家蚕P450基因CYP18A1的克隆、序列分析及转录活性

蜕皮激素对昆虫生长、发育和繁殖有重要调控作用,尤其对蜕皮和变态过程。利用GenBank上登录的蜕皮激素C₂₆羟基化酶候选基因CYP18A1的氨基酸序列对家蚕Bombyx mori全基因组数据库进行BLASTP比对,发现了家蚕直向同源基因(ortholog),其完全编码序列经RT-PCR检测和克隆、测序验证后,再以此为信息探针检索家蚕表达序列标签(expressed sequence tags,EST)数据库进行拼接延伸,获得了一条包括5′非翻译区在内的长度为1 737 bp的cDNA序列,验证结果也表明与电子克隆序列完全一致(GenBank登录号为EF421988,P450命名委员会将其命名为CYP18A1)。该基因的开放阅读框为1 623 bp,编码541个氨基酸,含有包括P450s特征结构域在内的所有昆虫P450基因的5个保守结构域,其推定的分子量为61.67 kD,等电点为 8.54。将该基因cDNA序列与家蚕基因组序列进行比对,结果表明该基因具有6个外显子,5个内含子,外显子／内含子边界符合经典的GT-AG规则。同源性分析也发现家蚕CYP18A1与其他昆虫的直向同源基因具有较高相似性。用RT-PCR方法对家蚕主要发育变态时期与组织进行检测,显示出该基因的转录表达不仅具有时空特异性,而且在表达时期上与已报道的蚕体内蜕皮激素含量变化有紧密的一致性。该研究进一步证实了CYP18A1基因与昆虫体内蜕皮激素代谢平衡相关联。     

一个新的家蚕转录相关锌带蛋白基因的克隆及序列分析

锌带蛋白(zinc ribbon protein )是锌指类蛋白的一种,它的Cys4 Zn(2+)结合位点由3个β₂片层折叠而成,而不是α螺旋结构。锌带结构与锌指结构同为转录因子结合核酸的结构域,锌带蛋白作为转录相关因子在调节基因表达活性等方面具有重要作用。在对家蚕 Bombyx mori蛹cDNA文库测序中,发现一个新的编码家蚕锌带蛋白基因的EST序列（GenBank 登录号DY230964）,以此序列为信息探针检索家蚕EST数据库,通过同源筛选,获得一个新的家蚕锌带蛋白基因cDNA全序列并经RT-PCR检测和克隆、测序验证,结果表明与电子克隆序列完全一致。我们将其命名为 BmZNRD1 (Zinc Ribbon Domain Containing 1)（GenBank登录号DQ432055）。该基因全长为675 bp,由363 bp的开放阅读框序列(ORF)、10 bp的5′端非翻译区序列(5′UTR)和302 bp 的3′端非编码区序列(3′ UTR)组成,其编码的120个氨基酸序列与其他真核生物间具有较高的同源性（达60%左右）,预测分子量为13.54 kD, 等电点为6.8。BmZNRD1编码的氨基酸序列是一种锌带蛋白,推测有2个功能结构域,分别是位于N-端的Cx₂Cx₁₄Cx₂C和C-端的Cx₂Cx₂₄Cx₂C,其中C-端保守氨基酸序列Cx₂Cx₆Yx₃QxRSADEx₂TxFx₂Cx₂C在生物进化中保守性很高,从酵母、果蝇、线虫到两栖类、哺乳类都有发现该结构域的存在,与酵母RNA聚合酶A亚单位9和转录相关蛋白有很高的相似性,推测其具有相同的功能。将BmZNRD1基因cDNA序列与家蚕基因组序列进行比对,结果表明该基因具有3个外显子,2个内含子,外显子/内含子边界符合经典的GT-AG规则。 关键词： 家蚕; 锌带蛋白基因; 电子克隆; 基因克隆; 序列分析     

