人FGF21原核表达载体的构建及重组蛋白表达

构建人FGF21(fibroblast growth factor,FGF)cDNA的原核表达载体并诱导其重组蛋白表达。提取人肝脏总RNA后,经RT-PCR扩增获得目的片段,构建其T载体进行保存。再构建重组原核表达载体pET-28a(+)-h FGF21,重组质粒转化至大肠杆菌菌株BL21(DE3)中,在IPTG诱导下得到可溶性表达,采用亲和层析法纯化表达产物后,进行Western blot鉴定。成功构建重组质粒pET-28(+)-hFGF21,对其进行可溶性表达后成功纯化出his-hFGF21,经Western blot鉴定该融合蛋白可与FGF21抗体特异性结合。成功构建pET-28(+)-hFGF21,并可溶性表达his-hFGF21蛋白。     

小麦细胞分裂素氧化酶基因TaCKX1原核表达载体的构建及表达

目的:构建小麦细胞分裂素氧化酶基因TaCKXI原核表达载体并进行表达,以期得到大量的His标签融合蛋白.方法:根据GenBank中的TaCKXI序列以及pET-24a载体中的多克隆位点设计引物,以含有TaCKXl编码基因的批pMD-QRCKXI重组质粒为模板,经PCR扩增得到TaCKXI基因的DNA片段.将所得的片段与pET-24a载体连接,转化DH5α大肠杆菌,筛选阳性克隆,其测序结果与原序列一致,表明原核表达载体pET-TaCKXI已构建成功.提取per-TaCKXI质粒转化到BL21(DE3)pLysS表达菌株中,经IPTG诱导后收集菌体进行SDS-PAGE电泳鉴定,并优化其表达条件.结果:在大肠杆菌中获得TaCKXI基因融合表达,主要以包涵体形式存在;融合蛋白的分子量为58.91kD;IPTG终浓度为0.5、1.0、1.5.2.0mmol/L时,诱导融合蛋白产量相差不大.选用0.5mmol/L诱导15h获得大量的融合蛋白.经用原核表达蛋白纯化试剂盒纯化,得到了单一的融合蛋白.结论:小麦TaCKXI基因在大肠杆菌中获得了高效表达,为今后TaCKXI蛋白多克隆抗体的制备奠定了基础.     

标记蛋白HPT的表达、纯化及免疫活性鉴定

构建含有HPT的原核表达质粒,经诱导表达纯化后获得HPT抗体。从含有hpt的质粒pCambia1301上扩增目的基因,经SalⅠ和NotⅠ双酶切后与原核表达载体pET-28b（+）进行粘性末端连接,成功构建了pET-28b-hpt质粒,并转化到宿主细菌大肠杆菌Rosset(DE3)中进行蛋白表达。在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下,pET-28b-hpt原核表达载体在E.coli Rosset菌株中以包涵体的形式高效表达了HPT蛋白,并以纯化的目的蛋白为抗原免疫兔制备了多克隆抗体。利用本方法可以获得特异性强、灵敏度高的多克隆抗体。     

幽门螺杆菌CagA蛋白N端片段的表达、纯化及其与磷脂酰丝氨酸的亲和力检测

目的:表达和纯化幽门螺杆菌不同菌株的CagA蛋白N端片段,检测其与磷脂酰丝氨酸(PS)的相互作用及亲和力。方法:用PCR方法从幽门螺杆菌3个菌株中扩增出CagA蛋白N端基因,并连接到表达载体pET-28a上;转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导可溶性表达CagA蛋白N端880残基片段;经镍柱亲和纯化后,利用PLOA法检测CagA蛋白与PS的相互作用。结果:构建了3种幽门螺杆菌菌株cagA基因的原核表达质粒pET-28a/cagAJ99、pET-28a/cagA11637及pET-28a/cagASS1,并在大肠杆菌中获得可溶性表达,SDS-PAGE和Western印迹证实得到目标融合蛋白,亲和纯化得到高纯度CagA蛋白。PLOA结果表明,CagA蛋白与PS有明显的相互作用。结论:3种幽门螺杆菌菌株CagA蛋白与PS之间存在相互作用,且不同的CagA与PS有不同的亲和力。     

人膜联蛋白Ⅴ在大肠杆菌中的表达、纯化与鉴定

目的:构建人膜联蛋白Ⅴ的原核载体并诱导其表达.方法:以IPTG诱导His融合人膜联蛋白Ⅴ的表达,并应用Ni-NTASuperflow纯化.结果:PCR扩增产物碱基数量与目的片段大小一致,插入片段的序列与发表的人膜联蛋白Ⅴ基因编码序列一致.在IPTG诱导下,重组大肠杆菌DH5α高效表达分子量约36 kDa的目的产物.结论:人膜联蛋白Ⅴ编码序列已被克隆至His融合表达载体pET-28a( )上,并在大肠杆菌DH5α中表达.     

