甜菜夜蛾cDNA文库的构建

以甜菜夜蛾Spodoptera exigua(Hübner)幼虫为材料建立了cDNA表达文库,经检测文库的初始滴度为1.1×105pfu/mL,重组率为97%,扩增后文库的滴度为5.4×107pfu/mL。用设计的2对引物筛选该文库,得到468 bp的1个片段,分析后证实是几丁质合成酶基因I保守区域的1个片段。该cDNA文库为进一步筛选甜菜夜蛾功能基因奠定了基础。     

盐生植物海马齿盐胁迫全长cDNA文库的构建与分析

为了研究盐生植物耐盐基因表达调控,本实验以海水浇灌的海马齿植株为供试材料,构建了盐胁迫下的全长cDNA文库。构建方法如下:采用改良的CTAB法提取总RNA,SMART法反转录合成cDNA,LD-PCR方法合成双链cDNA。LD-PCR产物经蛋白酶K消化和SfiⅠ酶切后,经CHROMA SPIN+TE-1000分离柱子除去小片段DNA后,回收0.5kb以上的片段,按照适当的比例连接λTripIEX2载体。连接产物利用MaxPlaxTMLambda Packaging Extracts进行体外包装,得到海马齿初级cDNA文库。初始文库的独立克隆数为2.4×106pfu,初级文库滴度大于4.80×106pfu/mL,重组率为93.75%,插入片段为0.5～5kb,扩增文库的滴度为1.21×109pfu/mL,所得文库质量较高。本研究表明该cDNA文库适合于盐生植物海马齿相关基因的克隆和分析。     

葱蝇冬滞育蛹的全长cDNA文库的构建

葱蝇Delia antiqua(Meigen)具有冬滞育的特性且与黑腹果蝇Drosophila melanogaster近缘。该研究目的在于构建葱蝇冬滞育蛹的全长cDNA文库,为进一步的冬滞育专化基因筛选、克隆、和表达分析奠定基础。利用RNAiso试剂盒提取葱蝇冬滞育蛹的总RNA,采用SMART技术合成全长cDNA,经SfiⅠ酶切消化后,将cDNA克隆到质粒载体pDNR-LIB。经鉴定,原始文库的滴度为2.4×107cfu/mL。随机挑取15个克隆,经PCR快速鉴定,插入片段大小在0.5～3kb之间,平均大小在1kb左右,重组率达100%。结果表明该研究获得高质量的葱蝇冬滞育蛹cDNA文库。     

莱芜猪肝脏组织全长cDNA文库的构建和鉴定

目的:构建莱芜猪肝脏组织全长cDNA文库,以便研究与莱芜猪优良性状相关的基因。方法:采用改良的异硫氰酸酸胍一步法制备总RNA;利用SMART技术,以PrimeScript反转录酶逆转录合成第一链cDNA,通过LD-PCR扩增获得cDNA双链;经蛋白酶K消化和CHROMA SPIN-400柱分级分离后,收集500 bp以上的cDNA片段,并与pMD18-T载体连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,建成原始文库;随机挑取单菌落,用HindⅢ和EcoRⅠ进行双酶切鉴定重组子插入片段大小。结果:经鉴定,原始文库的滴度为2.8×105 cfu/mL,重组率约为98%,插入片段大小为0.5～2 kb,平均插入片段长度大于1 kb。结论:建立的cDNA文库质量良好,可以用于目的基因的筛选。     

人胎儿骨膜全长cDNA文库的构建及测序

目的构建人胎儿的骨膜组织的全长cDNA文库,了解该组织表达谱的特征。方法以胎儿胫骨骨膜为材料,运用末端模板转换技术（SMART）构建cDNA文库,测定库容量并应用菌落PCR的方法确定平均插入片段长度,随后大规模测序并进行生物信息学处理分析。结果所构建的cDNA文库的库容量为5．2×10^6,平均插入片段的长度为1．2kb。随机测序了25000余个克隆的序列,拼接后为5230个聚类群（contigs）和4714个独立EST（singleton）,Blast比对分析得到骨膜基因表达谱的概况,发现了23个候选的新基因。结论构建的骨膜组织的cDNA文库质量满足后续工作的需要,骨膜组织基因表达谱及一些新基因的获得为今后寻找骨膜组织特异性的基因从而研究骨相关疾病的发病机制、发现具有药物开发靶点的功能基因奠定了基础。     