家蚕MYST组蛋白乙酰转移酶基因Bm-mof的克隆表达和转录活性检测

MYST组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferase, HAT)广泛存在于从酵母到人的真核生物中,在真核生物的转录调控中起着重要的作用。利用NCBI已登录的其他物种该基因的氨基酸序列与家蚕的基因组框架图和表达序列标签（expressed sequence tags, EST）数据库进行电子克隆,获得了家蚕中的同源基因。该基因长1 575 bp（GenBank登录号为DQ442997）,开放阅读框(ORF)长1 326 bp,无内含子。基因编码442个氨基酸,预测蛋白质的分子量为51.4 kD。序列中有HAT核心结构域、锌指结构域和染色质域3个保守的结构域,与其他物种同源基因具有较高的序列相似性。RT-PCR结果表明该基因在本实验所检测的家蚕各时期和组织中均有表达。将该基因用亚克隆的方法导入到pET50b载体中并成功地进行了原核表达,表达出了带有6个组氨酸和1个Nus·Tag标签的重组蛋白。     

家蚕线粒体ND2、COⅠ和若干tRNA基因的克隆及序列分析

克隆并测定了家蚕（Bombyx mori）线粒体基因组3468bp的EcoRⅠ和HindⅢ双酶一段序列,根据序列同源性比较,该DNA片段包括3个蛋白质编码基因：ND2基因、COⅠ基因和COⅡ基因5′端399bp的序列,以及6个tRNA基因和一个尚待确定的tRNA^Met基因。家蚕与果蝇的ND2基因序列同源性约69.7%,COⅠ基因的同源性约83.8%,COⅡ基因5′端的同源性约80％,这表明细胞色素氧化酶基因在物种间比烟酰胺腺漂呤二核苷酸脱氢酶基因保守,6个推定的tRNA基因序列与果蝇相应tRNA基因序列差异较大,另外,除tRNA^Chn基因的二级结构相似外,其它tRNA基因的二级结构与果蝇相应tRNA基因的二级结构也有较大差异。     

人EYA基因家族的克隆、表达及转录活性分析

采用PCR方法从人组织或细胞cDNA文库中扩增Eya基因家族的完整编码序列,将所扩增的基因克隆到带FLAG标签的真核表达载体上,转染人胚肾293T细胞,Western blot鉴定Eya基因家族的表达。检测Eya基因及其与Six基因共转染对MEF3-Luc转录活性的影响。经限制性内切酶分析和DNA序列测定鉴定构建的重组表达载体正确,通过Western blot实验证明Eya基因家族真核表达载体构建成功。荧光素酶活性测定显示Eya能协同Six激活肌细胞生成素的表达。本研究进一步证实Eya是Six的转录共激活因子,能提高肌细胞增强因子的活性。     

家蚕多聚泛素基因的电子克隆、序列分析及表达谱预测

具选择性蛋白质降解功能的泛素在昆虫生长发育过程中起着重要的调控作用。本研究采用电子克隆的方法钓取家蚕基因组中多聚泛素基因序列,命名为Bm-polyUB(GenBank登录号:AADK01019318),并进行序列分析和电子表达谱预测。序列分析表明,该编码区长3426bp,编码1141个氨基酸残基的15聚体,预测分子量和等电点分别为127.97kD和7.33,二级结构中α-螺旋、延伸带、β-转角和无规则卷曲各占17.09%、32.78%、14.37%和35.76%,亚细胞定位于细胞质、细胞核和线粒体各占43.5%、34.8%和21.7%,无前导肽、信号肽和跨膜区;多重序列比对显示,15个泛素单体基因序列间同源性和遗传距离分别介于89.0%～100.0%和0.000～0.120,其中Bm-UB3与Bm-UB10、Bm-UB5与Bm-UB7及Bm-UB10与Bm-UB14的序列相同;遗传多样性分析可见,共检出33个多态性位点,共生成12个单倍型,单倍型多样性(Hd=0.962)、平均核苷酸差异数(K=7.495)、核苷酸多样性(Pi=0.03287)、密码子有效值(ENC=41.62361)、偏爱指标(CBI=0.4960)和χ2检验计算(χ2=0.713)显示泛素单体间遗传多样性较丰富且呈现较强的密码子偏爱性;电子表达谱预测结果表明Bm-polyUB基因在家蚕中高表达的组织和发育阶段所占比例显著高于低表达。本文的研究结果可为进一步开展该基因进化机制、表达特性和生理功能等方面的实验研究提供基础资料。     

