红麻线粒体中细胞质雄性不育候选基因cox3的克隆与分析

目的:比较红麻不育系和保持系线粒体基因组的差异,并克隆红麻细胞质雄性不育候选基因cox3,揭示红麻细胞质雄性不育的分子机理。方法:用Southern印迹方法研究红麻保持系和不育系线粒体基因组的差异;用同源克隆的方法克隆cox3基因。结果:不育系和保持系基因组存在较大差异;在保持系和不育系中克隆了cox3基因,其基因CDS区完全一致,基因长度为798 bp,GenBank序列号为HM535784;cox3基因与其他物种的cox3基因的同源性大于95.9%。结论:cox3基因的组织形式在不育系和保持系中存在差异,研究结果为揭示红麻细胞质雄性不育的机理提供了一定的依据。     

红麻MYB21基因的克隆、表达及载体构建

克隆红麻不育系和保持系的MYB21基因,分析MYB21基因在红麻不育系和保持系各器官的表达量,并构建过表达载体和RNAi载体,旨在为进一步研究该基因在红麻中的功能奠定基础。以同源克隆的方法克隆MYB21基因;用实时荧光定量的方法分析MYB21基因在红麻不育系和保持系不同组织器官的表达模式;根据酶切-连接的方法,构建过表达载体和RNAi载体。结果显示,红麻MYB21基因在不育系和保持中的基因序列没有差异,其c DNA全长序列为922 bp,包含843 bp的开放阅读框,DNA全长序列为1 108 bp,包含3个外显子和2个内含子(NCBI序列登录号为KT898146);MYB21基因主要在花药中表达,在不育系和保持系花药之间表达量呈极显著差异;成功构建MYB21过表达载体和RNAi载体。成功克隆MYB21基因的全长序列;实时荧光定量结果表明MYB21基因主要在花药中进行表达;构建的植物过表达载体PBI121-MYB21和RNAi载体p ART27-PK-R1-F2可用于该基因的功能研究。     

红麻野败型CMS胞质SNP分子标签的发掘

利用同源克隆的方法,克隆了红麻野败型CMS胞质SRAP标记位点Me14上游的侧翼序列,并采用RT-PCR方法研究该位点的表达。结果表明:(1)红麻不育系P3A和保持系P3B的mtDNA在Me14结合位点处存在1个G/A SNP位点;HpaⅡ内切酶可特异性酶切以保持系P3B扩增获得的E1纯化片段,而不育系P3A的E1纯化片段不能被酶切。(2)对红麻的9对不育系/保持系、5个恢复系和F1杂交种在该SNP位点的分析发现,以保持系和恢复系总DNA为模板扩增获得的E1纯化片段均可为HpaⅡ内切酶特异性酶切,而不育系和F1杂交种的E1纯化片段不能被酶切。(3)RT-PCR结果表明,E1片段对应基因在不育系P3A和保持系P3B中的时空表达模式无差异,在GenBank中也没有与E1相匹配的蛋白序列。研究表明,该研究发掘的红麻CMS胞质SNP标记位点处,不育系的mtDNA存在点突变,该标签并非具有嵌合阅读框的不育基因。     

野败型水稻保持系线粒体特异DNA片段的克隆及序列分析

利用RAPD技术,从水稻野败型细胞质雄性不育系珍汕97A的保持系珍汕97B中得到一个特异的扩增片段PWP-13。该片段全长808bp,1-142区段为正常的cob基因片段;143-372、406-707区段与一个报告的嵌合cob基因的同源性分别为98％、100％,但由于碱基缺失,所推测的氨基酸序列差异较大;373-405区段为PWP-13所特有的重复序列,708-808区段为未知序列。序列内含有3组长度分别为9、31、27bp的小重复序列。     

不结球白菜Pol胞质雄性不育系和保持系蕾期基因的差异表达

以不结球白菜Pol胞质雄性不育系及其保持系为材料,利用cDNA-AFLP技术分析它们蕾期基因的差异表达,以获得与胞质不育相关的差异表达基因.结果共得到7条在GenBank中有同源性的差异表达片段,5条存在于不育系中,2条存在于保持系中.序列分析发现,在不育系花蕾克隆到的5条差异片段,分别与芥菜胞质雄性不育系线粒体orf108和atpA、拟南芥焦磷酸酶基因、拟南芥的锚定蛋白家族基因、甘蓝型油菜中的水胁迫蛋白、大白菜叶绿体基因片段有较高同源性;在保持系花蕾克隆到的2条差异片段分别与拟南芥未知蛋白基因有较高同源性.采用实时定量PCR验证其中5条差异片段在不育系和保持系花蕾中的表达水平,结果表明bcA19T15、bcA7T9在不育系中特异表达,bcA6T9、bcA19T8、bcA12T19在不育中表达比保持系中略强.     

