成年大鼠心肌细胞分离和培养相关研究进展

心肌细胞已成为研究心肌结构、代谢、功能、病理生理及其机制的重要工具,是在体心肌模型的重要补充。但是大多数研究用的细胞都来自培养的新生鼠的未成熟心肌细胞,未成熟心肌细胞与成年鼠心肌细胞在形态、结构、功能上存在很大的差异,其实验结论难于推论于成熟心肌细胞。相较于未成熟心肌细胞,成熟心肌细胞的分离和培养相对困难但更有研究价值,怎么分离出高质量的成熟心肌细胞并使其长时间保持活性就成为关键问题。所以,本文将对成年大鼠心肌细胞分离和培养的相关研究进展进行综述。     

定向诱导小鼠ES细胞向心肌细胞的分化

为了提高体外诱导ES细胞向心肌细胞分化的效率 ,对以往的诱导方法加以改进 ,采用直接悬浮培养和 0 8%DMSO诱导 ,建立了简便、高效的定向诱导ES细胞向心肌细胞分化的体系 .诱导第 9d起可见自发性、有节律跳动的类胚体出现 ,第 14d达到高峰 ,约有 70 %的拟胚体产生跳动 .用RT PCR的方法在跳动的拟胚体中检测到心肌细胞特异性标志物的表达 ,采用免疫荧光染色的方法在蛋白水平检测到心肌特异的α辅肌动蛋白 (α actinin)的表达 ,并可见清晰肌小节 ,表明在改进的体外诱导条件下ES细胞可分化为成熟的心肌细胞 .     

电生理法评价培养心肌细胞的功能

心脏学研究已经跨入分子和细胞水平,国外进展迅速。培养的心肌细胞是从微观上研究心肌结构、功能、代谢和发育不可缺少的实验材料。 培养心肌细胞用途是:1。研究离子通道的行为与特征。膜片记录单离子通道电流是近十年来生理学研究的最新领域,从分子水平阐明膜及受体的功能,培养的心肌细胞是主要的实     

猪羊水干细胞特异向跳动心肌细胞诱导分化

为了筛选并建立一种由猪羊水干细胞向心肌细胞分化的有效方法,以猪羊水干细胞为研究对象,以5-氮胞苷 (5-aza) 和维生素C (Vc) 为诱导剂,对猪羊水干细胞形成的类胚体 (EBs) 进行诱导分化。应用免疫荧光、RT-PCR、透射电镜技术检测跳动细胞团中心肌特异性标记的表达情况。结果显示,在猪羊水干细胞形成的类胚体中加入心肌细胞诱导剂,10 d后即见到节律性跳动的细胞团,t检验发现0.1 mmol/L Vc加5 μmol/L 5-aza联合诱导组的诱导效率最高,达33％。免疫荧光结果显示跳动心肌细胞团表达细胞骨架蛋白α-actin和肌钙蛋白Tnni3。RT-PCR检测跳动心肌细胞团,发现心肌细胞特异性标记分子TbX5、Gata4、α-MHC、Tnni3均呈阳性表达。借助透射电镜观察诱导后的跳动样细胞团,能清晰可见其中的肌丝、糖原粒、糖原池等结构。说明5-氮胞苷和维生素C可以促进猪羊水干细胞向心肌细胞的诱导分化。     

microRNA在胚胎干细胞分化的心肌细胞中的表达变化

胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)具有自我更新和多向分化的特性。近年研究显示转录后调控包括micro RNAs(mi RNAs)的调控在ESC心肌细胞分化(ESC-derived cardiomyocytes,ESCM)命运决定中起着重要作用。然而对决定ESC分化命运的mi RNAs的了解还非常有限。为了进一步认识mi RNAs对心肌细胞分化的调控作用,本研究采用经典的悬滴法诱导小鼠ESC(m ESC)分化成心肌细胞,采用安捷伦8×15k小鼠mi RNAs芯片(mi Rbase V16.0)比较了富含跳动心肌细胞区域与非跳动区域mi RNAs表达谱的异同,发现与非跳动区域相比,跳动区域中有19个mi RNAs发生了5倍以上的表达变化(n=3,P0.05),其中5个mi RNAs表达上调、14个mi RNAs表达下调。采用定量RT-PCR进一步分析了mi RNAs芯片中差异倍数大于10的mi RNAs,证明mi R-196a,mi R-196b和mi R-467e在心肌细胞跳动区域的表达丰度明显低于非跳动区域(n=3,P0.05)。用Target Scan数据库对mi R-196a和mi R-196b进行靶基因预测,发现其可能与心肌细胞分化呈负相关,提示其在ESC分化命运决定中可能具有一定的调控作用。这些结果为进一步明确mi RNAs在ESC分化的心肌细胞中的作用提供了新线索。     

绞股蓝总黄酮对低氧/复氧心肌细胞Ca2+及NOS-NO系统的作用

目的:探讨纹股蓝总黄酮对培养心肌细胞低氧/复氧报伤的Ca2+超载、一氧化氮合酶一氧化氮(NOS-NO)系统的影响.方法:培养心肌细胞,建立低氧/复氧损伤模型;荧光分光光度法测定心肌细胞内Ca2+,比色法测心肌细胞培养上清液NO含量、细胞匀浆NOS活性.结果:绞股蓝总黄酮降低低氧/复氧心肌细胞内Ca2+、T-NOS、iN...     

