猪精氨酸-丝氨酸蛋白激酸3(SRPK3)基因的克隆、表达及多态性分析

通过对猪SRPK3基因初步的研究,为猪分子遗传育种提供基础分子生物学信息,为猪的遗传育种提供分子标记。以大白猪为实验材料,采用RT-PCR方法克隆了精氨酸-丝氨酸蛋白激酶3 (serine/arginine-rich specific kinase 3,SRPK3) 的全长基因CDS区;采用生物信息学方法分析了SRPK3基因核酸序列并对其所编码的的蛋白序列进行了预测与分析编码蛋白序列的结构特点;采用PCR-SSCP方法对大白猪,野猪,民猪及野家杂交猪的SRPK3基因的多态性进行了检验;采用实时荧光定量PCR (Real-time) 方法检测了SRPK3在1日龄和30日龄大白猪及杜洛克的心脏、肌肉、脾脏、肝脏、肾脏、肺脏、胃、小肠、大肠、脑的表达情况;采用皮下注射的方式构建猪骨骼肌损伤模型用于研究在骨骼肌修复过程中SRPK3基因表达特性。经拼接所得到的1 708bp核苷酸片段,涵盖了SRPK3基因的全长CDS (1 701bp),该基因编码含567个氨基酸片段;蛋白存在两个S_TKc结构域,猪SRPK3蛋白序列与人和牛的相似性较高。PCR-SSCP检测发现第6外显子上A⁶²⁹→G⁶²⁹,T⁶⁵³→T⁶⁵³的突变,氨基酸变化为Pro→His,Ile→Thr;第9外显子处的G¹⁰⁵⁹→ A¹⁰⁵⁹,氨基酸无突变。利用荧光定量PCR研究发现,表达结果显示该基因表达具有组织和种间特异性。SRPK3基因的表达在整个骨骼肌细胞损伤修复过程中逐渐升高。SRPK3基因主要在肌肉和心肌内表达,骨骼肌损伤修复过程中伴随骨骼肌细胞分化SRPK3的表达持续升高,推测其可能与骨骼肌细胞发育相关。     

丝氨酸/精氨酸蛋白特异激酶SRPK2在小鼠睾丸组织中的表达及意义

目的通过研究丝氨酸/精氨酸蛋白特异激酶2(serine/arginine-rich protein specific kinase 2,SRPK2)基因mRNA及其编码蛋白产物在小鼠睾丸组织中的表达特征,探讨该基因在精子发生过程中的作用及意义。方法分别采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹杂交(Western blotting)分析该基因mRNA及蛋白产物在小鼠多种组织中的表达;利用实时定量PCR(real-time quantitative PCR)分析SRPK2 mRNA在不同发育阶段小鼠睾丸组织中的差异表达;应用免疫组织化学染色和间接免疫荧光技术观察SRPK2蛋白在小鼠曲精小管中的细胞定位和生精细胞内的亚细胞定位。结果半定量RT-PCR和Western blotting分析显示SRPK2 mRNA和蛋白在小鼠睾丸组织中均大量表达;实时定量PCR分析发现SRPK2 mRNA在5周及8周龄雄性小鼠睾丸组织中显著表达,具有明显的阶段特异性表达特征。免疫组织化学染色结果表明SRPK2蛋白阳性着色主要位于曲精小管中的长形精子细胞核;间接免疫荧光分析显示SRPK2蛋白定位于长形精子细胞核表面。结论 SRPK2基因在小鼠睾丸组织中大量表达,并且具有显著的阶段特异性表达特征和明确的细胞核定位,极有可能在小鼠精子发生的变态成形期参与mRNA前体分子的剪接过程,其作用机制值得进一步深入研究。     

丝氨酸-精氨酸蛋白激酶对剪接因子调节作用的研究

目的 研究丝氨酸-精氨酸蛋白激酶（Serine＼arginine protein-specific kinase,SRPK)对剪接子在哺乳动物细胞核内定位的调节作用。方法 转染SRPK1和SRPK2的细胞系通过免疫荧光染色在显微镜下观察剪接因子在胞核内的定位,结果在转染了SRPK1和SRPK2的细胞中,SRPK1和SRPK2的绿色荧光信号可见于胞浆及胞核中,剪接因子以核斑点的形式集中在未转染SRPK1和SRPK2的细胞中,而弥散性分布于表达SRPK1和SRPK2的细胞中。结论 SRPK家族蛋白激酶可调节剪接因子在核内的重新分布。     

