胰岛类器官研究进展

类器官是将具有多向分化潜能的干细胞或组织细胞在特定环境下培养分化成为能够模拟原生器官结构和功能的三维结构.类器官在各种疾病模型研究及药物筛选中发挥至关重要的作用.近年来,通过体外诱导胰腺组织或多能干细胞分化形成具有胰岛细胞功能的胰岛类器官研究成为热点,为胰岛相关疾病模型、药物研究以及糖尿病的治疗提供了新的手段.本文针对...     

Cell | 首次鉴定出胰岛成体干细胞

糖尿病主要是胰岛β细胞功能失常导致的胰岛素分泌不足引起的，由于缺乏足够的供体胰岛进行移植治疗，许多患者需要终生使用胰岛素维持健康。若可体外培养获取移植用胰岛β细胞，将给糖尿病患者带来巨大福音。中国科学院分子细胞科学卓越创新中心曾艺课题组通过对成年小鼠胰岛进行单细胞转录组测序，成功找到了胰岛中特异表达Procr的成体干细胞，这类Procr+细胞可以在体外培养获得有功能的胰岛类器官(2020年3月19日在线发表，doi:10.1016/j.cell.2020.02.048)。研究人员通过谱系示踪发现这类Procr+细胞可以在正常生理条件下分化出胰岛中所有的细胞类型，包括Alpha、Beta、Delta和PP 细胞。同时，他们通过3D培养体系成功建立了在体外能够迅速地响应糖刺激、分泌胰岛素的有功能的胰岛类器官。并且，这些胰岛类器官移植到糖尿病小鼠体内能够挽救小鼠的糖尿病表型。体内外实验均展示了Procr+细胞的干细胞性质，为未来糖尿病的治疗提供了理论依据和技术支持。     

单克隆人胰腺干细胞分化特性的研究

研究1例来源于4月龄男性流产胎儿胰腺组织的单克隆人胰腺干细胞（monoclonal human pancreatic stem cell,mhPSC）系的体内外分化特性。将mhPSCs接种在铺有0．1％明胶的培养皿内,扩增培养3d后,加高糖DMEM诱导液诱导培养25d。相差显微镜下．观察细胞生长状况。采用双硫腙染色法、RT—PCR及葡萄糖刺激释放胰岛素和C肽实验．对体外定向诱导mhPSCs分化为功能性胰岛进行检测。将mhPSCs悬液注射在成年雄性裸鼠腹股沟皮下．注射30d时,取出移植物,采用SP法进行免疫组织化学反应,以检测mhPSCs的体内自然分化潜能。体外扩增培养,mhPSCs贴壁生长,呈多角形上皮样。生长至单层．呈“铺路石”状。体外定向诱导,细胞逐渐由多角形变成圆形,并聚集成类胰岛。诱导培养15d时．形成的类胰岛中少数细胞分化为B细胞,双硫腙染色阳性。诱导培养25d时,多数细胞分化为8细胞,双硫腙染色阳性,转录表达胰岛素的mRNA。用不同浓度葡萄糖刺激．诱导胰岛不仅释放胰岛素和C肽,而且其释放量随糖刺激浓度升高显著增加（0．01〈P〈0．05）。体内分化实验显示,mhPSCs在裸鼠背部形成类畸胎瘤。类畸胎瘤易与裸鼠分离,色白,血管丰富。显著表达pdx1、胰岛素、胰高血糖素、CK、MBP及NF蛋白。该研究结果证实单克隆人胰腺干细胞系体外定向诱导分化为包含大量β细胞的功能性类胰岛,在体内自然分化为胰岛、上皮及神经组织细胞。     

面向国家重大需求 开发建立新研究模型——胰岛类器官模型的研究进展与展望

糖尿病是威胁人类健康的一种重大代谢性疾病,给人们和社会带来了沉重的负担,对其发病机制的研究和治疗方法的开发是国家的重大需求。随着类器官技术的问世,胰岛类器官(islet organoid)应运而生且备受关注,被认为是极具价值的新型糖尿病研究模型。胰岛类器官是基于目前对胰岛发育机制的理解,通过体外添加诱导因子程序化地激活或抑制发育过程中的特定信号通路,将干细胞体外诱导分化成具有类似天然胰岛结构和功能的三维细胞培养物。由于胰岛类器官能够在一定程度上体外模拟胰岛的发育过程,体现其组织结构,行使分泌多种激素、调控血糖水平的生理功能,因此具有广泛的应用价值,已被用于糖尿病发病机制研究、药物筛选和评价以及临床移植治疗等,显示出良好的应用前景。本文主要总结和介绍胰岛类器官目前的研究进展、应用前景和亟待解决的问题,并且讨论和展望未来的发展方向。     

