从南方红豆杉中筛选和鉴定25株产紫杉烷的内生真菌

为从南方红豆杉(Taxus chinensis var.mairei)中分离产紫杉烷的内生真菌,从其幼茎、树皮和叶片中分离纯化了491株内生真菌,经筛选获得25株内生真菌具有产紫杉烷的能力,其中,4株可产紫杉醇、巴卡亭Ⅲ和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ,8株能产紫杉醇和巴卡亭Ⅲ,1株能产紫杉醇和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ,1株能产巴卡亭Ⅲ和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ,6株仅产紫杉醇,5株仅产巴卡亭Ⅲ。根据内生真菌的来源,幼茎中有11株产紫杉烷的内生真菌,叶片中有9株,而树皮中仅有5株。这些菌株的紫杉醇、巴卡亭和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ产量分别为0.64~9.87、0.48~3.42和0.20~1.00μg L~(–1)。因此,南方红豆杉中具有紫杉烷类代谢途径的内生真菌来源广,数量多,是研究真菌中紫杉烷类化合物代谢途径的良好材料,也为紫杉烷类抗癌药生产提供了潜在的真菌种源。     

蔓地亚红豆杉3′-N-去苯甲酰-2-脱氧紫杉醇苯甲酰转移酶基因的克隆与序列分析

3′-N-去苯甲酰-2-脱氧紫杉醇苯甲酰转移酶(DBTNBT)是催化紫杉醇生物合成最后一步反应所需要的酶,负责将带有不完全侧链的紫杉醇前体催化形成紫杉醇。利用蔓地亚红豆杉的总DNA和总RNA为模板,采用PCR和RT-PCR技术克隆出DBTNBT基因的DNA序列和cDNA序列,测序结果显示长度分别为1465bp和1362bp,编码438个氨基酸的多肽。同源性比较分析结果表明,其碱基序列与已经报道的蔓地亚红豆杉的DBTNBT基因的一致性为99%,其氨基酸序列与已经报道的蔓地亚红豆杉的DBTNBT氨基酸序列的一致性为96%。DNA序列和cDNA序列比对发现该基因含有1个内含子。利用SWISS-PROT、DNAMAN等生物信息学工具对其蛋白序列进行了分析,为利用基因工程的方法生产紫杉醇或其前体物质提供了分子基础。     

大孔吸附树脂提取7-木糖-10-去乙酰紫杉醇酶解产物10-去乙酰紫杉醇

本研究利用大孔树脂富集7-木糖10-去乙酰紫杉醇的酶解产物10-去乙酰紫杉醇.首先以10-去乙酰紫杉醇(10-DAT)绝对含量为指标,通过HPLC测定比较HP20、XAD4、XAD16、XAD1600四种大孔树脂对10-去乙酰紫杉醇的吸附与解吸性能力,筛选出最佳树脂XAD1600进行实验.最佳的吸附解吸条件为:树脂柱高径比10:1,吸附流速20 mL/min,吸附量23.85 mg/mL,以6倍柱床体积的90%乙醇为洗脱液,洗脱流速20 mL/min.经XAD1600型树脂富集后10-去乙酰紫杉醇回收率达96.5%,含量20.5%.且树脂柱重复使用3次后,其吸附能力仅降低5%.     

南方红豆杉枝叶中药用抗癌活性物质含量

通过高效液相色谱（HPLC）,测定了人工栽培南方红豆杉枝叶中药用抗癌活性物质紫杉醇（taxol）、三尖杉宁碱（cephalomannine）和人工半合成紫杉醇的主要原料巴卡亭Ⅲ（baccatin Ⅲ）、10 去乙酰基巴卡亭Ⅲ（10-deacetylbaccatin Ⅲ,10-DAB）在一个生长季的含量变化.研究表明：从4月新枝叶萌发至11月枝叶基本停止生长,南方红豆杉枝叶中紫杉醇等药用活性物质含量季节性变化明显.其中紫杉醇和三尖杉宁碱含量的最高值都出现在5月;巴卡亭Ⅲ和10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ含量的最高峰值分别出现在9月和4月.相关分析发现,南方红豆杉枝叶中4种药用活性物质之间有很好的相关性,其中紫杉醇与三尖杉宁碱含量呈显著正相关(P<0.05),三尖杉宁碱含量与10-去乙酰巴卡亭Ⅲ含量呈显著负相关(P<0.05).     

