纳豆激酶酶原基因和纳豆激酶基因的克隆及在大肠杆菌中表达

目的：构建可高效生产有活性的纳豆激酶的大肠杆菌工程菌。方法：将纳豆激酶酶原（pro-nattokinase,pro-NK)基因和纳豆激酶（natokinase,NK)基因,并分别克隆到表达融合蛋白的高效表达载体pJN上,构建出表达质粒pJNK1和pJNK2,并转化大肠杆菌BL21（DE3）。结果：IPTG诱导下,两个融合蛋白的表达量均达到30%,活性检测显示表达纳豆激酶酶原融合蛋白的菌株pJNK-1(BL)诱导后菌体破碎上清的溶栓活性比表达纳豆激酶融合蛋白的菌株pJNK-2(BL)高2-3倍,结论：纳豆激酶酶原融合蛋白部分自减切产生纳豆激酶成熟肽。     

同源重组法构建枯草芽孢杆菌转酮酶缺失突变菌株

采用同源重组法高效构建枯草芽孢杆菌转酮酶(tkt)缺失突变株。以大肠杆菌(E.coliDH5α)质粒pBlUSKM为框架,构建出基于枯草杆菌(B.S104)tkt基因位点的整合载体pb-Trs-n,将此载体重组到Bacillus subtilis104中,从新霉素抗性平板上挑取转化子,整合载体pb-Trs-n的测序结果与Kunst.F报道的tkt基因高度同源(98.9%)。同源重组后,B.S104染色体上的tkt基因(2 004bp)部分与载体pb-Trs-n的neo基因(1 197bp)发生了同源交换,确定了该转化子为枯草芽孢杆菌转酮酶缺失突变株(tkt-,neo),该方法构建枯草芽孢杆菌转酮酶(tkt)缺失突变株是可行的,为D-核糖工程菌的研究奠定了基础。     

极端耐热木聚糖酶基因在枯草芽孢杆菌中的整合表达

目的:为了在枯草芽孢杆菌中整合表达极端耐热木聚糖酶。方法:将嗜热网球菌(Dictyoglomus thermophilum)Rt46B.1的极端耐热木聚糖酶基因xynB通过穿梭载体pDL整合到B.subtilis168染色体上,使其实现表达。结果:极端耐热木聚糖基因在枯草芽孢杆菌中成功整合并表达。结论:基因工程菌B.subtilis168-xynB能外泌表达极端耐热木聚糖酶,且表达水平为0.732IU/mL,比在大肠杆菌中的高。酶学性质表明,此酶分子量约为24kD,其最适反应温度为85℃,最适反应pH值为6.5,且在弱碱性条件下稳定。     

地衣芽孢杆菌α—淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的诱导表达

采用PCR技术扩增了sacB基因的启动子-信号序列,并将扩增的序列重组进含地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因的质粒载体上构建了含α-淀粉酶基因的分泌型表达载体pSA60。将pSA60转化枯草芽孢杆菌QB1098后,α-淀粉酶基因在sacB基因启动子-信号序列的调控和蔗糖的诱导下获得表达,表达产物分泌至胞外。     

枯草芽孢杆菌纳豆亚种后生元的健康促进作用

枯草芽孢杆菌纳豆亚种是一种食用历史悠久的益生菌,其安全性和健康促进作用已在人群和临床应用上得到很好的证明。特殊的培养、灭活及膜过滤等技术可以利用枯草芽孢杆菌纳豆亚种发酵产生多种后生元成分,如菌体壁、胞外多糖、纳豆激酶、维生素K₂和γ-多聚谷氨酸等,这些后生元成分可赋予枯草芽孢杆菌纳豆亚种益生菌潜力。枯草芽孢杆菌纳豆亚种后生元具有重要的健康促进功能,如整肠通便、促进消化、预防和溶解血栓、降血压、促进骨骼钙吸收、降尿酸及抑菌消炎等。本文从后生元的定义出发,探讨枯草芽孢杆菌纳豆亚种后生元的制备方法、功能成分及可能的健康促进作用。

     