棘孢木霉丝裂原活化蛋白激酶基因task1的克隆及序列分析

为深入研究丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)的功能,从棘孢木霉(Tricho-derma asperellum)中克隆了丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)基因task1,并对其序列进行分析。该基因编码355个氨基酸,全长1 757 bp,理论分子质量41.1 kD,理论等电点为6.64,与深绿木霉(T.atroviride)MAPK基因tmk1、里氏木霉(T.reesei)MAPK基因tmkA和绿色木霉(T.virens)MAPK基因tmkA在氨基酸和核苷酸水平上同源性都很高,蛋白结构预测为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。     

嗜水气单胞菌丝氨酸蛋白酶基因克隆与序列分析

目的:克隆嗜水气单胞菌丝氨酸蛋白酶(Ahp)基因,进一步分析序列、预测三级结构。方法:设计Ahp基因特异性引物,利用PCR方法扩增基因序列,亚克隆至pMD18-T载体,进行DNA测序及生物信息学分析。结果:获得Ahp基因大小为1 645bp,推导编码548aa,含有天冬氨酸(82-93aa)、组氨酸(123-133aa)和丝氨酸活性位点(342-352aa)。Ahp蛋白三级结构与模板(PDB:3HJR_A)相似性达81.48%,预测60-392aa区域为肽酶S8结构域(PF00082)、480-548aa区域为前蛋白转化酶P结构域(PF01483),其中3个氨基酸活性位点分布于三级结构N端,与拉马钱德兰图检测分析Ahp蛋白的空间结构基本一致。结论:该研究对嗜水气单胞菌Zf1菌株Ahp基因编码蛋白进行结构预测,有助于理解嗜水气单胞菌丝氨酸蛋白酶的作用机理。     

人类SR蛋白超家族新成员——SFRS12(SRrp508)的基因克隆和特性分析

采用生物信息学方法克隆出全长3811bp的人类RC508cDNA片段,经核酸和蛋白质分析为人类新基因（Gen-Bank登记号：AF459094）,利用RT－PCR方法从人类胰脏组织中扩增出包含码508个氨基酸残基最大开放读码框架（ORF）的1680bp cDNA片段,经核酸测序证明与电子克隆结果完全一致。该基因具有启动子和TATA-box,ORF前同一相位有多个终子码,后有加尾信号,显示为客观存在基因。该基因含有12个外显子（96－2093bp)和11个内含子（140－5153bp),定位于人类5号染色体5q11.2-q12.1,无任何连锁基因存在。该基因ORF342－1868（1527）横跨10个外显子,所编码508氨基酸蛋白的全长序列与大鼠丝氨酸－精氨酸二肽富含性（SR）剪切调控蛋白86（1527）横跨10外显子,所编码508氨基酸蛋白的全长序列与全长序列与大鼠丝氨酸－精氨酸二肽富含性（SR）剪切调控蛋白86（SRrp86)高度同源,在核酸和蛋白水平的同源性分别为84％和86％,与其他已知蛋白无论在核酸水平是在氨基酸水平几乎均无整体的同源性。结果表明,所克隆的508氨基酸蛋白才是大鼠SRrp86的人类同源物,从而修正了Barnard(2000)所指出的人类同源物为人类精氨酸富含性核蛋白54（p54)这一论断,并提示它是日益增长的SR蛋白超家族的又一个新成员。该基因组织表达谱广泛,有可能具有转录因子活性,暂命名为SR相关剪切调控蛋白508（SRrp508)。国际人类基因命名委员会已将其命名为丝氨酸－精氨酸二肽含性剪切因子12（splicing factor,arginine/serine-rich),缩写为SFRZS12,化名为DKFZp564B176,SRrp86。     