家蚕雌激素相关受体基因的克隆与表达分析

【目的】黑腹果蝇 Drosophila melanogaster 雌激素相关受体（estrogen-related receptor, ERR）通过调节糖酵解过程进而控制果蝇的能量代谢。本研究在克隆家蚕Bombyx mori ERR 基因 (BmERR) 的基础上,对其分子特性和系统演化进行生物信息学分析, 并检测该基因在家蚕生殖腺中的表达,为进一步研究ERR功能奠定基础。【方法】采用PCR技术克隆 BmERR 基因的全长cDNA序列,进行生物信息学分析;利用半定量RT-PCR检测该基因在停食后家蚕幼虫生殖腺中的表达情况。【结果】BmERR 基因全长cDNA序列为1 296 bp,编码431个氨基酸残基;具有ERR蛋白家族典型的结构特征;系统进化分析显示BmERR与其他昆虫ERR氨基酸序列一致性较高;半定量 RT-PCR 检测表明,BmERR 在家蚕上簇到化蛾期间的精巢和卵巢中均有表达,表达具有时期特异性,化蛹第1天达到表达高峰。【结论】本研究首次从鳞翅目昆虫中克隆获得ERR cDNA序列。ERR基因在家蚕生殖腺中表达量无明显性别差异,但具有发育时期特异性。     

家蚕浓核病毒 Bm DNV-3(中国株)VD1基因组结构与转录分析

为了进一步认识家蚕浓核病毒BmDNV-3(中国株)VD1基因组的结构和功能,VD1被分离、纯化、克隆到pUC119载体上,完成了基因组全序列的测定。序列分析显示VD1基因组全长为6543个核苷酸,末端拥有224个核苷酸反向重复序列(ITRs)。VD1基因组正链含有3个大的开放阅读框(ORF1-3),负链含有1个大的开放阅读框(ORF4)。比较BmDNV-3的VD1和BmDNV-2(Yamanashiisolate)的VD1基因组全序列,两者同源性为98.4%,并且有107个碱基的替代和1个碱基插入,氨基酸突变集中在VD1ORF3和VD1ORF4。Northern杂交结果显示VD1的左边正链上有1.1kb和1.5kb两个转录本,右边的负链上有一个3.3kb转录本。3′和5′-RACE结果显示1.1kb转录本开始于nt290,结束于nt1437;1.5kb转录本开始于nt1423,结束于nt2931;3.3kb转录本开始于nt6287,结束于nt2922。正链上1.5kb转录本和负链上3.3kb转录本拥有10个核苷酸的3′端的共同序列。研究结果显示该病毒基因转录与已报道的其它浓核病毒存在较大的差异性。     

家蚕滞育激素基因的克隆

利用放射性同位素３２Ｐ－ｄＣＴＰ标记家蚕滞育激素ｃＤＮＡ作为探针,从家蚕基因库大约４×１０~５个噬菌体斑中筛选得到３０个阳性克隆,其中３个克隆具有相同的限制性内切酶图谱,并测知插入ＤＮＡ约１８ｋｂ,用限制性内切酶ＳａｌＩ、ＥｃｏＲＩ切割,进行次克隆。用ＴａｑＤｙｅｐｒｉｍｅｒ序列测定法,得到部分核苷酸序列,经比较,鉴定了这３个克隆确属滞育激素基因。基因组Ｓｏｕｔｈｅｒｎ分析,推定家蚕滞育激素基因属单基因编码。     

