非核糖体肽合成酶基因腺苷酰化结构域序列克隆及分析

微生物许多非核糖体肽类次生代谢产物主要是由非核糖体肽合成酶(NRPS)催化合成。参考Gontang发布的非核糖体肽合成酶(NRPS)通用引物设计扩增NRPS腺苷酰化结构域基因序列的特异引物,从海洋链霉菌L1的基因组DNA中扩增获得一个715 bp的NRPS基因序列。测序结果及比对分析表明该片段属于NRPS腺苷酰化结构域部分序列。对其拟翻译的氨基酸序列组成成分、理化性质进行分析,显示其包含AFD class I超基因家族核心结合区,为NRPS腺苷酰化结构域(A结构域)所在区域。对氨基酸序列的二级结构预测和三级结构模拟,发现与数据库中肠菌素合酶F组分的结构相似。为后续研究A结构域的特异性及完整NRPS基因簇克隆提供了参考。     

非核糖体肽合成酶催化模块的重构与多肽合成

天然次级代谢产物是重要的药物来源,非核糖体肽(non-ribosomal peptide, NRP)是自然界中广泛存在的次级代谢产物,其多样的化学结构使其具有多种生物活性,如抗炎、抗肿瘤、抗病毒等。基于非核糖体多肽合成酶(nonribosomal peptide synthetases, NRPS)模块化线性合成多肽的原理对其催化模块进行改造、重组,定向设计多肽的生物合成途径以获得目的多肽已成为一个研究热点。然而杂合NRPS存在催化模块无法加载目标氨基酸或多肽合成效率显著降低等诸多问题,限制了其应用。近年来,NRPS腺苷酰化域(adenylation domain, A域)及缩合结构域(condensation domain, C域)的底物选择性、NRPS亚基间对接域(docking domain, DD)和模块间连接区(linker)的研究已取得较大突破。从C域对底物的选择性及以不同融合边界进行催化单元替换两方面进行综述,介绍NRPS催化模块重构的研究进展,并概述了各替换方案的优点与局限性。     

海洋链霉菌酮合成酶结构域基因的克隆及分析

海洋链霉菌通过聚酮合酶(PKS)合成许多结构和功能多样且具有药用价值的聚酮化合物(PKs),酮合成酶结构域(KS)作为PKS的核心结构域,可催化底物与伸长的聚酮之间的脱羧缩合,在聚酮化合物生物合成中起着重要作用。本文通过对从海洋链霉菌Streptomyces sp. X66基因组DNA克隆获得的ks基因的生物信息学分析表明,该ks基因序列长945 bp, BLAST序列比对显示其具有典型的酮合酶结构域的功能区域。理化分析显示其拟编码309个氨基酸,理论等电点为6.60,原子组成为C₁₄₀₁H₂₂₃₉N₄₂₅O₄₁₉S₈,不稳定指数为42.11,平均亲水系数为0.112,编码产物为酸性疏水不稳定蛋白,且不含信号肽和跨膜结构,二级结构以无规则卷曲和α-螺旋为主,SDS-PAGE显示其分子量约为55 kDa。通过对ks基因的研究,为进一步解析聚酮化合物合成代谢中的调控机制及组合生物学和体外酶系合成聚酮化合物提供参考。     

淫羊藿属植物查耳酮合成酶启动子序列的克隆及比较分析

采用TAIL-PCR技术从箭叶淫羊藿(Epimedium sagittatum)叶片中克隆得到查耳酮合成酶基因(Chalcone synthase)的启动子,命名为ECHSP, 长度为750 bp,其具有TATA BOX、CAAT BOX、MYB结合位点、MYC结合位点等元件。对箭叶淫羊藿、木鱼坪淫羊藿(E. franchetii)、粗毛淫羊藿(E. acuminatum)、直距淫羊藿(E. mikinorii)、黔岭淫羊藿(E. leptorrhizum)等5种植物的CHS启动子序列进行比较分析,结果表明,CHS启动子的核苷酸多态性丰富,表明CHS 的表达可能受到多种因素的灵活调节。ECHSP与其他植物的CHS启动子序列进行比较,其TATA box的位置可能与黄酮类化合物的积累相关。此外,进化分析表明ECHSP的核苷酸序列可应用于淫羊藿属植物的系统进化研究。     