基因加倍对棉花线粒体atpA基因RNA编辑率的影响

植物线粒体基因组中存在RNA编辑（C-U）现象,且有完全编辑和部分编辑之分。棉花细胞质雄性不育（cytoplasmic male sterile,CMS）系和保持系线粒体基因组中atpA基因各有两个拷贝,存在基因加倍现象,但atpA基因加倍对其RNA编辑率的影响尚不清楚。通过Southern blot、染色体步移技术确定出该基因每个拷贝具体的DNA序列,发现一个拷贝是完整的,一个拷贝是截短的。用RT-PCR、环化RT-PCR方法扩增出每个拷贝相应的cDNA,结果表明：棉花CMS系和保持系atpA基因完整拷贝和截短型拷贝都转录。完整拷贝、截短型拷贝中分别存在6、4个RNA编辑位点。完整拷贝6个RNA编辑位点在保持系中的编辑率都是100%;在CMS系中编辑率分别是100%、85%、100%、92%、100%、100%。截短型拷贝4个位点在保持系中的编辑率分别是55%、37%、55%、27%;在CMS系中编辑率分别是100%、90%、100%、100%。据此推测截短型拷贝在保持系中承受选择压较小,很可能已失去功能;而在CMS系中仍承受较大选择压,很可能具有新的功能。     

不结球白菜细胞质雄性不育相关基因的克隆及表达

从不结球白菜CMS新种质中分离得到的一个cDNA-AFLP差异片段,采用RT-PCR和RACE技术成功克隆了一个α-微管基因的cDNA全长序列,命名为TUBA2(DDBJ登录号为AB445012)。序列分析结果表明,该基因全长1 709 bp,最大开放阅读框为1 353 bp,编码450个氨基酸序列,与已公布的α-微管基因有较高的同源性。系统进化树分析发现,该基因在不同植物间具有高度保守性。Southern杂交表明TUBA2属于不结球白菜多基因家族的一个单一克隆基因。实时定量RT-PCR检测表明,该基因在不育系中的表达量显著低于保持系,同时在不同组织和细胞减数分裂不同时期该基因的表达量也存在明显差异。     

箭筈豌豆两个肌动蛋白基因片段的克隆及序列分析

通过同源克隆获得了箭筈豌豆两个不同的Actin基因片段,为研究该箭筈豌豆其它基因的表达状况提供了内标参照。根据近缘物种Actin基因序列设计一对引物,通过RT-PCR技术分别从叶片和果实材料中克隆获得了两条不同的Actin基因片段。生物信息学分析表明,叶片中克隆的片段长度604 bp,编码201个氨基酸;果实中克隆的片段长度677 bp,编码225个氨基酸。两条序列与其它物种Actin基因的碱基序列相似度高于80%,氨基酸序列相似度高于93%。将来自叶片和果实的两条序列分别命名为VsACT7和VsACT11,并在GenBank注册,登录号分别为HM004434和GU946218。     

牦牛与其他物种ZFX/ZFY基因片段间的进化关系

利用PCR扩增、克隆和序列分析法对牦牛ZFX/ZFY基因第11外显子部分片段进行了研究,并同来自于NCBI GenBank中人、猩猩、普通牛等9个物种的ZFX/ZFY基因核苷酸及其氨基酸序列进行了进化分析.结果表明,牦牛ZFX、ZFY基因间核苷酸序列同源性为94.1%,显示同一物种同源基因ZFX/ZFY间存在变异;比较的10个物种间ZFX基因核苷酸序列同源性为87.7%、ZFY基因为81.7%,相应ZFX、ZFY氨基酸同源性分别为96.6%、91.0%,ZFY基因的变异性大于ZFX基因,显示X染色体与Y染色体可能是独立进化.     