产紫杉醇内生真菌N-15的分离及鉴定

产紫杉醇内生真菌的研究是解决紫杉醇药源紧缺问题的重要途径之一。本研究主要报道了从南方红豆杉树皮的内表皮中筛选得到一株产紫杉醇的内生真菌N-15,高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)检测结果表明其提取物具有与紫杉醇及其前体巴卡亭Ⅲ、10-去乙酰巴卡亭Ⅲ标准品一致的色谱特征峰和保留时间,表明真菌N-15可以产紫杉醇及其两个前体物。质谱法(mass spectrometry,MS)检测结果表明,N-15的发酵液提取物具有和紫杉醇标准品相同质谱特征峰,进一步说明N-15可以产紫杉醇。通过结合形态特征观察和18S rRNA序列分析,将N-15初步确定为黑孢霉属(Nigrospora sp.)真菌。     

南方红豆杉紫杉烷13α-羟化酶基因的克隆及序列分析

目的:紫杉烷13α-羟化酶是紫杉醇下游合成途径关键酶之一,负责催化紫杉二烯-5α-醇的C13侧链发生羟基化反应生成紫杉二烯-5α、13α-二醇.该研究从南方红豆杉中克隆出紫杉烷13α-羟化酶基因并对其序列进行生物信息学分析.方法:利用南方红豆杉的总DNA和总RNA为模板,采用PCR和RT-PCR技术克隆出紫杉烷13α-羟化酶基因的DNA序列和cDNA序列,利用swiss-prot、DNAMAN等生物信息学工具对其核酸序列和蛋白序列进行分析.结果:测序结果显示其cDNA序列长度为1 651bp,含有一个1 458bp的开放阅读框,同源性比较分析结果表明,其氨基酸序列与已经报道的蔓地亚红豆杉的紫杉烷13α-羟化酶氨基酸序列的一致性为96%.结论:成功克隆出南方红豆杉紫杉烷13α-羟化酶基因,为利用合成生物学工程技术生产紫杉醇或其前体物质提供了分子基础.     

巴卡亭ⅢC-10位乙酰基水解酶产生菌的筛选和鉴定

10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ是合成紫杉醇和多烯紫杉醇的前体.以巴卡亭Ⅲ为底物,结合TLC、HPLC、HPLC-MS分析方法,通过设计专门的筛选方法筛选产酶菌株,得到一株巴卡亭ⅢC-10位脱乙酰基酶产生菌株Z1-34.以形态特征、生理生化特征、16S rDNA序列分析作为菌株的鉴定手段,Z1-34被鉴定为稻草假单胞菌(Pseudomonas straminea),首次发现稻草假单胞菌产生巴卡亭ⅢC-10-脱乙酰酶.     

云南红豆杉紫杉烷2α-O-苯甲酰转运酶基因的克隆及定性

通过RACE技术,克隆了云南红豆杉紫杉烷2α-O-苯甲酰转运酶基因(TyTBT),该酶催化2-去苯甲酰-7,13-二乙酰巴卡亭Ⅲ生成7,13-二乙酰巴卡亭Ⅲ,是紫杉醇合成途径中的关键酶之一.TyTBT基因cDNA全长1481 bp,含有1 320 bp的开放读码框,编码440个氨基酸的多肽,分子量为50 050 Da,等电点为6.17.氨基酸序列比对表明TyTBT同植物酰化酶家族的其它成员有较高的相似性,超过67%,同东北红豆杉和曼地亚红豆杉的紫杉烷2α-O-苯甲酰转运酶氨基酸序列的一致性和相似性达到最高,分别为95%和96%.广泛地比对分析证明这种较高的相似性在红豆杉属的其它酶家族中具有普遍性,进化树分析表明同东北红豆杉和曼地亚红豆杉的紫杉烷2α-O-苯甲酰转运酶(TBT)的相似性高于紫杉醇合成途径中的其它酰化酶.     

