Real-time PCR检测黄牛、牦牛、犏牛睾丸组织中Boule、Dazl基因mRNA表达

旨在探讨DAZ基因家族Dazl和Boule基因与犏牛雄性不育的关系.采用实时荧光定量PCR技术检测黄牛、牦牛和犏牛睾丸组织中DAZ基因家族Boule和Dazl基因mRNA表达并进行分析.结果表明,Boule和Dazl熔解曲线扩增产物呈现单特异峰,具有较高的灵敏度和特异性;标准曲线显示Ct值与重组质粒浓度间线性关系良好,相关系数均大于0.999;mRNA表达分析显示,3种牛中Dazl基因在犏牛睾丸组织中表达量最低,其中黄牛与牦牛、黄牛与犏牛差异显著(P＜0.05),犏牛与牦牛差异不显著(P＞0.05);Boule基因在3种牛睾丸组织中的表达量显示,黄牛与牦牛差异不显著(P＞0.05),黄牛、牦牛与犏牛差异显著(P＜0.05).结果提示,Dazl和Boule基因可作为研究犏牛雄性不育的候选基因.     

黄牛、牦牛和犏牛睾丸组织中Cdc2、Cdc25A基因mRNA表达水平

黄牛和牦牛远缘杂交后代犏牛雄性不育是牦牛杂交改良中的一大难题。Cdc2和Cdc25A是减数分裂的两个关键基因, 其表达水平的下降将使精子发生不能正常进行, 导致雄性不育。为了探讨Cdc2、Cdc25A基因mRNA表达水平与犏牛雄性不育的关系, 文章采用荧光定量PCR技术对Cdc2和Cdc25A基因的组织表达特征以及在黄牛、牦牛和犏牛睾丸组织中的表达水平进行了分析。结果表明: Cdc2和Cdc25A基因在牦牛各种组织中广泛表达, 说明Cdc2和Cdc25A基因在各种组织细胞分裂和细胞周期运行中均发挥作用; 黄牛和牦牛睾丸组织中Cdc2、Cdc25A基因表达水平均显著高于犏牛(P<0.05), 说明睾丸组织中Cdc2和Cdc25A基因的低表达可能与犏牛雄性不育相关。     

牦牛和雄性不育犏牛睾丸PPP2CA、PME-1基因mRNA水平的比较

蛋白磷酸酶2A(PP2A)参与细胞中蛋白质的可逆磷酸化作用,在磷酸化信号通路调控方面具有重要功能,其活性受蛋白磷酸甲酯酶-1(PME-1)和其他因素的调控。为阐明牦牛杂交雄性不育的分子机制,本研究从牦牛睾丸中克隆了PP2A催化亚基α基因(PPP2CA)和PME-1基因c DNA序列,编码区长度分别为930 bp和1 143 bp,编码的氨基酸序列保守;定量PCR检测显示,犏牛(n=7)睾丸中PPP2CA与PME-1基因的m RNA水平均极显著低于牦牛(n=13,P0.01)。根据本研究结果,推测犏牛睾丸中这2个基因的显著下调可能会影响一些重要信号通路,且与犏牛雄性不育有关。     

牦牛和雄性不育犏牛睾丸ERK1、ERK2、P38基因mRNA水平的比较

MAPK信号通路对哺乳动物的精子发生与凋亡有重要的调节作用,被认为是精子发生的重要决定因素之一。本研究通过比较MAPK信号通路中ERK1、ERK2、P38基因在牦牛及其杂交后代犏牛睾丸组织中的相对表达量,探索犏牛雄性不育的分子机制。实验从成年雄性牦牛(n=10)和犏牛(n=7)的睾丸组织中提取总RNA,采用实时荧光定量PCR技术检测牦牛和犏牛睾丸组织中ERK1、ERK2、P38基因mRNA水平。结果表明:牦牛睾丸中ERK1、ERK2基因的表达量极显著高于犏牛(P0.01),P38基因在牦牛和犏牛睾丸中均有表达,但差异无统计学意义。提示ERK1、ERK2基因作为MAPK信号通路的重要成员,可能与犏牛睾丸精子发生障碍有一定关联。     