莱芜猪心脏cDNA文库的构建与鉴定

以莱芜猪心脏为供试材料,采用改进的异硫氰酸胍法提取心脏总RNA。通过SMART技术反转录合成全长cD-NA,经LD-PCR扩增后与pMD18-T载体连接并转化细菌DH5α,测定滴度和重组率,构建成莱芜猪心脏全长cDNA文库。经初步检测,原始文库的滴度为1.8×105CFU/mL,重组率约为94.4%。从原始文库随机挑取13个单菌落过夜培养,提取质粒,经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切,凝胶电泳显示插入片段大小在0.3-2.0kb之间。     

甜菜单体附加系M14花蕾cDNA文库的构建

为了克隆甜菜单体附加系M14无融合生殖相关基因 ,采用cDNA文库快速构建法制备了M14花蕾cDNA文库。根据甜菜单体附加系M14无融合生殖的细胞胚胎学研究结果 ,提取甜菜M14花蕾三个关键时期的RNA ,分离纯化mRNA ,以Oligo(dT)为引物 ,在逆转录酶的作用下 ,合成第一链cDNA ,进而合成第二链cDNA。含有EcoRⅠ和NotⅠ粘性末端的双链cDNA在T4DNA连接酶的作用下与载体λZAP臂相连 ,并对连接产物进行体外包装 ,得到噬菌体颗粒 ,即甜菜单体附加系M14花蕾cDNA文库。经大肠杆菌寄主菌株XL1-blueMRF’平板检测 ,三个文库滴度分别为 2 .8× 10 5pfu·mL-1、1.6× 10 5pfu·mL-1和 3.5× 10 5pfu·mL-1,克隆重组率为 83%、78%和 81%。cDNA文库可直接用于目的基因的筛选     

用两步PCR法克隆全长cDNA

采用两步 PCR法成功地克隆了一个全长的 c DNA.首先 ,用差式分析法克隆得到差别表达的 c DNA片段 ,再分别用这些片段内部的特异序列及 c DNA两端不同接头的序列为引物进行第一步 PCR扩增 ,得到差别 c DNA片段的上游和下游序列 .然后 ,根据第一步 PCR扩增得到的上游和下游序列设计基因特异的引物进行第二步 PCR,从而得到全长的 c DNA.     

中国对虾蜕皮抑制激素全长cDNA的克隆及序列分析

对虾的蜕皮活动由蜕皮抑制激素和蜕皮激素调控,蜕皮抑制激素是甲壳动物CHH家族神经肽的成员之一,通过抑制Y器官蜕皮激素的合成而调节蜕皮,以中国对虾（Fennropenaeus chinensis）眼柄总RNA为材料,采用cDNA末端快速扩增（RACE）方法。首次得到蜕皮抑制激素的全长cDNA（GenBank登录号：AF469187）。该全长cDNA大小为697bp,是由320bp的3′RACE产物和468bp的5′RACE产物拼接而成,Blast搜索结果显示,该全长cDNA与甲壳动物的MIH基因序列具有较高的相似性,用Clustal X进行多序列比较结果表明,由该全长cDNA推导的氨基酸序列与对虾类的MIH的氨基酸序列同源性最高,其中与日本对虾,斑节对虾,刀额新对虾MIH的同源性分别为95.1%,83.1%,79.1%,根据以上数据,推断该697bp的全长cDNA为编码中国对虾MIH前体的cDNA。进一步序列分析表明,编码中国对虾MIH前体cDNA包括312bp的开放阅读框,81bp的3′UTR和302bp的5′UTR;编码103个氨基酸的MIH前体分子包括信号肽和成熟肽,信号肽由28个氨基酸组成,成熟肽由75个氨基酸组成,成熟肽中6个半胱氨酸非常保守。     