蒙古牛BMPR-IB基因部分cDNA的克隆和序列分析

BMPR-IB基因主要在哺乳动物卵巢中表达,对卵泡的发育和分化起重要作用。该研究从影响卵巢生长发育和调控的BMPR-IB基因出发,以牛卵巢的RNA为模板,按照不同物种BMPR-IB基因的相似性设计特异引物,运用RT-PCR技术扩增并获得了特异片段,该片段经PCR、酶切和测序验证,证实所克隆序列为牛BMPR-IB序列,包含有953bp组成的部分cDNA序列,同源性分析结果表明,牛BMPR-IB基因序列与绵羊、山羊、人、猪、小鼠的BMPR-IB基因分别为98%、97%、92%、93%、88%的同源性。这为克隆其他物种的BMPR-IB基因提供了依据,同时牛骨形态发生蛋白的测序为更好地理解牛的生殖机理提供帮助。     

A comparative study of the atp9 gene between a cytoplasmic male sterile line and its maintainer line and further development of a molecular marker specific for male sterile cytoplasm in kenaf (Hibiscus cannabinus L.)

mtDNA was isolated from cytoplasmic male sterility (CMS) line P3A and its maintainer P3B of kenaf (Hibiscus cannabinus L.). The atp9 gene and its two flanking sequences were obtained using homology cloning and high-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR methods. The coding sequences showed only two base pairs difference between the CMS and its maintainer, and shared a homology of over 87 % with atp9 genes from other species in GenBank. However, when comparing the flanking sequences, a 47-bp deletion was characterized at the 3′ flanking sequence of atp9 in the CMS line. Quantitative PCR analysis indicated that the expression level of atp9 in the CMS line was 0.937-fold that of its maintainer. Furthermore, the respiratory rate of anthers in the CMS line was markedly lower than that of its maintainer. The results indicated that the 47-bp deletion at the 3′ flanking sequence of atp9 and/or down-regulated expression of the atp9 gene in the CMS line might be closely related to CMS in kenaf. To confirm whether the 47-bp deletion was specific to cytoplasm of male sterile lines, another 21 varieties were used for further analysis. The results showed that the 47-bp deletion was specific to male sterile cytoplasm (MSC) of kenaf. Based on these, a specific molecular marker was developed to distinguish the MSC from male fertile cytoplasm of kenaf.     

10个线粒体基因在甘蓝型油菜NCa不育系统不同组织中的转录调控及其与育性的关系

用10个线粒体基因为探针,对NCα不育系、保持系和可育F1的苗期叶片、幼蕾及未成熟种子的线粒体RNA进行了Northern分析。结果表明,这10个线粒体基因除atp6外,其余9个基因在同一材料的不同组织中没有表达差异,都属于组成型表达的线粒体基因。其中,off139、orf222、atp1、cox1、cox2、cob、rm5S、rm26S等8个线粒体基因在不育系、保持系和可育F1的苗期叶片、幼蕾及未成熟种子中有着相同的表达,属于表达不受核基因型影响,没有组织特异性的类型：atp9基因分别在同一材料的不同组织中的转录也基本没有变化,但是在3个不同的材料间具有表达差异：可能属于表达受核基因型影响、没有组织特异性的线粒体基因。atp6基因也在3个材料的叶、蕾和种子中都产生相同大小的转录本,但是在各个材料的不同组织中存在着信号强度的差异,可能是属于表达既受核基因型影响、又有组织特异性的线粒体基因。Orf222和off139分别在不育系和可育F1幼蕾中产生相同大小和丰度的转录本,但是在保持系幼蕾中没有检测到转录本;orf222检测到的3条转录本分别为1．1kb、0．9kb、0．6kb,而off139检测到0．8kb和0．6kb两条带。atp9探针在不育系和保持系幼蕾中都检测到1条0．6kb的转录本,而在可育F1幼蕾中检测到0．6kb和1．2kb的转录本。讨论了orf222、off139、atp9基因的表达与NCα细胞质雄性不育的可能关系。     

不结球白菜同源四倍体Pol CMS及其保持系花药发育的解剖学研究

以秋水仙素人工诱变获得的不结球白菜同源四倍体Pol CMS及其保持系为材料,采用石蜡切片法研究其花药发育过程.结果显示:四倍体Pol CMS与保持系花药发育差异明显,不育系花药发育受阻于孢原细胞分化期,不形成药室,属无花粉囊型.极少数温敏型花药能产生1~2个花粉囊,但四分体时期绒毡层提早退化,导致成熟小孢子数目减少.四倍体保持系花药发育过程与二倍体基本一致,同一时期的可育小孢子四倍体比二倍体大,二倍体花粉粒都为3个萌发孔,而四倍体多为4个萌发孔.四倍体保持系同一花粉囊中花粉粒发育有不同步现象,花粉粒败育频率比二倍体高.研究表明,不结球白菜同源四倍体Pol CMS比其二倍体Pol CMS不育更彻底,更具应用性.     