PCR-膜芯片技术在牦牛及犏牛肉制品的真假鉴定中的应用

旨在利用PCR-膜芯片技术快速高效的鉴定牦牛及犏牛肉制品的真假。采集样品(猪、山羊、黄牛、水牛、牦牛、鸡、鸭、兔、狗、真犏牛、假犏牛肉样各8个,19个肉干制品样品),提取并纯化DNA,利用11对特异性引物进行多重PCR,将扩增产物与含有12个探针的膜芯片反向点杂交,测试膜芯片的准确度及灵敏度,并鉴定市场上销售的牦牛肉制品真假。结果表明,膜芯片准确度高,特异性强,无交叉反应,灵敏度能达到0.1 ng,检测灵敏度高。通过鉴定市场上销售的假牦牛肉干制品几乎都以黄牛和水牛肉为原料制作。应用PCR-膜芯片技术可快速准确的鉴定出牦牛肉制品的真假,有利于打击假冒产品,维护市场平衡。     

人Boule基因启动子区结合蛋白的生物信息学分析

目的：对精子发生RNA结合蛋白Boule基因启动子区结合蛋白进行生物信息学分析。方法：从基因参考序列数据库获取Boule基因启动子区序列,使用TFSEARCH程序对启动子序列中的转录因子结合位点进行预测。结果：成功获得长度为2kb的人Boule基因启动子区序列。该启动子区Thresholdscore〉90的共有60个转录因子结合位点,涉及sox家族、GATA结合蛋白家族、热休克因子家族、锌指蛋白Kruppel家族、POU家族、runt家族、同源异型框基因家族、TALE类同源结构蛋白家族、转录因子螺旋环螺旋家族、IKAROS家族、FOX家族11个家族的转录因子和3个TATAbox。结论：Boule基因表达的调控是在一定时间或空间上、一种或多种调节蛋白作用的复杂过程。调控Boule基因表达的转录因子绝大部分与胚胎发育、性别决定、个体生长密切相关。     

牦牛和黄牛的睾丸形态及其血管构筑特征

本实验旨在研究牦牛（Bos grunniens）和黄牛（B. taurus）的睾丸形态及其血管构筑和动脉管径特征,为牦牛睾丸在高原环境的生理适应性提供依据。从14头屠宰后的成年牦牛体内采集睾丸28枚,从9头成年黄牛体内采集睾丸18枚,测定其形态指标,利用血管铸型技术制作动静脉构筑标本,研究睾丸血管解剖学及主要动脉管径的特征。结果显示,牦牛和黄牛的睾丸、附睾的形态特征及动脉管径有差异,牦牛大部分睾丸动脉及其分支的管径与睾丸重的相对值极显著地高于黄牛（P < 0.01）,牦牛睾丸的主要动脉构筑特征与黄牛的相同,但其大的集合静脉数量较少,小静脉呈“编织袋”状紧密排布。研究认为,牦牛睾丸的血管解剖特征可为睾丸提供更为充足的血液,其相对发达的动脉血管和睾丸静脉“编织袋”状分布特点有利于睾丸的温度调节及精子成熟,可能是牦牛生殖器官适应高海拔环境的生理特征之一。     

人类Boule基因在减数分裂时期的生物信息学分析

Boule（boll）基因是DAZ基因家族的一个新成员,含有一个RNA结合域和一个DAZ重复域,是人类精子发生减数分裂过程中主要调控因子。为了研究Boule基因结构及其功能,利用生物信,息学方法对Boule蛋白相关结构、相互作用蛋白及其功能进行分析和预测。结果表明,Boule蛋白存在明显的亲水区、疏水区和卷曲螺旋;不存在信号肽、跨膜结构;主要分布在细胞质、细胞核、线粒体中;二级结构以α-螺旋、延伸链、无规则卷曲所组成,并含有非正规二级结构区;作用蛋白主要为CDC25A蛋白．功能域主要包含RRM保守域。Boule蛋白在精子发生过程中第一次减数分裂的生殖细胞中特异性表达,而在减数分裂完全阻滞的睾丸组织中不表达。因此,Boule蛋白功能可能与雄性生殖细胞减数分裂相关基因表达有关。     