胰岛类器官研究进展

糖尿病被列为对人类健康威胁最大的三类疾病之一,是全球重点关注的公共卫生问题.目前的药物治疗无法从根源上恢复血糖的自主调节.异体胰岛移植能够有效控制糖尿病患者的血糖,但由于尸体胰岛的来源有限,如何在体外获得大量胰岛素分泌细胞是糖尿病移植治疗的关键.近年来,类器官(organoid)培养技术日益发展,给再生医学研究和疾病治疗带来了新思路.胰岛类器官不仅为探究胰岛发育、糖尿病发病机制和治疗策略提供了体外模型,也为糖尿病的细胞治疗提供了新的细胞来源.本文综述了胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、转分化细胞和成体干细胞等不同来源的胰岛类器官的研究进展,并探讨如何优化胰岛类器官的培养条件以助力糖尿病的研究与治疗.     

联合应用大鼠血管内皮细胞和胰岛培养对胰岛功能的影响

目的 探讨通过体外共培养胰岛和血管内皮细胞能否改善胰岛的功能.方法 SD 大鼠分离纯化出胰岛细胞,分为两组:A 组胰岛单纯培养组,B 组胰岛和内皮细胞共培养组.从大鼠的胸主动脉分离纯化出血管内皮细胞,胰岛分离纯化后通过AO/PI 染色和胰岛素释放实验来判断两组胰岛的活性.结果 共培养组胰岛在7 d 内维持正常的形态,9...     

联合应用大鼠血管内皮细胞和胰岛培养对胰岛功能的影响

目的 探讨通过体外共培养胰岛和血管内皮细胞能否改善胰岛的功能.方法 SD 大鼠分离纯化出胰岛细胞,分为两组：A 组胰岛单纯培养组,B 组胰岛和内皮细胞共培养组.从大鼠的胸主动脉分离纯化出血管内皮细胞,胰岛分离纯化后通过AO/PI 染色和胰岛素释放实验来判断两组胰岛的活性.结果 共培养组胰岛在7 d 内维持正常的形态,90﹪的胰岛通过AO/PI 染色显示良好的活性;胰岛素释放实验显示第7 天（2.21 ± 0.21）和第14 天（2.53 ± 0.21）共培养组和单纯培养组（1.94 ± 0.15,1.71 ± 0.19）刺激指数差异有统计学意义（P 〈 0.05）.结论 应用大鼠血管内皮细胞和胰岛共培养能够改善胰岛的存活及分泌功能.     

生物制造领域的机遇与挑战：发展类器官构建及培养的新技术

类器官构建及培养技术是近年来新兴的前沿性科学技术，该技术已经被广泛用到组织器官发育、疾病发病机制、药物开发和再生医学等领域的研究之中。干细胞及组织器官发育分化调控的研究成果为类器官构建及培养技术的建立提供了重要的信息。体外借助细胞外基质成分及细胞因子等构建出适宜于干细胞增殖、分化的三维微环境是类器官构建及培养技术的核心。在适宜的微环境中，干细胞及其分化的多种类型细胞可通过自组织形成与体内相应组织结构和功能相似的类器官。当前，多种类型的类器官构建及培养技术虽然得到广泛应用，但其技术体系仍具有操作的复杂性、产量的不确定性及获得的类器官结构和功能与体内组织存在较大差异性等难题。生物制造领域先进技术的引入推动了类器官技术的发展。本文将综述基质成分与细胞因子构建的三维微环境的研究进展，并讨论生物制造领域的先进技术在类器官构建与培养技术中的应用，例如微孔限定的培养技术可以控制类器官的生长发育，能用于制备大小均一及生物学特性相似的类器官；图案化技术使细胞按图案特征响应性地增殖与分化，可以精准控制类器官的生成；三维生物打印技术可以精确组装各类细胞，有助于构建具有复杂结构和区域特异性的类器官。类器官构建...     