稻属中一个高度保守和组成型表达酪氨酸／丝氨酸－酸酸双特性蛋白激酶基因的克隆与分析

从水稻中克隆了一个在稻属植物中高度保守和组成型表达的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶基因（OsSTK）。该基因包含两个外显子和一个114bp的小内含子序列,预测编码一个419个氨基酸的蛋白质。该基因推导的氨基酸序列与其它已知序列的一致性均低于52％。利用从不同种和类型的野生稻克隆的部分该基因序列构建的系统树与野生稻的分类和进化关系相一致。OSPKN-端拥有一段富含丝氨酸、碱性氨基酸和带电荷氨基酸的特异性导肽序列,其中包含“GDGDGDGDG”短重复序列。由于该基因蛋白激酶结构域中的VIb,VIII和XI亚结构域中同时具有酪氨酸蛋白激酶和丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶的特性,推测该基因可能同时具有催化酪氨酸和丝氨酸、苏氨酸磷酸化的双重功能。     

稻属中一个高度保守和组成型表达酪氨酸丝氨酸-酸酸双特性蛋白激酶基因的克隆与分析

从水稻中克隆了一个在稻属植物中高度保守和组成型表达的丝氨酸􊄯苏氨酸蛋白激酶基因(OsSTK)。该基因包含两个外显子和一个114 bp 的小内含子序列, 预测编码一个419 个氨基酸的蛋白质。该基因推导的氨基酸序列与其它已知序列的一致性均低于52%。利用从不同种和类型的野生稻克隆的部分该基因序列构建的系统树与野生稻的分类和进化关系相一致。OSPK N-端拥有一段富含丝氨酸、碱性氨基酸和带电荷氨基酸的特异性导肽序列, 其中包含“GDGDGDGDG”短重复序列。由于该基因蛋白激酶结构域中的VIb , VIII 和XI 亚结构域中同时具有酪氨酸蛋白激酶和丝氨酸􊄯苏氨酸蛋白激酶的特性, 推测该基因可能同时具有催化酪氨酸和丝氨酸、苏氨酸磷酸化的双重功能。     

橡胶树炭疽菌蛋白激酶A催化亚基基因的克隆及表达

为了解蛋白激酶A (protein kinase A, PKA)在橡胶树炭疽菌(Colletotrichum siamense)的生长发育和致病性中的功能。本研究利用同源克隆法设计引物,采用PCR和RT-PCR的方法获得炭疽菌(C. siamense)的PKA两个催化亚基PKA-C1与PKA-C2,并基于RSF-Duet载体构建两基因原核表达载体,在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)菌株中表达,利用SDS-PAGE检测蛋白表达情况。结果表明:催化亚基PKA-C1编码498个氨基酸,包含3个内含子;PKA-C2基因编码381个氨基酸,包含2个内含子;两基因均含有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域S_TKc和S_TK_X;聚类分析显示两基因与胶孢炭疽菌(C. gloeosporioides)依赖cAMP蛋白激酶催化亚基序列有高度同源性。SDS-PAGE检测表明目的基因在大肠杆菌中可成功表达,大小符合预期。本研究结果为进一步分析炭疽菌的PKA催化亚基基因功能提供了帮助。     

牛卵巢PRSS35基因CDS序列分析

为测定牛卵巢丝氨酸蛋白酶35 (PRSS35)的CDS序列并进行生物信息学分析。试验根据NCBI上已公布牛PRSS35基因的mRNA序列设计特异性引物,使用RT-PCR技术扩增牛卵泡中PRSS35的CDS序列。结果显示,牛PRSS35基因CDS区序列全长为1 239 bp,共编码412个氨基酸,PRSS35与其他10个物种的同源序列相似性较高,且该蛋白具有一个长度为20个氨基酸的信号肽,具有11个O-糖基化位点和2个N-糖基化位点,以及3个磷酸化位点,并发现有一个典型的Tryp_Spc结构域,即胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶结构域。为进一步研究该基因及其编码蛋白在卵泡发育过程中所起的作用提供了一定的理论依据。     

