基于XcmⅠ酶切的高效TA克隆载体的构建

目的：制备基于XcmⅠ酶切的高效TA克隆载体,并检测其克隆PCR产物的效果。方法：设计一对互补配对的寡核苷酸,经过变性及退火后插入质粒pUC19的多克隆位点,从而在该多克隆位点中引入2个XcmⅠ酶切位点,用XcmⅠ酶切后即获得含有3’突出T碱基的T载体;为了提高该T载体的克隆效率,优化了2个XcmⅠ酶切位点之间的碱基数目,排除了载体自连产生白色克隆的可能性,使假阳性大大减少;此外,为了便于完全酶切与未完全酶切载体的分离,在2个XcmⅠ之间插入了一段无关DNA片段。结果：改进得到的T载体可以有效克隆PCR产物,其阳性克隆率可达95％。结论：构建了基于XcmⅠ酶切的TA克隆载体,经过改进的T载体具有很高的克隆效率。     

基于XcmI识别序列的T载体的构建及连接PCR片段的优化

目的:构建基于Xcm I识别序列的T载体并对与其连接的PCR片段进行优化。方法:首先将5’和3’端含有Xcm I识别序列的人组蛋白H4 c DNA定向克隆至p CDNA3.0表达载体中,再用Xcm I酶切得到基于p CDNA3.0载体骨架的T载体,为提高T载体与DNA片段的连接效率,在DNA片段PCR扩增前将其引物进行磷酸化并在PCR结束后再用Taq DNA聚合酶和d ATP处理,分别将长度为312 bp和1 329 bp的PCR片段T载体连接并将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,培养转化子,通过菌液PCR和琼脂糖凝胶电泳估算转化子的阳性率。结果:经Xcm I酶切后的T载体能高效地与目的 DNA片段连接;除T载体本身质量外,扩增DNA片段所用引物的磷酸化与否也是影响克隆效率的重要因素之一;对较大的插入片段而言,经PCR扩增、纯化后再用Taq DNA聚合酶和d ATP处理也能够显著增加连接效率。结论:克服了对蓝白筛选或插入自杀基因等实验条件的限制,可为T载体的常规制备并与目的片段进行高效地连接提供了新的线索。     

酵母表面展示T载体构建及目的蛋白的表面展示

构建一种能对PCR产物进行直接克隆并展示于酵母表面的新型T载体。根据酵母表面展示载体p YD1多克隆位点序列设计出利用两端带有XcmⅠ内切酶酶切位点的含有黄色荧光蛋白基因的XcmⅠ酶切盒,通过NheⅠ和XhoⅠ酶切位点插入到p YD1载体上形成质粒p YD-YFP,并对其进行酶切鉴定和DNA测序分析,再经XcmⅠ酶切后形成两端带有d T的表面展示T载体。利用PCR扩增两个含有荧光蛋白的融合蛋白PCAD-CFP和PSR-Ds Red的基因并直接克隆到所构建的T载体中,检测其表达功能。酶切鉴定和DNA测序结果显示PCAD-CFP和PSR-Ds Red正确插入载体上,分别转化至酿酒酵母EBY100中,激光共聚焦显微镜下观察到相应的荧光的酵母,表明克隆有融合蛋白基因片段的载体成功在酵母细胞中进行表面展示,证明了所构建的酵母表面展示T载体具有直接克隆和表面展示目的蛋白的功能。     

酵母高效克隆表达T载体pYES2-T的构建及应用

为了在酵母中高通量、高效率地对外源基因进行克隆和表达,本研究以酵母表达载体pYES2为基础,构建高效克隆表达T载体。pYES2是酿酒酵母的一种高效表达载体,在其多克隆位点处设计插入XcmⅠ-Intron-XcmⅠ片段,同时将其载体中URA3基因中原有的XcmⅠ酶切位点进行定点突变,构建出pYES2-T酿酒酵母高效表达T载体。利用XcmⅠ酶切载体pYES2-T,使其产生两个突出的T末端,一方面可以通过PCR产物加A的方式直接进行TA克隆;另一方面可在半乳糖诱导启动子的调控下,对TA克隆后的外源基因在酵母中诱导表达。利用该系统高通量地对人工合成耐盐系列基因NLEAs进行筛选,研究结果表明,该系统可以在酿酒酵母中一步式完成片段克隆及耐盐基因的筛选。本研究构建的酵母表达T载体使用方便、效率高、成本低,应用前景广阔。     