分子标记辅助选择改良水稻不育系臻达A及其杂交种的稻瘟病抗性

水稻抗稻瘟病基因Pi25是一个遗传传递能力强的广谱抗性基因。本研究以携带抗稻瘟病基因Pi25的BL27为抗源供体,与优质、配合力强、感稻瘟病的水稻保持系臻达B为受体亲本进行杂交、回交创制水稻抗病保持系新种质,再与臻达A测交和回交进行不育系转育,结合分子标记辅助选择和农艺性状筛选,获得3个抗性基因纯合、农艺性状和开花习性均与臻达A相似的改良不育系株系。利用福建省近年来致病性代表的22个稻瘟病菌株对3个改良不育系及其15个杂交种进行抗性鉴定,3个改良不育系的抗性频率为95.45%~100%,15个杂交种的抗性频率均达75%以上,而原始对照臻达A及其杂交种的抗性频率仅为54.55%和40.91%~63.64%。自然病圃诱发鉴定表明,3个改良不育系的叶瘟和穗颈瘟均为0级,表现高抗,而对照臻达A的叶瘟为5级,穗颈瘟为7级,表现感病;15个杂交种均表现良好的稻瘟病抗性。进一步分析比较15个杂交种的产量、农艺性状和稻米品质表现,结果表明臻达A-Pi25-3改良不育系的综合性状表现最优,继续回交转育,于2015年育成了稻瘟病抗性强、配合力好、群体整齐和性状稳定的不育系,命名为157A。研究表明,抗稻瘟病基因Pi25不仅在水稻不育系臻达A的遗传背景下的抗性表达完全,且在不同水稻恢复系测交种的背景下同样表现出较高水平的抗性,说明抗性基因Pi25对不育系稻瘟病改良的效果明显。创制的新不育系157A的稻瘟病抗性显著提高,还基本保留了原来不育系高配合力等优良特性,为选育高产、优质、抗病杂交稻新品种提供了不育系新种质。     

水稻红莲型细胞质雄性不育系与保持系mtRNA差异显示和差别片段的分析

将T4 RNA连接酶和AFLP技术特点相结合构建了适于mtRNA的差异显示方法 ,并比较了水稻 (OryzasativaL .)红莲型细胞质雄性不育系、保持系和杂种一代mtRNA的差异。在 4组引物对的选择扩增产物中共找到 6个差异片段 ,其中差异条带DTA为不育系仅有 ,条带DAB为不育系和保持系特有 ,而条带DBF1、DBF2 、DBF3 、DBF4 为保持系和F1杂种共有。这表明水稻红莲型不育系粤泰A与杂种一代泰优 2号mtRNA的差异大于保持系粤泰B和杂种一代泰优 2号mtRNA的差异。Northern杂交证实条带DTA在不育系、保持系和杂种一代的转录确有差异 ,表明它与红莲型细胞质雄性不育有关。条带DTA全长 2 5 9bp ,尽管未发现有同源序列和新的开放阅读框 ,但它可作为探针从cDNA文库中筛选全基因序列 ,进而寻找与细胞质雄性不育有关的开放阅读框架。     

Alterations of RNA Editing for the Mitochondrial ATP9 Gene in a New orf220-type Cytoplasmic Male-sterile Line of Stem Mustard （Brassica juncea var. tumida）

RNA editing for the mitochondrlal ATP9 gene of encoding regions has been observed in both cytoplasmic malesterile and maintainer lines of stem mustard, where its editing capacity varied spatially and temporally in the cytoplasmic male sterility （CMS） line. There were four RNA editing sites for the mitochondrial ATP9 gene according to Its normal editing sites in mustard, of which three sites occurred as C-to-U changes and one as a U-to-C change. As a result, the hydrophobicity of deduced ATP9 protein was reduced due to the conversions at its 17th, 45th and 64th positions. Meanwhile, the conservation of deduced ATP9 protein was enhanced by changes at the 56th position. Loss of a specific editing site for ATP9 was observed in juvenile roots, senile roots, senile leaves and floret buds of the CMS line. Comparatively, complete RNA editing for ATP9 gene was retained in juvenile roots, juvenile leaves and floret buds of its maintainer line; however, the loss of a specific editing site for ATP9 gene occurred at senile roots and senile leaves in its maintainer line. These observations allow us to produce a hypothesis that the dysfunction of a specific mitochondrial gene arising from RNA editing could probably be a factor triggering CMS and organ senescence through unknown cross-talk pathways during development.