大熊猫RPS15 cDNA的克隆及序列分析

本研究运用RT-PCR技术,首次从大熊猫 Ailuropoda melanoleuca的肌肉组织总RNA中成功克隆了核糖体蛋白S15 (RPS15)基因的表达序列,并对其进行了初步分析.结果 表明:大熊猫RPS15基因的表达序列全长为442 bp,开放阅读框(ORF)为438 bp,编码145个氨基酸,该蛋白的分子量为17.0401 KDa, 等电点为10.3,含有2个依赖于cAMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位点, 5个蛋白激酶C磷酸化位点,4个N-酰基化位点及1个RPS19蛋白signature位点.进一步分析发现,大熊猫RPS15基因的表达序列及其编码的氨基酸序列与已报道的部分哺乳动物具有很高的相似性.     

内蒙古白绒山羊erk2基因的克隆及表达模式分析

旨在克隆内蒙古白绒山羊erk2基因cDNA并分析其基本表达模式。采用RT-PCR方法克隆白绒山羊erk2基因cDNA。通过在线软件Blast进行核酸序列分析,用SMART与Psite进行氨基酸序列分析。定量RT-PCR检测erk2基因在绒山羊组织中的表达特异性。免疫组化法检测绒山羊睾丸中erk2表达。克隆到的内蒙古白绒山羊erk2基因cDNA片段 (GenBank Accession No.JX569765) 长1 083 bp,包含了编码360个氨基酸残基的全长ORF,氨基酸序列与牛的ERK2 (Bos Taurus BC133588.1) 同源性为100％。SMART分析表明,ORF编码的蛋白包含了活化位点“TEY”及具有丝氨酸/苏氨酸激酶催化活性的S-TKc结构域。Psite分析表明,含2个N-糖基化位点、1个依赖于cAMP/cGMP的蛋白激酶磷酸化位点、3个蛋白激酶c磷酸化位点、5个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、2个N-豆蔻酰化位点、2个异戊二烯基结合区 (CAAX box)、7个微体羧基端靶向信号、2个蛋白激酶ATP结合区标记及一个丝/苏氨酸蛋白激酶活性区域标记。PSORT (k-NN prediction) 程序预测其定位于细胞质中。定量RT-PCR分析显示erk2基因mRNA丰度在心脏、皮肤以及乳腺组织中mRNA丰度较高,脾、肾中的表达相对较低。在睾丸中检测到ERK2蛋白表达。     

禾谷镰孢菌α-微管蛋白基因克隆及其与多菌灵抗药性关系分析

根据禾谷镰孢菌参考菌株NRRL310 84 (PH 1)的α- 微管蛋白基因核苷酸序列设计 4对引物 ,采用PCR方法克隆并测序了禾谷镰孢菌 (Fusariumgraminearum)对多菌灵 (MBC)不同敏感性表型的 6个中国菌株的α 微管蛋白基因全序列。DNA序列对照表明中国的 3个敏感菌株和 3个抗药菌株的α- 微管蛋白基因核苷酸序列同源性没有差异 ,多菌灵抗药性与α- 微管蛋白无关。该基因全长 1718bp ,含有 6个内元 ,编码 4 4 9aa ;与NRRL310 84的α- 微管蛋白基因核苷酸序列同源性为 99% ,存在 5个差异核苷酸 ,与其所编码的氨基酸序列同源性为 99 78% ;与其他 6种真菌α- 微管蛋白基因所编码的氨基酸序列同源性为 37%～ 86 %。     

繁缕核糖体失活蛋白基因克隆及序列分析

采用同源克隆结合RACE法,克隆了繁缕核糖体失活蛋白的全长cDNA,命名为q3(GenBank accession GQ870262)。序列分析结果表明,q3的开放阅读框(ORF)长780 bp,编码259个氨基酸。序列G+C含量为41.5%,与大部分Ⅰ型RIP基因相近。q3编码的蛋白质命名为Q3,理论分子量为28.16 kD,pI为9.44,均与Ⅰ型核糖体失活蛋白相近;包含由23个氨基酸组成的信号肽。功能结构域分析发现,该蛋白含有3个蛋白激酶磷酸化位点、4个络氨酸蛋白激酶磷酸化位点和7个N-肉豆蔻酰化位点。三级结构预测发现,有35.52%的氨基酸残基参与了α螺旋,24.32%的氨基酸残基组成延伸链,40.15%的氨基酸残基随机缠绕其中。基于繁缕及其近缘种核糖体失活蛋白的氨基酸序列构建的系统发育树显示,其结构与经典分类结果基本一致。     