牦牛TGF-β2基因片段的克隆测序及系统进化分析

克隆测序了牦牛的TGF-β2基因,并进行了Blastn比较分析。结果表明,牦牛TGF-β2基因片段长为559bp,与普通牛、人、黑猩猩、小鼠的相应片段的同源性分别达98%、95%、94%、93%。在5′端调控区域没有类似TATA盒元件,推测TGF-β2基因在脾脏、肾脏组织细胞中表达量不是很高。由于TGF-β对细胞的生长、分化和免疫功能都有重要的调节作用,牦牛TGF-β2基因研究对高原畜牧业发展提供了科学资料。     

麦洼牦牛和九龙牦牛FSHβ基因的PCR-SSCP分析

运用一对特异性引物对麦洼牦牛、九龙牦牛的FSHβ基因的5’端侧翼区进行了扩增,应用PCR-SSCP方法对其进行了多态性分析。结果表明:在麦洼牦牛的FSHβ基因的5’端侧翼区有AA型、AB型和BB型三种基因型,九龙牦牛的FSHβ基因的5’端侧翼区只检测到了AA型、AB型两种基因型。在两种牦牛品系中,AA基因型频率最高,A等位基因频率均明显高于B等位基因频率。麦洼牦牛和九龙牦牛群体中多态信息含量分别为0.3431、0.1411,麦洼牦牛多态性能高,遗传变异大。     

牦牛睾丸组织能量代谢相关酶活力的分析

为了解牦牛Bos grunniens睾丸组织在性成熟前后与能量代谢相关的几种酶活力变化,对九龙牦牛睾丸组织中参与糖酵解、三羧酸循环、脂肪酸β-氧化和线粒体呼吸链中几种酶活力做了测定.结果显示,性未成熟的九龙牦牛睾丸组织中β-羟脂酰CoA脱氢酶(HAD)活力显著高于成年九龙牦牛(P<0.01),而乳酸脱氢酶(LDH)、异柠檬酸脱氢酶(ICDH)、细胞色素氧化酶(COX)活力未见显著差异,提示脂肪酸β-氧化在性成熟前的牦牛睾丸组织能量代谢中可能发挥重要作用.     

牦牛CAV-3基因的克隆及其在牦牛和黄牛组织的表达分析

旨在对牦牛CAV-3基因进行克隆、生物信息学分析,并对其在牦牛组织中的表达规律进行初步研究。根据Gen Bank数据库中已知的黄牛CAV-3基因的m RNA序列并设计特异性引物,应用RT-PCR技术克隆牦牛CAV-3基因的编码区。运用生物信息学方法,分析并预测牦牛Caveolin-3蛋白的理化性质、疏水性、蛋白结构域以及蛋白质二级结构。通过半定量PCR技术检测CAV-3基因m RNA在牦牛和黄牛各组织中的表达;利用实时荧光定量PCR技术检测牦牛和黄牛肌肉组织中CAV-3基因m RNA表达水平。牦牛CAV-3的编码区全长631 bp,共编码151个氨基酸。CAV-3在牦牛肺、脾脏、肾脏、肝脏、卵巢组织中均不表达,仅在心脏和肌肉组织中表达,且在心脏组织的表达水平高于肌肉组织,CAV-3基因在黄牛各组织中的表达结果与牦牛一致。CAV-3基因在牦牛肌肉中的表达低于黄牛肌肉组织,但差异不显著(P0.05)。     

牦牛与其他物种ZFX/ZFY基因片段间的进化关系

利用PCR扩增、克隆和序列分析法对牦牛ZFX/ZFY基因第11外显子部分片段进行了研究,并同来自于NCBI GenBank中人、猩猩、普通牛等9个物种的ZFX/ZFY基因核苷酸及其氨基酸序列进行了进化分析.结果表明,牦牛ZFX、ZFY基因间核苷酸序列同源性为94.1%,显示同一物种同源基因ZFX/ZFY间存在变异;比较的10个物种间ZFX基因核苷酸序列同源性为87.7%、ZFY基因为81.7%,相应ZFX、ZFY氨基酸同源性分别为96.6%、91.0%,ZFY基因的变异性大于ZFX基因,显示X染色体与Y染色体可能是独立进化.     