可直接克隆PCR产物的克隆载体的构建

本文描述一种构建与PCR产物直接连接的克隆载体的方法。以高拷贝克隆载体pUC118为骨架载体,在pUC118质粒氨苄抗性基因的Eam1105 I 酶切位点上,以点突变的方式封闭Eam1105 I 酶切位点。经转化大肠杆菌JM109证实,该改造过的pUC118质粒,可使宿主细胞仍具有氨苄抗性。将一人工合成的具有两个Eam1105 I 酶切位点的互补寡聚核苷酸链（两端具有BamH I 接头）插入已封闭Eam1105 I 酶切位点的pUC118*载体的BamH I 位点,构成新的克隆载体,此质粒命名为pUC118E。该载体经Eam1105 I 酶切后,可产生3′末端突出一个T碱基的T-载体,能与PCR产物直接连接。 Abstract:A new method for construction of a cloning vector (T-vector) for direct ligation with PCR products was described.The T-vector derived from pUC118 in which the unique restriction site of Eam1105 I in the region of Ampr gene was deleted and an artificial DNA fragment flanking two Eam1105 I was introduced at the site of BamHI.The modified vector was named as pUC118E.A T-vector with 3′over hang end of a single T can be obtained via digesting of pUC118E with Eam1105I.PCR products can be easily cloned with this T-vector.     

基于XcmⅠ的T载体及其在合成生物学中的应用

为了节约成本和提高实验效率,以商用p MD18-T载体为基础,构建获得了p FL-XS-T载体,其具有符合Biobrick标准的串联XbaⅠ-XcmⅠ-XcmⅠ-SpeⅠ克隆序列,通过对XcmⅠ的酶切处理即可以通过TA克隆方便地克隆PCR片段。克隆验证实验结果表明,经XcmⅠ处理的该载体可以与PCR片段进行TA连接,连接效率及阳性率均可以满足实验室要求并且可以得到Biobrick标准质粒。此外,该载体不仅可以与其余Biobrick标准元件进行串联,还可以作为功能DNA元件的筛选载体。     

两种pUC18高效T载体的构建

T载体是用于直接克隆PCR产物的线性载体.在此之前,克隆PCR片段时一般先用Klenow片段酶或T4DNA聚合酶削平PCR产物两端,克隆过程中又大都不能使用碱性磷酸酶为载体片段脱磷,因为绝大多数PCR引物5’端未磷酸化,T载体的诞生使分子生物学工作者摆脱了这一窘境,而且,T载体的3’端突出的T碱基与PCR产物3’端由于Taq酶非模板依赖的末端转移酶活性而添加的A碱基[1]互补,使载体与PCR产物的连接效率大大提高.由于具有上述优点,T载体从一产生就引起人们极大的兴趣,很多公司也相继推出了各自的T载体系统,并运用该技术改造了很多传统载体.本…     

一种温敏复制缺陷T载体的构建及在鸡白痢沙门氏菌基因敲除中的应用

基因敲除是基因功能研究的重要手段,载体是基因敲除的工具和核心。为获得有效的基因敲除载体以快速构建基因突变株及鉴定相应基因的必需性,在已有温敏复制缺陷pIDM1质粒的基础上,于EcoRⅠ和PstⅠ位点间插入串联的XcmⅠ酶切位点接头,构建了pIDM-T质粒;该质粒经XcmⅠ酶切可获得末端突出T的线性化pIDM-T载体。在验证了pIDM-T质粒复制的温敏特性基础上,应用构建的T载体克隆鸡白痢沙门氏菌CVCC527菌株的eno和ybdr两个基因,鉴定获得pIDM-T_eno和pIDM-T_ybdr两个重组质粒;将重组质粒转化527菌株,经IPC(Integration rate per cell)值计算,鉴定eno为必需基因,ybdr为非必需基因。挑取非必需ybdr基因527菌株重组菌(SalΔybdr),经PCR和测序,确认突变菌株重组位点的正确性。pIDM-T载体可快速克隆PCR产物,用于沙门氏菌的基因敲除及必需性鉴定,为沙门氏菌基因功能研究提供了一种有效快速的手段。     