紫杉醇生物合成相关酶基因的克隆与表达

以牛儿基牛儿基二磷酸为前体的紫杉醇生物合成大约有20步酶促反应,其反应过程已基本阐明,近一半的相关酶基因已得到克隆与表达。综述了编码参与紫杉醇生物合成的紫杉二烯合酶、紫杉二烯5α羟化酶、紫杉烷10β羟化酶、紫杉烷13α羟化酶、紫杉二烯5α醇O乙酰基转移酶、紫杉烷2α苯甲酰转移酶、去乙酰基巴卡亭Ⅲ10βO乙酰转移酶、3氨基3苯基丙酰转移酶和3N去苯甲酰2脱氧紫杉醇苯甲酰转移酶等9个酶基因的克隆和表达方面的研究情况,并指出随着紫杉醇生物合成的分子生物学研究的不断深入,利用分子生物技术大规模生产紫杉醇将为期不远 。     

一株能水解巴卡亭ⅢC-10位乙酰基的成团泛菌的筛选和鉴定

10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ是合成紫杉醇和多烯紫杉醇的前体。以巴卡亭Ⅲ为底物,结合TLC、HPLC、HPLC-MS分析方法,通过设计专门的筛选方法筛选产酶菌株,得到一株巴卡亭ⅢC-10位脱乙酰基酶产生菌株Z1-56。以形态特征、生理生化特征、16S rDNA序列分析作为菌株的鉴定手段,Z1-56被鉴定为成团泛菌(Pantoea agglomerans),首次发现成团泛菌产生巴卡亭ⅢC-10-脱乙酰酶。     

不同地理种源南方红豆杉中紫杉醇和10-DAB含量及影响因子

选择福建省梁野山、龙栖山、闽侯旗山、南靖书洋乡和南平大坪村南方红豆杉(Taxus chinensis var.marei)天然群体分布相对集中区,采集胸径相同的南方红豆杉的当年生针叶和树皮并取树下土壤样品.利用超高效液相色谱分析测定南方红豆杉当年生针叶及树皮中紫杉醇及10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ(10-deacetylbaccatin Ⅲ,10-DAB)含量,另测定土壤pH值、速效磷、速效氮、铁、钙、镁、锌含量.结果表明,不论是紫杉醇还是10-DAB含量,不同地理种源南方红豆杉间差异均较大,说明地理位置对于红豆杉中紫杉醇和10-DAB含量具有明显的影响;树皮中紫杉醇含量与土壤中铁含量显著相关(P<0.01);南方红豆杉当年生针叶中及树皮中紫杉醇含量与各种源地气象因子的相关性不显著(P>0.05).     

南方红豆杉枝叶中6种紫杉烷类化合物含量季节变化

紫杉醇(taxol)是主要来源于红豆杉属植物的一种天然抗肿瘤药物,紫杉烷(taxane)是紫杉醇的代谢前体或支路代谢产物,同样具有开发成为抗肿瘤新药的潜质。本文采用高效液相色谱法研究了紫杉醇(Taxol)、10-去乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DAB)、7-木-10-去乙酰紫杉醇(7-xyl-10-DAT)、10-去乙酰紫杉醇(10-DAT)、三尖杉宁碱(CE)和7-表-10-去乙酰紫杉醇(7-epi-10-DAT)6种紫杉烷类化合物在南方红豆杉枝叶中含量的季节变化,结果显示Taxol和10-DAT在8、9月份含量最低,10-DAB和7-xyl-10-DAT在8、9月份含量相对最高,Taxol含量季节变化和10-DAB呈负相关,与CE呈显著正相关。7-xyl-10-DAT含量季节变化和10-DAB、10-DAT分别呈正相关。本文为研究南方红豆杉中紫杉醇及相关紫杉烷的代谢、积累规律提供了依据,不但有助于阐明紫杉醇的生物合成的关键步骤及调控的生理机制,而且对红豆杉资源的深度开发具有指导意义。     