胰腺类器官技术的发展及应用

在人类生物学和疾病的研究过程中,动物模型扮演了重要的角色。但随着研究的深入,其局限性也逐渐凸显。新兴的人类类器官(organoid)技术较好地弥补了动物模型的不足。类器官主要是指由干细胞衍生出的3D多细胞微器官。它能在体外模拟组织器官自发的谱系分化与稳态维持,并具备类似于体内组织器官的生理功能。目前,类器官培养技术在很多器官(比如胃肠道、食管、肝、胆、脑和膀胱等)中都取得了较好的进展。胰腺是人体内唯一的一个既是外分泌腺又是内分泌腺的特殊脏器。因此,胰腺类器官技术的发展面临更大的挑战。目前,胰腺导管类器官和胰岛类器官技术日渐优化,但如何构建复合型胰腺类器官仍是当前研究的难点。该综述将主要回顾胰腺的发育过程、体外定向分化技术以及胰腺类器官模型构建与应用等最新研究成果,同时简要探讨胰腺类器官模型具有潜力的发展方向。     

胰腺导管单克隆上皮样干细胞的多分化潜能

体外诱导源于成年大鼠的胰腺导管单克隆上皮样干细胞分化形成胰岛、神经、脂肪及成骨细胞,探讨干细胞的多分化潜能。扩增培养源于成年大鼠的胰腺导管单克隆上皮样干细胞,采用不同的诱导液体外诱导其向胰岛、神经、脂肪及成骨细胞分化,并通过DTZ染色、糖刺激试验、免疫荧光反应、油红O染色、茜素红染色或Vonkossa染色的方法对分化细胞进行检测。结果显示,体外诱导培养干细胞分化形成类胰岛,DTZ染色阳性,糖刺激分泌胰岛素、C-肽;分化形成类神经细胞,表达神经元特异性烯醇化酶;分化形成类脂肪细胞,油红O染色阳性;分化形成类成骨细胞,其分泌物呈岛状矿化结节,茜素红和Vonkossa染色阳性。这表明,该源于成年大鼠的胰腺导管上皮样干细胞系具有多分化潜能。     

胰岛冷冻保存方法研究进展

本文就目前国内外所研究的胰岛及胰腺组织碎片冷冻保存方法进行了总结,认为胰岛冻存前可进行24小时培养或不培养;抗冻剂DMSO浓度以10％(1.5mol/L)为佳;4℃或0℃平衡30分钟;缓慢降温至-70℃,投入液氮;快速复温(200℃/分)后冰浴中倍比稀释透出DMSO为较理想的冻存和复苏模式。该模式可以最小限度地降低胰岛的损伤,提高胰岛存活率及保持较高的胰岛素分泌功能。     

两种培养液对小鼠胰岛细胞培养后的形态和功能的影响

目的:考察两种胰岛细胞培养液对小鼠胰岛细胞培养后的细胞形态和功能的影响。方法:分别以RPMI1640和低糖型DMEM为基础配制两种胰岛细胞培养液,与小鼠胰岛细胞共培养24 h,用FD-PI染色观察胰岛活性,透射电镜观察胰岛细胞内部形态,并用连续葡萄糖灌流刺激试验考察胰岛素释放功能。结果:两种胰岛细胞培养液24h内对培养的胰岛活性影响无差异,但透射电镜结果显示以低糖型DMEM为基础的培养液培养的胰岛细胞间隙较小,且葡萄糖灌流结果显示其培养的胰岛细胞后续胰岛素分泌能力显著增加。结论:以低糖型DMEM为基础配制的胰岛细胞培养液能较好地保持培养胰岛的结构和功能。     

类器官的应用研究进展

类器官是利用干细胞的自我更新和分化能力,在体外培养形成的一种微小组织器官类似物,在很大程度上具有体内相应器官的功能。迄今为止,在3D培养条件下,已经成功培养出多种类器官如肺、胃、肠、肝和肾等类器官。它们不仅可作为组织器官的替代品用于药物和临床研究,还可用于体内器官移植。本文综述了类器官在药物毒性检测、药效评价和新药筛选中的作用以及利用类器官建立疾病模型、研究组织器官发育和类器官在精准医疗、再生医学中的价值。     