运用重叠延伸PCR技术构建在甘丙肽全长cDNA嵌入第二内含子的重构分子

构建嵌入第二内含子的甘丙肽(Galanin,GAL)全长基因组cDNA的重构分子。通过RT-PCR扩增出cDNA编区的序列,分别从基因组中扩增出cDNA的5′和3′端部分非编码序列;使用重叠延伸PCR(overlap extention PCR,OE-PCR)方法将三个片段重叠获得全长cDNA序列;再将全长cDNA从第三外显子第15个碱基处分成两部分,分开的cDNA前半部分和后半部分以及第二内含子进行重叠延伸获得重构分子,含有第二内含子的甘丙肽(GAL)全长基因组cDNA;将重构分子连入pMDI9-Tsimple载体。电泳分析观察到清晰的重构分子片段;测序显示重构分子由所设计的序列组成,第二内含子插入的位置准确,且无移码。使用重叠延伸PCR能够成功在cDNA中插入内含子获得一段重构基因。     

中国野葡萄新基因cDNA全长的克隆及序列分析

根据对中国野生葡萄华东葡萄株系白河-35-1在白粉病诱导下构建的cDNA文库中获得的1条EST序列设计特异引物,以总RNA逆转录产物为模板,进行SMART-RACE扩增。结合生物信息学方法对所获的序列进行开放阅读框、序列同源性分析,并预测了蛋白质的理化性质、信号肽、酶与非酶分析、亚细胞定位以及蛋白质二级结构。结果表明,获得的中国野生葡萄新基因的全长序列为854 bp,其开放阅读框为585 bp,5′非编码区为107 bp,3′非编码区为162 bp;同源性比对表明该新基因推导的氨基酸序列与拟南芥RNA结合蛋白和水稻推定的半乳糖基转移酶的同源性分别为55%和63%,第8~82位氨基酸序列与RNA识别基序相类似,是一个典型的结构功能域;推导该基因表达产物为相对分子质量为21 801.27、等电点为6.86的不稳定蛋白,定位于细胞核,不包含信号肽,二级结构主要是无规则卷曲。     

菠萝果实cDNA文库的构建

以菠萝幼果为研究材料,采用Creator^TMSMART^TM cDNA Library Construction Kit技术构建菠萝幼果cDNA文库,其文库的库容量为1．01×10^6,重组率为92％,PCR检测表明大多数插入片段均大于1000bp。     

海南黄牛HSF1 cDNA全长的克隆与序列分析

目的：根据人、小鼠HSF1cDNA保守区序列设计引物,通过PCR方法扩增海南黄牛HSF1cDNA,并进行序列分析。方法：利用RT-PCR、半巢式PCR以及3＇-RACE技术分段扩增得到了海南黄牛HSF1cDNA序列,测序正确后进行拼接。用DNAMAN 生物信息学软件分析海南黄牛HSF1 cDNA与赫里福德牛、人、小鼠同源性和海南黄牛HSF1蛋白的氨基酸组成、等电点、亲/疏水区等蛋白质性质,并根据各种动物HSF1蛋白绘制进化树。结果：（1）海南黄牛的HSF1 cDNA序列全长为1 993bp,包括150bp的5＇非翻译区,1 578bp的开放阅读框以及264bp（不含poly（A）尾）的3＇非翻译区,编码524个氨基酸,分子量为56.42 kD,等电点（pI）为 4.79。（2）海南黄牛的HSF1 cDNA与赫里福德牛、小鼠和人HSF1 cDNA的同源性分别为98.99 %、81.78 %、87.82 %,相应编码蛋白氨基酸序列的同源性分别为98.86 %、83.84 %、89.06 %,其中N-末端和C-末端高度保守,而中间区域存在缺失或替换。（3）根据氨基酸序列构建不同动物HSF1蛋白的进化树,与采用经典遗传分类法构建的进化树基本一致。结论：首次克隆了海南黄牛 HSF1 cDNA全长,分析表明：海南黄牛HSF1蛋白是亲水性蛋白,在8种动物中,其同源性大于73 %,高度保守。海南黄牛与赫里福德牛HSF1蛋白同源性高达98.86 %,在三聚体化区域、转录调节域和激活域存在6个位点的单氨基酸突变,这些发现为进一步揭示海南黄牛抗热性状形成的分子机制提供了重要依据。