家蚕丝蛋白Fhx/P25基因启动子区域的克隆及序列分析

为研究家蚕Fhx/P25基因在时空上的调控机制,通过PCR扩增获得家蚕丝素蛋白Fhx/P25基因的启动子序列并进行克隆和序列分析。进一步构建了由Fhx/P25启动子驱动报告基因DsRed的表达载体pSK-P25-DsRed-PolyA,并通过家蚕BmN细胞进行瞬时表达。结果显示:Fhx/P25基因的启动子序列符合真核生物启动子特点,具有丝腺特异性表达启动子的特征,TATA框的保守序列为TATAA,位于-28—-32处,CAAT基序有3个,其中-110—-117和-90—-87处的2个CAAT基序可能具有活性;二级结构分析显示:Fhx/P25启动子区域具有复杂的茎环结构,这可能与蛋白表达的组织特异性、时间性以及活性有关。基因启动子可以驱动红色荧光基因DsRed在家蚕BmN培养细胞中的瞬时表达。     

家蚕耐氟基因RAPD分子标记的筛选及其克隆

为获得家蚕耐氟基因的分子标记,以家蚕耐氟品种T6和高敏感品种733新为材料,并构建了其近等基因,采用300个随机引物进行RAPD扩增,获得了与家蚕耐氟性有关的一个分子标记,此标记由引物S250扩增得到,并在F2代分离个体中得到验证,证明了此分子标记的可靠性,进而将此标记克隆进T载体pmd-18中,完成测序,分析发现此序列是未有报道的新序列。     

Molecular Cloning and Expression of Two Novel β-N-Acetylglucosaminidases from Silkworm Bombyx mori

β-N-Acetylglucosaminidase is a major glycosidase involved in several physiological processes, such as fertilization, metamorphosis, glycoconjugate degradation, and glycoprotein biosynthesis in insects. A search using the Bombyx mori cDNA database revealed the existence of two putative β-N-acetylglucosaminidase genes. Their full-length cDNAs were cloned by rapid amplification of cDNA ends and polymerase chain reaction using specific primers, and named BmGlcNAcase1 and BmGlcNAcase2. A BLAST search revealed that BmGlcNAcase1 and BmGlcNAcase2 are homologous to a β-subunit homolog encoded by Drosophila melanogaster HEXO2 and the Spodoptera frugiperda β-N-acetylglucosaminidase gene respectively. The recombinant proteins of BmGlcNAcase1 and BmGlcNAcase2 without putative transmembrane domains were expressed in the yeast Pichia pastoris. Both enzymes showed broad substrate specificity, and cleaved terminal N-acetylglucosamine residues from the α-3 and α-6 branches of a biantennary N-glycan substrate, and also hydrolyzed chitotriose to chitobiose.     

家蚕浓核病毒(镇江)株主要结构蛋白基因的克隆及表达

家蚕浓核病毒(Bombyx mori densovirus,BmDNV)是一种昆虫细小病毒.与其它昆虫细小病毒感染昆虫体内多种组织不同,家蚕浓核病毒只感染家蚕中肠上皮组织的圆筒型细胞,感染该病毒细胞的细胞核可以被孚尔根和甲基绿浓染,在病毒感染的早期中肠上皮组织细胞数量增加,形成褶皱,最后感染细胞脱落到肠腔中[1-3].自从20世纪70年代末日本学者证实家蚕浓核病是由于家蚕浓核病毒感染引起的以来[4],已经分离得到了多个病毒株系[5-8].根据它们在血清学、理化特性、品种感受性和病理特征等方面的差异,分为BmDNV-1(伊那株)和BmDNV-2(以山梨株为代表)[8-11].     

家蚕浓核病毒DNV-3（中国株）的VD2基因组序列分析

浓核病毒BmDNV-3(中国株)基因组中含有两种不同的单链线形DNA分子(VD1,VD2)。该病毒的VD2被分离、纯化、克隆到pUC119载体上,并完成了VD2全基因组序列的测定。序列分析显示:VD2全基因组长为6022个核苷酸,末端拥有524个核苷酸反向重复序列(ITRs)。VD2基因组正链含有2个大的开放阅读框,负链含有1个小的开放阅读框。计算机分析推测该基因组正链上开放阅读框(ORF1)及负链上开放阅读框(ORF3)主要编码病毒的非结构蛋白,而正链上开放阅读框(ORF2)主要编码病毒的结构蛋白。比较BmDNV-3 VD2和BmDNV-2(Yamanashiisolate)VD2基因组全序列,两者同源性达97.7%,并且有132个碱基的替代1、1个碱基的删除和2个碱基插入。研究结果显示BmDNV-3 VD2和BmDNV-2 VD2有很近的亲缘关系,但也发生一定的变异,这为更好地理解浓核病毒种类的多样性,也为研究家蚕浓核病毒进化提供了有益的线索。     