用于2型糖尿病研究的3D多器官芯片

2型糖尿病是一种全身性代谢性疾病,通常涉及多个组织和器官之间因相互作用而导致胰岛素抵抗以及胰岛功能衰竭的最终状态.本文建立了脂肪3D器官芯片、胰岛3D器官芯片及其联合应用的模型,可对2型糖尿病的发病过程和药物治疗进行多重评价.设计了一种双通道复合式微流控芯片,将脂肪器官分泌的细胞因子以及脂多糖(LPS)共同引入胰岛器官的芯片培养室,芯片通道连续灌流以模拟体液交换.通过分析脂肪细胞和胰岛细胞的脂联素(ADP)、白介素6 (IL-6)和白介素1β(IL-1β)等炎症因子的分泌情况,以及胰岛细胞的胰岛素分泌能力与对照组细胞相比较所产生的变化,分析胰岛细胞的损伤情况以及系统内炎症反应情况.结果表明,LPS可以引起胰岛细胞的炎症反应以及功能性变化,且脂肪组织的存在能一定程度上加重这种反应,利拉鲁肽(liraglutide)通过减少脂肪和胰岛细胞的炎症反应,能够减轻LPS以及脂肪组织对胰岛细胞的刺激,以改善胰岛细胞的功能.基于微流控芯片的脂肪器官和胰岛器官联合应用的平台可应用于由不同组织之间的相互作用而产生的多器官疾病反应,有望成为2型糖尿病等全身代谢类疾病药物评价的有力工具.     

成人胰腺导管干细胞的体外分离、纯化、培养及鉴定

目的:建立人胰腺导管干细胞的体外分离、纯化、培养及鉴定的方法.方法:胶原酶分次消化剪切的人胰腺组织,经过Ficoll密度梯度离心后去除胰岛组织,培养于含,10%胎牛血清的CMRL1066培养液中,7-10天可行成单层细胞,用0.25%胰酶-EDTA消化并传代培养.取2-3代细胞利用免疫荧光染色和RT-PCR方法检测CK19、Pdx-1、Nestin、Insulin及Glucagon的表达.结果:经过胶原酶消化、Ficoll密度梯度离心及后续的培养,去除了胰岛组织及外分泌腺,可获得较纯化的鹅卵石样的胰腺导管细胞.免疫荧光结果示:胰腺导管细胞CK19、Pdx-1和Nestin染色呈阳性,阳性细胞率分别为(87.5±6.2)%、(77.5±8.6)%和(50.9±9.5)%,而Insulin染色为阴性.RT-PCR结果显示该细胞表达CK19、Pdx-1和Nestin基因,而未观察到Insulin及Glueagon基因的表达.结论:该方法可较好的分离纯化出人胰腺导管细胞,经鉴定获得细胞具有胰腺干细胞的特性.     

基础内分泌学讲座(Ⅲ)

一、胰岛 1869年兰格汉斯(Langerhans)首先发现,在胰腺中有一小簇具有丰富血管支配的细胞,这些细胞不同于分泌胰液的腺泡,没有分泌导管,称作Langerhans氏小岛或胰岛。人的胰腺含有200百万个胰岛,广泛地散布在胰腺组织内,直径为20—30微米,全部胰岛组织只占胰腺重量的1—2％。胰岛是胰腺的内分泌组织,它包含3种内分泌细胞,各自分泌不同激素。α     

L-丙氨酸对小鼠胰岛分泌胰岛素的急性作用及其葡萄糖依赖性研究

探讨L-丙氨酸刺激小鼠胰岛分泌胰岛素的剂量和葡萄糖依赖性。雌性6~10周NMRI小鼠,苯巴比妥腹腔麻醉,应用胶原酶技术消化胰腺分离胰岛,置于RPMI1640培养皿中在37℃培养箱(5%CO2,95%空气)过夜培养。次日在Krebs-Ringer缓冲液中37℃水浴培养箱预培养30 min,分别把单个胰岛小心放入100 L含有不同浓度葡萄糖和不同浓度L-丙氨酸的改良Krebs-Ringer缓冲液37℃水浴培养箱培养60 min,留取50 L上清液进行胰岛素测定。结果:L-丙氨酸在0.1~20mmol.L-1范围促进了葡萄糖刺激的小鼠胰岛的胰岛素分泌,随剂量增大而增强,在低浓度葡萄糖存在的条件下,10 mmol.L-1L-丙氨酸不能刺激小鼠胰岛的胰岛素分泌,在6.7 mmol.L-1及以上葡萄糖存在的条件下,L-丙氨酸能增加葡萄糖诱导的小鼠胰岛分泌胰岛素。本研究显示L-丙氨酸能增加葡萄糖诱导的小鼠胰岛分泌胰岛素,此作用依赖于一定水平葡萄糖的存在。     