基于RNA-seq分析bdhA敲除对枯草芽孢杆菌产纳豆激酶和MK-7的影响

纳豆激酶(nattokinase, NK)具有多种生理功能,是治疗心血管疾病的理想药物。甲萘醌-7 (menaquinone-7, MK-7)是人体不可缺少的脂溶性维生素之一,可预防骨质疏松和帕金森等疾病。【目的】提高枯草芽孢杆菌中NK和MK-7共同生产的产量,揭示重组菌中共同生产NK和MK-7的机理,为MK-7和NK的生成提供新的代谢工程策略。【方法】以枯草芽孢杆菌为出发菌株,敲除2,3-丁二醇脱氢酶基因(bdhA),构建一株能增加NK和MK-7共同生产的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 168-ΔbdhA。利用RNA-seq分析NK和MK-7合成途径关键酶编码基因的变化,总结NK和MK-7共同生产的机制。【结果】与原始菌株相比,Bacillus subtilis 168-ΔbdhA中2,3-丁二醇含量降低64.0%,为2.76 g/L。NK和MK-7的产量较原始菌株提高30.0%和60.0%。RNA-seq分析表明,中心碳代谢、氧化磷酸化和NK及MK-7合成等过程相关的基因表达存在差异。NK负调控因子codY下调2.19倍。在蛋白质分泌途径中,secA下调0.37倍,tatAD和tatC分别上调2.81倍和0.50倍。【结论】bdhA的敲除阻断了2,3-丁二醇的碳通量,促进甘油的吸收,碳通量更多地流向NK和MK-7的合成途径。负调控因子codY的下调促进NK转录,蛋白转运相关途径基因的上下调促进MK-7的胞外分泌,从而实现其产量的增加。     

枯草芽孢杆菌bgIS基因在酵母染色体上整合

将枯草杆菌β－１,３－１,４－葡聚糖酶基因（ｂｇＩＳ）２．７ｋｂＥｃｏＲＩ片段和酵母染色体ｒＤＮＡ片段克隆到整合型不含酵母自主复制序列（Ａｕｔｏｎｏｍｕｓｌｙ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）的大肠杆菌／酵母菌穿梭质粒ＹＩＰ５上,构建成ＹＩＰ５－ｂｇＩＳ－ｒＤＮＡ的杂种质粒ＰＣＺＨ,转化Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ并得到表达。稳定性测定表明,Ｙ３３（ＰＣＺＨ１０１）和Ｙ３３（ＰＣＺＨ１０４）     

纳豆激酶基因的克隆及其在枯草杆菌中的表达

为研究纳豆激酶（nattokinase,NK)的生物化学性质,以纳豆芽胞杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增包含启动子及3‘端非翻译区的纳豆激酶全长基因序列。经鉴定后构建大肠杆菌－枯草杆菌穿梭表达质粒pBLNK,转化蛋白缺陷型枯草杆菌,筛选表达菌株。表达株培养15h后收集培养上清液,SDS－PAGE分析证实表达产物后,用超滤浓缩、分子筛、离子交换等步骤分离纯化重组NK,每升发酵液得纯度达95％的重组NK约100mg,比活性达12000u/mg。     

枯草杆菌DC-2纳豆激酶基因的克隆及其融合蛋白在E.coli中的表达

纳豆激酶是一种纤维蛋白溶解酶 ,有望开发成为新型的溶栓药物 .从中国豆豉中分离的具有较强纤溶活性的枯草杆菌DC 2中提取总DNA ,根据纳豆激酶 (NK)基因序列设计引物 ,用PCR法扩增NK基因 .序列分析表明 ,NK基因成熟肽编码区含有 82 5bp ,编码 2 75个氨基酸残基 ,与文献报道的序列分别有 93 4 %和 94 5 %同源性 .将NK基因插入载体pGEX 4T1构建表达质粒pGEX NK ,转化大肠杆菌JM10 9后 ,经 1mmol LIPTG诱导 4h ,发现大量NK融合蛋白表达 ,并形成包涵体 .SDS PAGE分析表明 ,NK融合蛋白作为包涵体的分子量为 5 3kD .凝胶自动扫描结果显示 ,NK融合蛋白约占菌体可溶性蛋白的 2 6 % .     

枯草杆菌谷氨酰胺转胺酶的克隆及其在大肠杆菌中的融合表达

利用PCR技术 ,从枯草杆菌DB40 3染色体上扩增出谷氨酰胺转胺酶基因 ,将其克隆到大肠杆菌载体pET32a( + )中 ,成功构建谷氨酰胺转胺酶表达载体pET32-BTGase ,并转化大肠杆菌BL2 1 (DE3)。重组克隆在IPTG诱导下 ,表达出硫氧还蛋白 谷氨酰胺转胺酶 (Trx-BTGase)融合蛋白 ,表达量占细菌总蛋白量的 2 6%。利用金属螯合层析纯化菌体裂解上清中表达的融合蛋白 ,纯度超过 80 %,再通过分子筛层析进一步纯化得到融合蛋白纯品。酶活性分析表明表达的Trx-BTGase融合蛋白具有交联蛋白的活性 ,并发现Trx-BTGase融合蛋白和经凝血酶酶切后得到的BTGase单体都能催化牛血清白蛋白的聚合反应     

巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶基因在枯草杆菌中的高表达

用ＰＣＲ方法从巨大芽孢杆菌的基因组ＤＮＡ中扩增到青霉素Ｇ酰化酶基因,并装载到枯草杆菌质粒ｐＰＺＷ１０３中,将其转化到枯草杆菌ＤＢ１０４中进行了分泌表达,重组菌株产酶无需苯乙酸诱导。在３７℃培养２４ｈ,菌液酶活力可达６ｕ／ｍｌ。１０天的连续传代实验表明重组菌株的稳定性很高。     