牦牛Myf-5基因的克隆测序及其系统进化研究

本研究对牦牛(九龙牦牛)的生肌决定因子5(Myf-5)基因进行了T-A克隆测序和分析,并与多个物种的相应基因编码区核苷酸序列、氨基酸序列进行了比对分析,构建了物种间的系统进化树.结果 表明:①牦牛的Myf-5基因大小为3313 bp,由3个外显子和2个内含子组成,与普通牛等9个物种比较,在基因大小上有较大的差异,但外显子和内含子的组成一致.②牦牛、大额牛、瘤牛、水牛、普通牛、人、恒河猴、黑猩猩、狗、家鼠、软体贝壳、鸡、斑马鱼等物种间Myf-5基因编码区的核苷酸序列同源性较高,其中,牦牛、大额牛、瘤牛、水牛、普通牛间的同源性最高,达98.4%以上,说明Myf-5基因编码区核苷酸序列在动物物种间具有较高的保守性.③牦牛、大额牛、瘤牛、水牛、普通牛、黑猩猩、恒河猴、人、狗、家鼠、软体贝壳、鸡、斑马鱼等物种间Myf-5基因编码蛋白的氨基酸序列具有较高的同源性,保守性强,这一结果与编码区核苷酸序列的比对结果基本一致.④根据核苷酸序列,用NJ法构建的牦牛、大额牛、瘤牛、水牛、普通牛、人、恒河猴、黑猩猩、狗、家鼠、软体贝壳、鸡、斑马鱼等13个物种的分子系统进化树显示:牦牛、普通牛、瘤牛、水牛和大额牛在较近的亲缘关系下聚为一大类,人、黑猩猩和恒河猴聚为另一大类,然后这两类再和其他物种相聚.这一分类结果与各物种的动物学分类结果和血液蛋白、mtDNA水平上的聚类结果基本一致,支持牦牛、普通牛和瘤牛3个物种间不应该是属间或亚属间关系,而应是同一属下的不同种,将牦牛、普通牛和瘤牛划分在同一个属--牛属(Bos),而将水牛划分在另一个单独的属的观点.同时也显示该基因序列适合用于动物学分类.     

成年牦牛与双性牦牛睾丸蛋白质双向电泳的比较研究

为了比较牦牛和双性牦牛睾丸组织中蛋白质的差异表达,以探索双性牦牛生殖障碍的机理。提取牦牛睾丸(n=4)和1头双性牦牛睾丸总蛋白质,采用双向电泳分离后,对差异表达蛋白质点进行质谱鉴定。实验获得了分辨率高、重复性好的牦牛与双性牦牛睾丸组织蛋白质的双向电泳图谱,2倍及以上差异表达的蛋白质24个,其中22个蛋白质经质谱分析和数据库搜索后得到鉴定。有6种蛋白质属于分子伴侣,在双性牦牛睾丸组织中表达量显著下降,推测与双性牦牛精子发生障碍有关。     

Global Metabolic Reconstruction and Metabolic Gene Evolution in the Cattle Genome