人胰腺干细胞建系及移植诱导胰岛治疗大鼠糖尿病

供体不足已成为移植胰岛治疗Ⅰ型和部分Ⅱ型糖尿病的主要障碍,分离克隆胰腺干细胞作为种子细胞并诱导其分化为功能性胰岛可提供丰富的移植资源．本研究从人流产胎儿胰腺组织分离获得1例单克隆胰腺干细胞系．无菌取流产胎儿胰腺组织,0．1％Ⅳ型胶原酶消化分离为单个细胞和细胞团．低糖DMEM＋10％FBS培养,单个细胞和细胞团贴壁,原代上皮样胰腺干细胞克隆性生长．0．25％胰蛋白酶＋0．04％已二胺四乙酸（EDTA）消化传代,成纤维样细胞和其他细胞逐渐被消除,上皮样胰腺干细胞逐渐被纯化．克隆环筛选,获得单克隆人胰腺千细胞．在培养液中添加10ng／mL表皮生长因子（EGF）,单克隆人胰腺干细胞快速生长至单层,呈铺路石样．继续传代培养,1例来源于4月龄男性流产胎儿胰腺干细胞已传50代．液氮冷冻保存细胞1×10^9个以上．染色体核型分析,该干细胞系为正常的二倍体细胞．免疫组织化学反应,共表达pdx1,glucagon,nestin及CK19蛋白,不表达insulin,CD34,CD44及CD45．RT-PCR检测,转录pdx1,glucagon,nestin及CK19的mRNA,不转录insulin．β-巯基乙醇诱导,分化为神经细胞,免疫组织化学反应表达NF蛋白．烟酰胺诱导,分化为DTZ染色阳性,转录表达insulin,分泌insulin和C肽的功能性类胰岛．将单克隆人胰腺干细胞体外诱导胰岛移植在STZ制备的糖尿病大鼠肾囊内,能降低糖尿病大鼠血糖水平,延长寿命．     

一种高效、快捷、经济的小鼠胰岛细胞分离纯化方法

采用改良的胶原酶P胆总管内逆行灌注膨胀胰腺的分离方法,比较Ficoll-400不连续密度梯度离心法和人工挑取法两种纯化胰岛的方法,用双硫腙(DTZ)对胰岛细胞团进行特异性染色计算胰岛产量及纯度,用台盼蓝染色判定胰岛细胞活性,使用间接免疫荧光法检测体外培养7 d后胰岛的功能.采用人工挑取法平均每只小鼠可获取的胰岛细胞团(245±35.6个)明显高于密度梯度离心法(120±26.3个)(n=5,P<0.05),两种方法分离纯化的胰岛活力均大于98%;但人工挑取法获得胰岛细胞团的纯度(100%)要高于密度梯度离心法(90%);纯化胰岛所用时间,采用人工挑取法(22±4 min)也少于密度梯度离心法(31±3 min).间接免疫荧光染色检测体外培养7 d后的胰岛细胞团,两种方法分离纯化的胰岛细胞团均具有良好的功能.胶原酶P胆总管内灌注消化分离法联合人工挑取纯化胰岛细胞团的方法,是一种高效、快捷、经济的小鼠胰岛细胞团分离纯化方法.     

一种高效经济的小鼠胰岛细胞分离纯化新技术

目的:建立一种经济高效的小鼠胰岛细胞分离纯化方法,为进行NOD小鼠的胰岛移植提供实验条件.方法:将5-7周龄、体重20～25 g的雄,陛昆明小鼠的胆总管结扎,并逆行Hank's液和胶原酶P灌注和分离消化,依次加入84%、67%、50%浓度的Histopaque介质后进行不连续密度梯度离心纯化胰岛细胞.双硫腙(dithizon,DTZ)和台盼兰染色分别鉴定胰岛细胞.用含5.6mmol/L葡萄糖DMEM培养液体外培养胰岛细胞,培养后的第3、5、7、9、11天取细胞上清检测胰岛素水平,并用16.7mmol/L的高浓度葡萄糖进行刺激,检测胰岛素水平确定胰岛细胞功能.结果:每个胰腺的胰岛细胞收获量在1200±124个,且纯度和活性均大于90%;体外培养9天内胰岛细胞基础胰岛素分泌水平无显著差异,至第11天时则明显减少(P＜0.05);应用16.7mmol/L葡萄糖刺激后,第5、7、9、11天的胰岛素分泌水平较第3天的明显减少(P＜0.05),然而在第7天、9天、11天时的胰岛素水平较第5天时显著降低.结论:胆总管逆行注射Hank's液和胶原酶P消化消化和不连续密度梯度Histopaque纯化的方法可以获得大量状态良好的胰岛,且胰岛细胞数量多,分泌状态良好.本分离方法是一种经济高效的胰岛细胞分离方法,同时离体后于5.6mmol/L葡萄糖DMEM培养第3天胰岛细胞胰岛素储备功能最佳,为移植研究的最佳状态.