一株产紫杉醇内生真菌YN6的分离及鉴定

从云南红豆杉（Taxus yunnanensis）树皮内表皮中分离得到75株内生真菌,采用基于紫杉醇合成关键酶10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10-O-乙酰基转移酶（10-deacetylbaccatin Ⅲ-10-O-acetyl transferase,DBAT）和C-13苯丙氨基侧链CoA乙酰基转移酶（C-13-phenylpropanoid side chain-CoA acyltransferase,BAPT）基因为标志分子的快速筛选方法获得一株可产紫杉醇的内生真菌YN6,并通过高效液相色谱法和质谱法对其紫杉醇进行分析.同时,通过对内生真菌YN6的形态特征分析以及18S rDNA序列分析将其初步鉴定为拟盘多毛孢属（Pestalotiopsis sp.）真菌. 拟盘多毛孢YN6的紫杉醇产量约为120~140 μg/L,是目前已报道的紫杉醇产量较高的野生菌株之一. 拟盘多毛孢YN6的发现为微生物发酵生产紫杉醇提供了潜在的优良种质资源.     

谷子叶绿体乙酰辅酶A羧化酶cDNA的克隆和禾本科除草剂靶位点的序列分析

乙酰辅酶A羧化酶是一个生物素羧化酶,它所催化的反应是脂肪酸生物合成中的第一个植物叶绿体中的乙酰辅酶A羧化酶是两类禾本科除草剂的靶蛋白.从抗除草剂拿捕净和感拿捕净的谷子(SetariaitalicaBeauv.)中克隆了两个乙酰辅酶A羧化酶的全长cDNA,分别命名为foxACC-R和foxACC-S,它们推导的蛋白质均编码2 321个氨基酸,然而在第1 780个氨基酸处,foxACC-R编码亮氨酸,而foxACC-S编码异亮氨酸.采用生物信息学方法,我们推断这个cDNA编码的是叶绿体中的乙酰辅酶A羧化酶,并预测了它的功能域和保守区.通过这两个cDNA编码的氨基酸序列与其他乙酰辅酶A羧化酶的序列比较得出结论,亮氨酸/异亮氨酸位点可能是APPs和CHDs两类除草剂作用的关键位点.Southern杂交分析的结果显示,该基因在谷子基因组中只有一个拷贝.     

谷子叶绿体乙酰辅酶A羧化酶cDNA的克隆和禾本科除草剂靶位点的序列分析

乙酰辅酶A羧化酶是一个生物素羧化酶,它所催化的反应是脂肪酸生物合成中的第一个关键步骤。禾本科植物叶绿体中的乙酰辅酶A羧化酶是两类禾本科除草剂的靶蛋白。从抗除草剂拿捕净和感拿捕净的谷子(Setaria italicaBeauv.)中克隆了两个乙酰辅酶A羧化酶的全长cDNA,分别命名为foxACC-R和foxACC-S,它们推导的蛋白质均编码2 321个氨基酸,然而在第1 780个氨基酸处,foxACC-R编码亮氨酸,而foxACC-S编码异亮氨酸。采用生物信息学方法,我们推断这个cDNA编码的是叶绿体中的乙酰辅酶A羧化酶,并预测了它的功能域和保守区。通过这两个cDNA编码的氨基酸序列与其他乙酰辅酶A羧化酶的序列比较得出结论,亮氨酸/异亮氨酸位点可能是APPs和CHDs两类除草剂作用的关键位点。Southern 杂交分析的结果显示,该基因在谷子基因组中只有一个拷贝。     

不同地理种源南方红豆杉中紫杉醇和10-DAB含量及影响因子

选择福建省梁野山、龙栖山、闽侯旗山、南靖书洋乡和南平大坪村南方红豆杉（Taxus chinensis var. marei）天然群体分布相对集中区,采集胸径相同的南方红豆杉的当年生针叶和树皮并取树下土壤样品。利用超高效液相色谱分析测定南方红豆杉当年生针叶及树皮中紫杉醇及10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ（10-deacetylbaccatin Ⅲ, 10-DAB）含量,另测定土壤pH值、速效磷、速效氮、铁、钙、镁、锌含量。结果表明,不论是紫杉醇还是10-DAB含量,不同地理种源南方红豆杉间差异均较大,说明地理位置对于红豆杉中紫杉醇和10-DAB含量具有明显的影响;树皮中紫杉醇含量与土壤中铁含量显著相关（P＜0.01）;南方红豆杉当年生针叶中及树皮中紫杉醇含量与各种源地气象因子的相关性不显著（P＞0.05）。     