The sequence of cattle genome provided a valuable opportunity to systematically link genetic and metabolic traits of cattle. The objectives of this study were 1) to reconstruct genome-scale cattle-specific metabolic pathways based on the most recent and updated cattle genome build and 2) to identify duplicated metabolic genes in the cattle genome for better understanding of metabolic adaptations in cattle. A bioinformatic pipeline of an organism for amalgamating genomic annotations from multiple sources was updated. Using this, an amalgamated cattle genome database based on UMD_3.1, was created. The amalgamated cattle genome database is composed of a total of 33,292 genes: 19,123 consensus genes between NCBI and Ensembl databases, 8,410 and 5,493 genes only found in NCBI or Ensembl, respectively, and 266 genes from NCBI scaffolds. A metabolic reconstruction of the cattle genome and cattle pathway genome database (PGDB) was also developed using Pathway Tools, followed by an intensive manual curation. The manual curation filled or revised 68 pathway holes, deleted 36 metabolic pathways, and added 23 metabolic pathways. Consequently, the curated cattle PGDB contains 304 metabolic pathways, 2,460 reactions including 2,371 enzymatic reactions, and 4,012 enzymes. Furthermore, this study identified eight duplicated genes in 12 metabolic pathways in the cattle genome compared to human and mouse. Some of these duplicated genes are related with specific hormone biosynthesis and detoxifications. The updated genome-scale metabolic reconstruction is a useful tool for understanding biology and metabolic characteristics in cattle. There has been significant improvements in the quality of cattle genome annotations and the MetaCyc database. The duplicated metabolic genes in the cattle genome compared to human and mouse implies evolutionary changes in the cattle genome and provides a useful information for further research on understanding metabolic adaptations of cattle.     

牦牛MC1R基因的克隆测序及其分析研究

以麦洼牦牛、斯布牦牛、天祝牦牛和九龙牦牛为研究对象,对黑色素皮质素受体1(Melanocortin receptor I,MCIR)基因编码区进行了克隆测序及分析.结果表明,牦牛的MC1R基因编码区全长954 bp,编码317个氨基酸:4个牦牛品种间及与普通牛间在MC1R基因的编码区内共有13个碱基差异,无碱基的插入和缺失现象,编码蛋白共有9个氨基酸差异.MC1R蛋白为亲水性蛋白,无信号肽,有糖基化位点和7个跨膜区.系统进化分析显示,麦洼牦牛与斯布牦牛的MC1R基因相似性最近.本研究结果时今后开展MC1R基因与牦牛毛色性状的相关性分析以及牦牛的毛色遗传机理、基因定位、基因表达调控等研究具有重要的意义.     

牦牛HORMAD1基因的克隆及生物信息学分析

利用分子克隆技术获得了牦牛HORMAD1基因编码区序列,并采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、疏水性、信号肽、二级结构等方面进行了预测和分析.结果表明,牦牛HORMAD1基因包含一个长度为1 182 bp的开放阅读框,编码393个氨基酸;其编码蛋白属于亲水性蛋白,无明显的信号肽,含有很多个磷酸化位点.二级结构主要以无规则卷曲和α螺旋为主.HORMAD1基因编码产物氨基酸邻接系统树表明,牦牛HORMAD1与黄牛、马和猪等物种的HORMAD1氨基酸遗传距离较近,具有高度相似性.     

牦牛miR-378前体克隆及组织表达分析

旨在克隆牦牛miR-378的前体序列,阐明其组织表达规律,结合bta-miR-378靶基因的生物信息学预测和分析,探讨miR-378在牦牛生长发育过程中的调控功能。采用PCR方法成功克隆类乌齐牦牛miR-378前体序列,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-378-3p在各组织中的表达模式,结合生物信息学软件TargetScan、DAVID以及数据库NCBI、miRbase等对miR-378进行保守性分析、靶基因预测及其生物学功能分析。结果表明,miR-378在各物种间高度保守,且miR-378-3p在各组织中广泛表达,其中在臀大肌中表达水平最高,显著高于其他组织(P<0.01),在臀脂中的表达高于卵巢、大脑、乳腺和肝脏。获得的272个靶基因主要参与细胞分化、细胞发育、大分子代谢等多个生物学过程,涉及孕酮介导的卵母细胞成熟、促性腺激素释放激素(GnRH)信号通路等,由此推测,miR-378可能在卵泡发育、卵母细胞成熟过程中起关键作用,进而影响母牦牛的繁殖性能。