R-2-卤代酸脱卤酶的同源模建及底物对映体选择性研究

对来自假单胞菌ZJU26中的R-2-卤代酸脱卤酶(DehI-R)进行同源模建,分析其与底物的相互作用,为解析酶的底物对映体选择性提供理论依据.采用Sybyl中的APM模块首次构建并优化了R-2-卤代酸脱卤酶的三维结构,并用Procheck 验证结构模型的合理性.使用Suflex-Docking模块将结构模型与底物分别进行对接,分析相互之间的作用.序列比对结果显示,R-2-卤代酸脱卤酶与恶臭假单胞菌PP3中DehI的相似性达23.71％.Deh-R模建后的结构与模板很好的吻合.模型比对分析DehI-R中参与催化的残基,除Asn2.03外大部分都比较保守.分子对接结果表明,R-2-氯丙酸和S-2-氯丙酸都可以结合到活性位点上,决定其选择性的是值点Asn203,在RS-2-卤代酸脱卤酶所对应位点的残基为Ala,相比之下,Aan具备较大的空间位阻,从而阻止了S-2-氯丙酸的反应.利用Sybyl中的Biopolymer模块对R-2-卤代酸脱卤酶中的Asn203突变成具有不同空间位阻的Ala、Gly和Gln.突变酶与底物对接结果进一步证实了Asn203位点对R-2-卤代酸脱卤酶的底物对映体选择性作用.     

稀有海洋放线菌Salinispora arenicola大片段DNA基因组文库的构建

目的：构建稀有海洋放线菌S.arenicola基因组文库。方法：以稀有海洋放线菌S.arenicola为实验材料,随机剪切提取的总DNA,5′-磷酸末端补平回收40kb左右的DNA片段,与pWEBTM载体连接,经包装蛋白包装成噬菌体后侵染宿主细胞E.coliEPI100,构建该菌株的基因组文库,并对该文库进行质量鉴定。结果：成功构建了稀有海洋放线菌S.arenicola的基因组文库,效价达6.5×104CFU/mL,得到3000个阳性克隆子,远远大于按覆盖率为99%计算至少所需的657个阳性克隆子数,且平均插入片段长度为36kb,重组率100%。阳性克隆子保存于96孔板中,-80℃保存。结论：所构建文库的各项指标均达到要求,为了进一步评估S.arenicola所能合成的所有潜在天然产物,还需要进一步检测该文库中包含有生物合成基因簇的大肠杆菌的表达情况。     

海洋链霉菌Streptomyces sp.B-17卤化酶基因的克隆及生物信息学分析

海洋放线菌是生理活性物质重要的产生菌,而海洋放线菌产生的卤化酶可催化生理活性物质的卤化,极大提高了其抑菌和抗癌活性。从大连海域分离出1株链霉菌Streptomyces sp.B-17,从其基因组DNA中扩增一524 bp的基因片段,经与pMD-19T载体连接,转化大肠埃希菌JM109感受态细胞,重组质粒经鉴定证明正向插入到pMD-19T载体。生物信息学分析表明该序列与Actinocorallia herbida DSM 44252的2个依赖FADH2卤化酶基因的同源性为88%,拟编码氨基酸与色氨酸卤化酶(CP001848)的相似性也达到74%,证明所克隆的基因片段为卤化酶基因片段,为后续的基因功能分析及表达奠定了基础。     

Phylogenetic and sequence profile analysis of Non-Ribosomal Polyketide Synthase-Adenylation (NRPS)domain from Actinobacterium dagang 5

This study aims to find out the mapping of bioactive compounds by combinational analysis of regulatory machinery pattern study and metabolomics approach. In which we isolated a highly potent Actinobacterium dagang 5 from Gulf of Manner, which shows broad-spectrum activity against several pathogens. So the isolate was used for overall metabolic profiling studies on crude extract and phylogeny pattern analysis of NRPS A-domain, which is an important gene clusters and plays vital role in production of bioactive metabolites. The result suggests that Actinobacterium dagang 5 has the potential to produce a new type of antibacterial compounds.     

竹节参鲨烯环氧酶基因的克隆与生物信息学分析

根据已报道的植物鲨烯环氧酶(SE)基因特异性引物克隆竹节参SE基因.结果表明,克隆得到竹节参SE全长为1 632 bp,编码539个氨基酸,命名为PjSE.生物信息学分析指出,PjSE基因的氨基酸序列与人参属植物人参、三七、越南人参的同源性依次为99％、98％和98％.推测PjSE基因定位于线粒体(mTP)、叶绿体(cTP)和分泌途径(SP).PjSE基因存在保守结构域FAD结合位点,含4个跨膜结构域和7个motif结构位点.PjSE蛋白二级结构以无规则卷曲(Random coli)和α-螺旋(Alpha helix)为主要结构元件,延伸链(Extended strand)和β转角(Beta turn)分散于整个蛋白质中,百分比依次占40.82％、37.48％、15.77％、5.94％;该蛋白能折叠形成典型的三维结构.     