产嘌呤核苷的枯草杆菌prsA基因在大肠杆菌中的表达

为了克隆产嘌呤核苷的枯草杆菌prsA基因。用PCR扩增的方法,从产肌苷的枯草杆菌Bacillus subtilis JSIM-1019中克隆出一个长1kb长的DNA片段,经功能检测,证明正向插入片段与大肠杆菌的磷酸核糖焦磷酸营养缺陷特性（PREP-）能够营养互补。含有该重组质粒的PRPP缺陷大肠杆菌JSIM—DH-27在基本培养基上的能够生长。     

Molecular Cloning of the Transglutaminase Gene from Bacillus subtilis and Its Expression in Escherichia coli

We cloned and characterized a gene, tgl, encoding transglutaminase in Bacillus subtilis. The tgl gene contained a open reading frame 735-nucleotides long that encoded a 245-residue protein with the molecular weight of 28,300. The deduced amino acid sequence had little sequence similarity with sequences of other transglutaminases from a Streptoverticillium sp. or from mammals. The -10 and -35 regions of a putative promoter resembled the consensus sequence for the σ^K-dependent promoter. In addition, a sequence similar to the consensus sequence for the GerE binding site was found upstream from this region. These findings suggested that tgl was transcribed in the mother cells during a late stage of sporulation. Evidence for this suggestion was that transglutaminase activity was detected in sporulating cells during the same stage. Transglutaminase activity was detected in Escherichia coli cells transformed with a plasmid for expression of the tgl gene.     

纳豆激酶基因的克隆与表达

利用ＰＣＲ方法从分泌纳豆激酶的枯草杆菌基因组ＤＮＡ 中扩增得到了纳豆激酶基因,并测定其核苷酸序列．利用基因重组技术构建了纳豆激酶基因的表达载体,并在大肠杆菌中进行了表达．ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳表明,表达蛋白占菌体蛋白的１５．２％ ,琼脂糖－纤维蛋白平板法测出表达产物具有溶解血栓活性．     

枯草杆菌中性蛋白酶基因在大肠杆菌中的表达

蛋白酶是枯草杆菌(Bacillus subtilis)产生的具有重要工业价值的水解酶。对蛋白酶基因的分离与高效率表达一直是基因工程研究领域的重要内容之一^[1-4]。蛋白酶基因的筛选可采用不同的方法,如“免疫法”、“DNA 杂交法”、“遗传互补法”等。大肠杆菌(Escherichia coli)是基因工程中最常用的宿主菌, 若能以E．Coli作为筛选蛋白酶基因的宿主苗,那么使用E．Coli的常规载体,便可直接获得完整的蛋白 酶基因。枯草杆菌的蛋白酶基因能否在大肠杆菌中表达．则是实现这一目标的关键。Koide等人^[5]报道过枯草杆菌的胞内丝氨酸蛋白酶基因在大肠杆菌中的表达。转化细胞在含有脱脂牛奶的平板上可产生十分微弱的水解圈。Ikeraara等人^[6]将Subtilisin E(枯草杆菌蛋白酶E)插人大肠杆菌的表达载体,具有活性的Subtilisin E便可分泌到大肠杆菌的细胞周质中。吴汝平撰文指出^[7]。克隆的枯草杆菌蛋白酶基因不能在大肠杆菌中表达。是因为大肠杆菌不能转录枯草杆菌的促使生长调节基因。Wang等人^[8]则认为,在大肠杆菌中观察不到野生型的中性蛋白酶基因E(nprE)的表达。是因为nprE的表达产物对大肠杆菌有致死作用．除去该基因上的核糖体结合位点,nprE便能在大肠杆菌中低水平表达,并能将表达产 物分泌至胞外。由上可知．枯草杆菌的蛋白酶基因能否在大肠杆菌中表达以及表达的位置仍然是一个众说纷纭的问题,这一问题也正是能否用大肠杆菌作为宿主菌筛选蛋白酶基因的关键。     

血红蛋白基因在枯草芽孢杆菌中的表达及其作用的研究

革兰氏阴性菌Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ的血红蛋白与氧结合力强,能降低该菌需氧量。将该血红蛋白的结构基因（Ｖｇｂ）连接到枯草杆菌质粒ｐＡＫ４的β－内酰胺酶基因（ｂｌａ）启动子下（框架正确）,构建了重组质粒ｐＡＶ,并将此质粒先转化至枯草杆菌ＤＢ１０４,继而又转化到枯草杆菌碱性蛋白酶工程菌Ｇ３３１和产木聚糖酶枯草杆菌Ｂ５３。经酶切和电泳分析显示转化的质粒ＤＮＡ含有大小与Ｖｇｂ相同的电泳带,又经非放射性同位