玉米中一种新的蛋白激酶电子克隆与序列分析

目的：电子克隆玉米中一种新的蛋白激酶基因。方法：以拟南芥中一个蛋白激酶的氨基酸序列为探针,对玉米的EST数据库进行同源性检索和筛选并克隆。结果：序列分析显示该cDNA长1121bp,有一个450bp的开放阅读框,编码149个氨基酸,且具有保守苏氨酸/丝氨酸蛋白激酶结构域和TEY基元,说明所克隆的cDNA序列为玉米的MAPK全长cDNA。结论：所克隆的cDNA序列为玉米的MAPK全长cDNA。     

沙葱萤叶甲丝氨酸蛋白酶基因GdSP的克隆及对温度胁迫的响应

【目的】丝氨酸蛋白酶(serine protease,SP)是一类以丝氨酸为活性中心的重要的蛋白水解酶。本研究旨在克隆获得沙葱萤叶甲Galeruca daurica丝氨酸蛋白酶基因,分析其对温度胁迫的响应,以期为进一步揭示沙葱萤叶甲耐温性的调控机制及其他生理功能奠定基础。【方法】根据沙葱萤叶甲2龄幼虫转录组数据,采用RACE技术克隆得到沙葱萤叶甲丝氨酸蛋白酶基因的cDNA全长序列,并进行生物信息学分析;应用qPCR技术检测其在不同温度(-10,-5,0,5,25和35℃)下处理1 h后及25℃下恢复30 min后在沙葱萤叶甲2龄幼虫中的表达量变化。【结果】自沙葱萤叶甲克隆获得一个丝氨酸蛋白酶基因,命名为GdSP(GenBank登录号:MG797556)。该基因全长1 110 bp,开放阅读框969 bp,编码322个氨基酸;蛋白预测分子量35.41 kD,等电点5.61;编码蛋白具有丝氨酸蛋白酶的典型特征,具有一个跨膜结构,无信号肽。同源序列比对和系统发育分析表明,GdSP与光肩星天牛Anoplophora glabripennis SP的同源性最高,氨基酸序列一致性为30.53%。qPCR测定结果表明,不同温度处理间2龄幼虫中GdSP表达量差异不显著,但对各高低温(-10℃除外)胁迫处理回温后GdSP表达量显著上升。【结论】快速冷驯化对沙葱萤叶甲丝氨酸蛋白酶基因表达无显著影响,而回温可诱导其上调表达。     

乌金猪FTO基因的克隆和表达分析

目的:克隆乌金猪脂肪和肥胖相关基因(FTO)编码区序列(CDS),分析其序列组成特征及在乌金猪不同组织中的表达情况。方法:采用反转录PCR方法从乌金猪脂肪组织中克隆FTO基因CDS,利用生物信息学方法分析其序列组成特征;采用实时PCR方法分析乌金猪FTO基因mRNA在不同组织中的表达情况。结果:克隆的FTO基因全长1518 bp(已提交至GenBank数据库,登录号为JQ031263),编码由505个氨基酸残基构成的蛋白,推测的相对分子质量为58.16×103,等电点为5.18;乌金猪与牛、羊、人和大鼠的FTO蛋白的氨基酸序列同源性分别为91%、90%、89%和83%;进化树分析显示,推测的乌金猪FTO蛋白的氨基酸组成与牛、羊的亲缘性较近,其次是人、大鼠;推测的氨基酸组成中无跨膜区,无信号肽,为亲水蛋白;分析发现该蛋白有22个磷酸化修饰位点,包括10个丝氨酸蛋白激酶磷酸化位点、7个苏氨酸蛋白激酶磷酸化位点、5个酪氨酸蛋白激酶磷酸化位点,200、246、302位氨基酸残基有糖基化位点;二级结构预测发现该蛋白共有201个螺旋、33个伸展链和271个卷曲结构;实时PCR检测的组织表达谱表明,FTO基因mRNA在乌金猪肝脏组织中的表达量最高,在脂肪、肾、脾中也有大量表达,在心脏、肌肉中的表达量最少。结论:为深入探讨乌金猪FTO基因的生物学功能奠定了重要基础。     