δ-睡眠肽与GFP融合蛋白的表达和纯化

构建δ-睡眠肽(DSIP)蛋白与GFP的融合基因表达载体,高效表达和纯化GFP-DSIP融合蛋白。通过SOE-PCR拼接DSIP全长编码基因,并使得DSIP上游具有肠激酶识别位点,经双酶切定向克隆至表达载体pET-28a,构建重组载体pET-28a-DSIP,通过PCR扩增GFP全长编码基因,经双酶切定向克隆至pET-28a-DSIP,构建原核重组表达载体pET-28a-GFP-DSIP,通过双酶切和测序鉴定后,导入E.coli BL21宿主菌中,IPTG诱导表达融合蛋白,采用镍亲和层析和分子筛凝胶层析获得高纯度蛋白,SDS-PAGE分析鉴定。经测序鉴定成功构建了原核重组表达载体pET-28a-GFP-DSIP,在IPTG诱导下获得可溶性的绿色荧光蛋白与睡眠肽的融合蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化成功获得高纯度的融合蛋白。成功构建了DSIP与GFP融合基因的重组表达载体,确定了GFP-DSIP融合蛋白诱导表达的最佳条件,获得了较高纯度的融合蛋白,为进一步研究DSIP蛋白的生物学功能奠定了基础。     

重组斑马鱼 p8蛋白的原核表达及纯化

目的：在大肠杆菌中重组表达斑马鱼p8蛋白并纯化。方法：PCR扩增斑马鱼p8蛋白基因编码区,连接到带有6×His标签的原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-p8并转化大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG诱导表达;优化表达条件后用Ni^2＋柱纯化重组蛋白。结果：构建了pET-28a-p8重组质粒;目的蛋白在大肠杆菌中获得表达,亲和纯化后,SDS-PAGE显示相对分子质量为预期的12．8×10^3。结论：获得了斑马鱼p8融合蛋白,为其生物学功能研究奠定了基础。     

大鼠D-双功能蛋白基因原核表达载体的构建及表达

利用原核表达系统构建大鼠D-双功能蛋白表达载体。设计基因拼接引物,通过RT-PCR合成DBP基因cDNA序列,将酶切、纯化的DBP基因与经相同处理的表达载体pET-28 a相连接,转化感受态大肠杆菌DH5α,筛选阳性重组子。将通过酶切及序列分析鉴定阳性的重组子质粒转入感受态大肠杆菌BL21-gold表达菌中,经IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE分析目的蛋白表达情况。结果显示,成功获得了包含DBP基因的双链cDNA序列,酶切、序列分析及Western blotting证实成功构建了DBP基因的原核表达载体。通过原核表达系统,DBP蛋白以包涵体形式产生,复性后可获得高表达的目的蛋白。     

类球红菌自诱导物合成酶基因cerⅠ的克隆及其原核表达

根据类球红菌（Rhodobacter sphaeroides2.4.1）自诱导物合成酶基因cerⅠ的序列,设计并合成了1对特异性引物,在引物的5′和3′分别加入含有HindⅢ和XhoⅠ限制性酶切位点的序列,以类球红细菌Rhodobactersphaeroides基因组为模板扩增了cerⅠ基因序列。将PCR产物与pMD18-T载体连接,转化大肠杆菌DH5α。鉴定成功获得目的片段,经HindⅢ和XhoⅠ双酶切后与载体pET-28a（＋）连接,构建原核表达质粒pET-28a（＋）-cerⅠ,并将其转化宿主菌BL21（DE3）,用IPTG诱导其表达。SDS-PAGE分析表明,重组载体pET-28a（＋）-cerⅠ可成功地在大肠杆菌中表达cerⅠ蛋白。     

水稻YTB中OSVDAC5蛋白的原核表达与抗体制备

目的:克隆水稻YTB osvdac5基因,原核表达后获得纯化的OSVDAC5蛋白,制备相应的抗体.方法:采用Trizol法提取水稻总mRNA,反转录为cDNA,通过PCR扩增得到该基因与原核表达载体连接,构建重组质粒pET-30a-osvdac5,并转入大肠杆菌进行原核表达,SDS-PAGE检测表达产物.通过镍柱纯化获得的单一目的蛋白用于抗体制备,用Western Blot检测抗体的特异性.结果:克隆到原核表达载体中osvdac5基因的ORF为813 bp,编码271个氨基酸.在大肠杆菌中15℃、0.7mmol/L的IPTG浓度诱导17 h是pET-30a-osvdac5融合蛋白表达的优选条件,表达的OSVDAC5蛋白属于包涵体蛋白.镍柱纯化后的OSVDAC5为30 kD左右的单一条带.Western Blot分析表明,抗体能够与30 kD处的OSVDAC5蛋白进行特异性结合.结论:成功克隆了水稻YTB osvdac5基因,原核表达蛋白OSVDAC5制备的多免隆抗体具有一定特异性,能与免疫抗原结合,这为进一步研究OSVDAC5蛋白在植物不同生长发育时期中的表达模式奠定了基础.