竹节参鲨烯环氧酶基因的克隆与生物信息学分析

根据已报道的植物鲨烯环氧酶(SE)基因特异性引物克隆竹节参SE基因.结果表明,克隆得到竹节参SE全长为1 632 bp,编码539个氨基酸,命名为PjSE.生物信息学分析指出,PjSE基因的氨基酸序列与人参属植物人参、三七、越南人参的同源性依次为99％、98％和98％.推测PjSE基因定位于线粒体(mTP)、叶绿体(cTP)和分泌途径(SP).PjSE基因存在保守结构域FAD结合位点,含4个跨膜结构域和7个motif结构位点.PjSE蛋白二级结构以无规则卷曲(Random coli)和α-螺旋(Alpha helix)为主要结构元件,延伸链(Extended strand)和β转角(Beta turn)分散于整个蛋白质中,百分比依次占40.82％、37.48％、15.77％、5.94％;该蛋白能折叠形成典型的三维结构.     

Cloning and Heterologous Expression of the Vibrioferrin Biosynthetic Gene Cluster from a Marine Metagenomic Library

A biosynthetic gene cluster of siderophore consisting of five open reading frames (ORFs) was cloned by functional screening of a metagenomic library constructed from tidal-flat sediment. Expression of the cloned biosynthetic genes in Escherichia coli led to the production of vibrioferrin, a siderophore originally reported for the marine bacterium Vibrio parahaemolyticus. To the best of our knowledge, this is the first example of heterologous production of a siderophore by biosynthetic genes cloned from a metagenomic library. The cloned cluster was one of the largest of the clusters obtained by functional screening. In this study, we demonstrated and extended the possibility of function-based metagenomic research.     

羊驼催乳素基因cDNA克隆及序列分析

实验通过克隆分析羊驼催乳素基因的部分序列,对羊驼催乳素基因的结构和功能进行初步探索和揭示。从GeneBank中已报到的脊椎动物催乳素基因保守区设计一对引物,采用Trizol法提取羊驼胎盘总RNA,利用RT-PCR技术扩增出长度约为510 bp的片断。测序后在NCB I工作平台中进行BLASTn同源性比较,得出结论:羊驼催乳素基因与已登录的哺乳动物催乳素基因同源性均超过85%,最高达97%。借助DNAstar分子生物学分析软件绘制了相关动物的遗传进化图,并对羊驼的种属地位进行了进一步验证。。     

Differences in Variation of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Sequences from Henan and Shanghai Regions of China

Illegally paid blood donation was a risk factor for HIV acquisition exclusively in Henan and Hubei Provinces of China,and not in Shanghai.Nucleotide sequences in the gag and env genes of HIV-1 were compared between isolates from Henan and Shanghai regions of China to test whether an expected higher degree of a common source of infections from this unique blood donation transmission risk would be evident as decreased variation among Henan isolates in an exploratory cross-sectional analysis.Among 38 isolates studied,23 of 23(100%)from Henan and 8 of 15(54%)from Shanghai were subtype B.In addition,fewer sequence differences were found in gp41 of subtype B isolates from Henan than from Shanghai isolates.Further studies with additional controls are therefore warranted to confirm the role of the degree of a common source of infections in differences in HIV variation across populations.     

我国部分地区H9亚型禽流感病毒血凝素基因序列比较与遗传发生关系分析

为从分子水平掌握我国H9亚型AIV的遗传变异情况和流行规律,本研究汇集近年来从我国12个省、市、自治区的发病鸡群中分离到的23株H9亚型禽流感病毒,通过RT-PCR方法和核苷酸序列测定获得了23个毒株的HA基因cDNA核苷酸序列。核苷酸和推导的氨基酸序列同源性比较结果表明,这些毒株HA基因的核苷酸序列同源性为94．1％～100％,氨基酸序列同源性为95．4％～100%;将这23个毒株和来自亚洲及世界其它地区的另外31株的HA基因cDNA序列同源性进行比较发现,分离自香港的HK170499株与日本的2个毒株关系较近;氨基酸序列分析发现,CKGS199、CKTJ196、CKTJ296、CKSH300和CKBJ197五个毒株各发生了一个潜在的糖基化位点的丢失。54株H9亚型AIVHA基因55bp～1152bp的氨基酸序列分析发现,裂解位点尽管有10种基序,但本研究中的23株和近年来从我国大陆和香港地区的分离的毒株则均为RSSR↓GLF;构成受体结合位点的191位氨基酸有一个规律,即所有中国大陆毒株与部分香港毒株都为N,其它毒株均为H,141aa～143aa处的糖基化位点有与191aa类似的规律,即：凡是191aa为N的毒株,该处均为NVS（CKBJ194除外）,凡是191aa为H的毒株,则该处均为NVT;遗传发生关系分析,中国大陆毒株处于欧亚谱系的第一支。本研究结果表明近年来我国鸡群中H9N2亚型禽流感病毒的感染流行可能有一个共同的来源,这为制定防治该亚型禽流感流行的有效对策提供了重要的科学依据。