HBV X 区基因部分序列的亚克隆与PCR 检测

目的：探讨HBVX区基因用于乙型病毒性肝炎早期诊断价值和意义。方法：设计特异性引物,将pBR322-HBV质粒X区部分序列PCR产物AT亚克隆至pBS—T载体,提取和纯化质粒DNA,再对HBVX区序列进行PCR扩增。结果：获得了预期希望的质粒。PCR的最佳退火温度为51℃,灵敏度达到101拷贝／2μl,线性范围101—1010拷贝／2μl。讨论：pBR322-HBV质粒中的靶基因成功地被亚克隆至pBS—T载体。pBR322-HBV中X区目的序列扩增产物为57bp,该小片段勿需纯化就可直接AT亚克隆至新载体,有利于后续的常规PCR检测和TaqMan MGB荧光定量PCR检测。     

乙肝病毒突变核心蛋白基因的克隆及序列分析

目的克隆发生长片段缺失的乙肝病毒核心蛋白基因（HBV-C）,并对其进行DNA序列和蛋白质结构分析。方法通过PCR从1株乙型肝炎病毒中扩增得到发生长片段缺失的HBV-C基因,利用TA克隆将PCR产物克隆人pUCm—T载体并进行测序、同源性比较和蛋白质结构分析。结果PCR扩增出的HBV-C基因经序列分析表明长度为454bp,其核苷酸序列缺失了220—317bp之间的98个碱基,造成从74个氨基酸起发生移码突变。结论成功克隆发生长片段缺失的HBV-C基因,为表达及功能研究奠定了基础。     

一种新型可用于DNA分子量标准的质粒构建

将首尾带有EcoR Ⅰ酶切位点的2．0kb、1．5kb、1．0kb、0．75kb、0．5kb、0．25kb六个长度的片段逐步连接到pGEM-3zf( )质粒上的B．am H I位点中,构建的质粒用EcoR Ⅰ进行单酶切,经电泳可以获得七条DNA带与设计结果完全一致,可用于DNA电泳试验中分子量标准。     

An expeditious method for constructing T-vectors usingEam 1105 I cassettes

An expeditious method is described for constructing T-vectors containing complementary 3′-thymidine overhangs. A T-vector was developed by cloning a 90-bpEam 1105 I cassette containing 2Eam 1105 I restriction sites into a modified pUC119 vector. TheEam 1105 I cassette was generated by PCR with 2 specific primers containing different recognition sequences ofEam 1105 I. The recombinant vector was easily converted into a T-vector by digestion of the plasmid withEam 1105 I. The cloning efficiency of the PCR product was approximately 90%. The method described here is a simple way to construct a variety of T-vectors.     

大麦黄矮病毒GAV株系外壳蛋白基因的克隆和序列分析

The Barley yellow dwarf virus (BYDV) GAV isolate was preserved at the Institute of Plant Protection of the Chinese Academy of Agricultural Sciences. The cDNA of BYDV GAV coat protein (CP) gene was amplified from the extracted RNA of BYDV GAV by using the polymerase chain reaction (PCR), and cloned into pGEM-7zf(+). Its complete nucleotide sequence has been determined by means of Sanger's dideoxy-mediated chain-termination method. The result showed that BYDV GAV CP gene has 600nt. It shares 97.5% and 96.5% identity with CP gene of BYDV MAV-PS1 in terms of nucleotide and amino acid sequences respectively.     

金黄色葡萄球菌肠毒素B基因的克隆和在大肠杆菌中高效表达

利用PCR方法从金黄色葡萄球菌TSTw基因组DNA中扩增出约700bp的DNA片段,将之克隆到pGEM7Zf(+)载体上并转化大肠杆菌 DH5α菌株。重组质粒的测序结果表明克隆到了seb基因,它含有717bp（不包括N端81bp的信号肽编码区）,其核苷酸序列与文献报道完全一致。将其连接于表达载体7ZTS上,转化到大肠杆菌JM109（DE3）内。表达的SEB占总蛋白33.5%。      

pUCPCR1

The mutiple cloning site of pUC19 was replaced by a multiple cloning site possessing a double Xcm1 restriction site. Digestion withXcmI gives a linear vector with a single 3′-overhanging T-residue at both ends. This provides the easiest way of creating a vector in which PCR fragments produced byTaq polymerase can be directly cloned without further modifications.