菌寄生真菌纤细齿梗孢FUS3/KSS1类MAPK基因的克隆和序列分析

采用RACE技术和TAIL-PCR相接合,克隆得到菌寄生真菌纤细齿梗孢的一个丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶基因,命名为omk1(GenBank accesion No.EU479712),其cDNA编码区1068bp,编码355个氨基酸的多肽;omk1基因编码区包含2个内含子,分别长57bp和73bp,内含子边界符合GT-AG规则。序列比对和分析显示该基因属于FUS3/KSS1类MAPK基因;RT-PCR显示该基因在孢子萌发和菌丝生长阶段均表达。该基因的克隆将为进一步研究该菌识别寄主信号的分子机理奠定基础。     

小桐子JcCIPK2基因的克隆与表达分析

钙调磷酸酶B类似蛋白互作蛋白激酶(CBL-interacting protein kinase, CIPK)是一类植物中特有的丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶,参与多种生物和非生物胁迫响应过程。该实验通过RT-PCR克隆了小桐子(Jatropha curcas L.)JcCIPK2基因cDNA全长序列,采用荧光定量qRT-PCR分析JcCIPK2基因在不同组织及不同处理(12℃和1℃低温、42℃高温、30%PEG、250 mmol/L NaCl、150μmol/L ABA)下的表达模式。结果显示:(1)小桐子JcCIPK2基因开放阅读框全长1 398 bp,编码465个氨基酸,相对分子量为52.95 kD,等电点为8.89。(2)蛋白质结构分析表明,JcCIPK2的N端含有位于第11～265个氨基酸之间的丝氨酸/苏氨酸激酶_蔗糖非发酵-1型相关蛋白激酶3催化域STKc_SnRK3,在激酶结构域内还具有激活环(Activation Loop);C端含有位于第316～430个氨基酸之间的CIPK蛋白激酶调控域CIPK_C,其调控域中含有CIPK家族典型的能与CBL特异性结合的NAF结构域,位于第314～369个氨基酸之间。(3)系统进化分析显示,小桐子JcCIPK2蛋白与同属于大戟科的木薯(Manihot esculenta Crantz.)同源关系最近,序列一致性达87%。(4)qRT-PCR分析表明,JcCIPK2基因在小桐子根、茎、叶中均有表达,经12℃和1℃低温处理后,叶片中JcCIPK2基因的表达都呈现先上调后下调表达的趋势,且都在低温处理24 h的表达量最高,与对照相比分别上调了6.0倍和16.72倍;小桐子JcCIPK2基因在42℃高温、30%PEG、150μmol/L ABA、250 mmol/L NaCl处理下也受到不同程度的诱导表达。研究推测,JcCIPK2基因在小桐子对逆境的响应与适应中起重要作用。     

旋毛虫丝氨酸蛋白酶基因的结构与功能分析

目的：运用生物信息学原理,对由旋毛虫新生幼虫（NBL）差减文库调取的新生幼虫期特异性基因进行分析。方法：通过对BLASTn核酸数据库及BLASTp蛋白数据库的相似性检索,登陆PROSITE数据库进行蛋白位点和序列模式分析,并采用AN-THEPROT4.3软件包对其理化特性进行分析。结果：相似性检索及序列模式分析显示,该基因为胰蛋白酶家族丝氨酸蛋白酶的编码基因,并对其编码蛋白的理化特性,疏水性,抗原性,信号肽及其二级结构进行了预测,登陆SWISS-MODEL自动蛋白质同源建模服务器,搜索,优化后预测了其3D结构模型。结论：该期特异性基因为旋毛虫新生幼虫胰蛋白酶家族丝氨酸蛋白酶的编码基因。