胸径、构件和季节对南方红豆杉中紫杉醇和10-DAB含量的影响

系统采集了12个不同胸径的南方红豆杉当年生针叶和树皮样品,用超高效液相色谱(UPLC)测定其紫杉醇(taxol)和10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ(10-deacetylbaccatin Ⅲ,10-DAB)含量,结果显示针叶的两种被测试物质含量的平均值分别为0.0127mg·g-1和0.0805mg·g-1,树皮的这两种物质含量平均值分别为0.1164mg·g-1和0.4842mg·g-1。当年生针叶、树皮中紫杉醇含量与胸径相关性不显著。对植株不同构件(枝条、针叶、树皮和根)中紫杉醇和10-DAB含量的测定表明,根中紫杉醇和10-DAB含量最高,当年生针叶紫杉醇含量最低。天然和人工栽培南方红豆杉当年生针叶中紫杉醇和10-DAB含量呈明显的季节变化,各月份间含量差异显著,人工栽培和天然植株针叶在生长速度明显减缓的10月份,紫杉醇和10-DAB含量均出现一个明显的峰值。     

乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅴ在肿瘤转移中的作用及其分子机理

目前研究表明N-乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅴ在肿瘤转移中有重要作用.在恶性肿瘤中, N-乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅴ活性增高,其催化产物β1,6分支也增加,β1,6分支与肿 瘤的侵袭转移密切相关.本文综述了N-乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅴ催化形成N-糖链 β1,6分支的特点以及在N-糖链生物合成中的重要作用;还介绍了N-乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅴ基因组成和参与其基因调控的转录因子Ets-1,及基因表达组织特异性;着重综述了近年来N-乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅴ与肿瘤侵袭转移相关的分子机理的最新研究进展,包括了粘附分子钙粘蛋白(cadherin)和整合素α5β1的作用,修饰表皮生长因子受体调节信号 转导,及通过对上皮衍生的细胞表面丝氨酸蛋白酶matriptase的β1,6分支修饰促进仲瘤的 侵袭等方面.提示有效抑制N-乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅴ参与作用的位点,为设计抗肿瘤新药提供潜在的治疗靶点.     

杜仲1-基-2-甲基-2-（E）-丁烯基-4-二磷酸合酶基因cDNA全长克隆与序列分析

植物萜类生物合成MEP途径中1-羟基-2-甲基-2-（E）-丁烯基-4-二磷酸合酶（HDS）催化ME-2,4cPP生成HMBPP。以杜仲叶片cDNA为模板,采用反转录RCR及RACE技术分离出HDS基因的cDNA全长克隆。测序及序列分析结果表明该基因全长2 786 bp,基因内部含有完整的开放阅读框,共编码743个氨基酸,推导的蛋白质分子量为82.25 kD,理论等电点为5.89,编码序列含有2个保守的结构域PSN和PSI以及3个绝对保守的半胱氨酸位点。系统进化树分析表明EuHDS蛋白与葡萄HDS蛋白的进化距离最为接近（0.049）,其次为番茄（0.052）和橡胶（0.052）。     

黄瓜CsEXP 10基因的电子克隆及生物信息学分析

以黄瓜CsEXP10 cDNA片段为信息探针,利用电子克隆和序列拼接方法获得了1191bp的cDNA序列。应用生物信息学软件预测了该蛋白的理化性质、卷曲螺旋、疏水性、信号肽、跨膜结构、糖基位点、活性位点、亚细胞定位及二级和高级结构。结果表明：该蛋白是一个疏水性稳定蛋白,定位于细胞壁,含有4个α-螺旋,11个β-折叠,5个跨膜区域,10个糖基化位点,具有催化域和多糖结合域两个结构域。