素乙烯信号转导,在过去20年来取得了长足进展,并以遗传学与生物化学为基础建立了一个线性的信号转导途径模型．虽然这个模型基本上解释了乙烯信号组分参与的信号传递过程,但是,其中仍然存在若干问题亟待进一步研究．例如,上游的多个乙烯受体家族成员与CONSTITUTIVETRIPLE—RESPONSE1蛋白如何协同作用,下游的ETHYLENEINsENsITIVE2（EIN2）如何将乙烯信号传递给转录激活因子EIN3,以及是否存在其他的信号途径调控乙烯反应等．本文将着重阐述不同乙烯受体家族成员的协作对乙烯信号途径的差异性调控,植物利用多个乙烯受体感受乙烯的生物学意义,以及乙烯受体除了通过CTR1蛋白调节EIN2功能外,是否还存在其他的信号转导途径．     

绿豆象气味受体基因的克隆和时空表达谱

【目的】本研究旨在克隆绿豆象Callosobruchus chinensis触角4个普通气味受体(odorant receptor, OR)基因,明确这些OR基因在绿豆象不同日龄雌雄成虫组织中的表达谱,为进一步研究基因功能奠定基础。【方法】基于绿豆象成虫触角转录组数据,预测绿豆象OR候选基因;利用RT-PCR克隆绿豆象4个OR基因的全长cDNA序列,并对其进行生物信息学分析;利用qPCR检测这4个OR基因在绿豆象雌雄成虫不同组织(触角、不含触角的头、腹、足和翅)中以及1, 3和5日龄雌雄成虫触角中的表达量。【结果】根据预测的基因序列,克隆得到4个绿豆象气味受体基因的cDNA全长序列,分别命名为CchiOR8,CchiOR10,CchiOR16和CchiOR39,GenBank登录号分别为MW732665, MN832705, MW732664和MN832706;编码的氨基酸数目分别为369, 352, 400和367。系统发育树分析表明,CchiOR8, CchiOR10和CchiOR16均与大猿叶甲Colaphellus bowringi的同源蛋白亲缘关系较近,而CchiOR39与果...     

番茄乙烯受体结构和功能研究进展

综述了近年来番茄乙烯受体研究方面的最新进展。以拟南芥的乙类受体为探针,从番茄加筛选得到Le-ETR1、Le-ETR2、Le-ETR3、Le-ETR4、Le-ETR55个有功能的乙烯受体基因。番茄乙类受体与细菌的双组分感受系统高度相似,同乙烯结合需要铜离子的协同作用。植物株发育期间通过激活某些受体基因的表达和（或）控制铜离子的转运调节乙烯敏感性。调节乙烯受体表达的基因工程显示了广阔的前景。但各个受体的功能及基因分析与活体标记的关系还需进一步研究。