家蚕耐氟基因RAPD分子标记的筛选及其克隆

以家蚕耐氟品种T6和高敏感品种733新为材料,并构建其近等基因系,采用300个随机引物进行RAPD扩增,获得了与家蚕耐氟性有关的一个分子标记S207,并在F2代分离个体中得到验证,证明了此分子标记的可靠性,进而将此标记克隆进T载体pUCm-T中,完成了测序,分析发现此序列是新的未有报道的序列。计划下一步将此RAPD标记转化成SCAR标记,建立分子标记辅助育种技术体系。     

家蚕核型多角体病毒山东株p35基因的克隆及序列分析

根据家蚕核型多角体病毒T3株p35基因非编码区序列设计一对特异性引物,应用PCR技术从家蚕核型多角体病毒山东株中扩增得到一条1 080 bp的片段。测序结果表明,该片段含有p35基因,开放阅读框长900 bp,编码299个氨基酸,分子量为34.91kDa,pI=6.4。序列分析表明,BmNPV山东株的p35基因与T3株存在差异。 Abstract:According to the 5′ and 3′ untranslated region sequences of p35 gene from Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus isolate T3,a pair of primers was designed employing computer analysis.With the primers,polymerase chain reaction (PCR) was performed and a 1 080 bp fragment was obtained from BmNPV strain Shandong.Sequencing result showed that it was p35 gene (GenBank accession number：AY157746),and it included an open reading frame of 900 bp,encoding 299 amino acids with Mr=34.91kDa and pI=6.40.BLAST analysis indicated that there were seven bases and three amino acids difference between p35 from BmNPV strain Shandong and that from BmNPV isolate T3.     

家蚕细胞凋亡相关基因BmICAD的克隆、序列和功能分析及其在精巢中特异表达的初步研究

DREP-1基因在果蝇的细胞凋亡过程中对DNA的降解有重要调控作用。本研究将该基因序 列在家蚕EST数据库中进行同源性检索,把检索到的EST序列进行电子延伸和克隆重叠群拼接,根据拼接结果设计引物进行PCR扩增并克隆测序验证,首次成功克隆了家蚕第一个ICAD基因BmICAD的cDNA： 该cDNA全长844 bp,ORF长522 bp, 编码含有174个氨基酸的蛋白;预测分子量为19.6kD,等电点为4.23,所编码蛋白与果蝇DREP-1的一致性(identity)为36%;虽然Northern印记杂交未检测到信号,但是RT-PCR结果显示,该基因在精巢中特异表达。     

Cloning and Characterization of the cDNA Encoding the Masquerade-like Serine Proteinase Homologue Gene of the Silkworm, Bombyx mori

ABSTRACT From Bombyx mori larvae, RT-PCR and cDNA library screening isolated masquerade-like serine proteinase homologue cDNA gene, proposed to be related to insect immunity and its characteristics were examined. The isolated gene is composed of 1.3 kb of nucleotide and 420 amino acid residues were encoded. According to the results of database search, the isolated gene showed high sequence homology with Holotrichia and Tenebrio's 45 kDa protein, Drosophila CG5390 gene. Moreover, it is composed of regulatory domain and catalytic domain, which is characteristic of serine proteinase that can be found in the insect immune reaction and embryonic development processes. Enzyme activation site by proteolytic cleavage and the sequence of three amino acids participate in the catalytic triad of enzyme and 14 cystein residues used in disulfide bridges are well conserved with the compared genes. The mRNA expression was increased following E. coli injection and constitutive expression was also observed before injection by Northern blot analysis.