高原低氧环境对心肌细胞影响的研究进展

青藏高原是世界上海拔最高, 面积最大的高原, 有其独特的地理环境, 具有温度低、湿度低、温差大、强紫外线辐射和低压低氧等特点; 而心脏是高耗能耗氧的器官, 对缺氧十分敏感。心肌细胞是研究心肌结构功能代谢病理生理机制的重要工具, 故心肌细胞培养技术备受关注。同时近年来中藏药对心肌细胞的保护研究成为热点。文章主要从高原环境对心肌细胞的影响及心肌细胞的培养和保护方面进行综述。     

细胞外间质-整合素在牵张刺激心肌细胞肥大中的作用

应用牵张刺激培养细胞的模型 ,观察胶原、纤维连接蛋白、层粘连素对牵张刺激心肌细胞肥大的影响 ,探讨细胞外间质 -整合素受体在超负荷心肌肥大的跨膜信号传导机制中的作用。结果发现 ,胶原、纤维连接蛋白、层粘连素明显有助于培养心肌细胞的贴壁、伸展。牵张刺激后 ,胶原、纤维连接蛋白基质组心肌细胞的 3H -亮氨酸掺入率和心肌细胞表面积均显著大于对照组 ,而层粘连素组无显著变化 ;可溶性纤维连接蛋白、RGD肽均可显著抑制牵张刺激诱导的培养心肌细胞 (胶原为粘附基质 )的3H -亮氨酸掺入率升高和心肌细胞表面积增大 ,而层粘连素无明显作用。结果表明 ,特异的细胞外间质 -整合素在超负荷心肌肥大机制中发挥了跨膜信号传导作用。     

干细胞与心肌细胞替代治疗

胚胎干细胞及来源于骨髓、骨骼肌、血管、肝脏、皮肤、脂肪等组织器官的成体干细胞均有多向分化潜能。胚胎干细胞可分化为3个胚层的所有组织细胞。成体干细胞具有可塑性和转分化的潜能。在一定条件下,这些干细胞可被诱导分化为心肌细胞。成年心脏可能存在心肌干细胞,具有增殖和分化为包括跳动性心肌细胞的多种细胞的潜能。因此,干细胞可用于心肌细胞替代治疗,以替代死亡的心肌细胞,改善心脏功能,防治心肌梗塞后心衰、减少心肌重构等症状。本文对干细胞治疗心肌梗塞有关进展及问题作一综述。     

培养人胚心肌细胞的透射电镜观察

本文报告5例4个月人胚(因妇产科指征小剖腹娩出)心肌细胞在培养前胰蛋白酶消化后培养1、2、3、4和5日后的透射电镜所见。胰蛋白酶消化对心肌细胞核、肌原纤维等都有明显影响,但培养24小时基本恢复正常。培养1、2和3日的人胚心肌细胞超微结构和培养前的心肌细胞基本相似。培养4和5日的部分心肌细胞出现 Z 线变形、肌节不完全等变性变化,部分心肌细胞仍具较正常结构。用培养的人胚心肌细胞制备病理模型,宜在培养后1、2和3日内进行。     

小鼠pαMHC-EGFP胚胎干细胞株的构建

应用电穿孔方法将含有α肌球蛋白重链启动子的pαMHC-EGFP载体转染到D3系小鼠胚胎千细胞,应用200μg／ml新霉素进行药物选择。采用悬浮培养法,体外诱导分化心肌细胞。荧光显微镜下,观察到第7天和第8天拟胚体中出现“跳动”的心肌细胞并同时有绿色荧光蛋白的表达。同时与D3系小鼠胚胎干细胞比较心肌细胞分化率的变化无显著差异（P〉0．05）。该细胞株在分化心肌细胞的同时,具有绿色荧光蛋白的标记,因而利于对心肌细胞的识别和纯化。     

心肌微环境对诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的影响

目的:探讨体外心肌微环境对骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为心肌样细胞的诱导作用。方法:分离大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)和心肌细胞并在体外培养纯化。以2×10~4/mL的细胞密度种植心肌细胞,培养72h后收集上清,在BMSCs的培养基内加入心肌细胞培养上清诱导BMSCs分化为心肌样细胞,实验共分6组:10%、20%、30%、40%及50%心肌细胞培养上清组及含10%胎牛血清的对照组,均诱导BMSCs7d,每天在倒置显微镜下观察细胞的形态变化;应用免疫细胞化学技术检测不同浓度心肌细胞培养上清组诱导7d后BMSCs中a-平滑肌肌动蛋白(a-sMA)、β-肌动蛋白(β-actin)、心肌特异性肌钙蛋白T(Troponin-T)、CD31以及FactorⅧ的表达。结果:心肌细胞培养上清组诱导BMSCs7d后,细胞的形态没有改变。10%、20%、30%、40%及50%心肌细胞培养上清组a-sMA、。-actin以及Troponin-T的表达均呈阳性,以30%心肌细胞培养上清组的蛋白表达量最高(P<0.01),而CD31和FactorⅧ的表达呈阴性。结论:心肌细胞的培养上清能够诱导BMSCs分化为心肌样细胞,且30%心肌细胞培养上清是诱导BMSCs向心肌样细胞分化的最适浓度。     

胚胎干细胞向心肌细胞分化过程中能量代谢变化的研究

目的：定向诱导人胚胎干细胞分化为心肌细胞，对分化过程中胚胎干细胞、心肌祖细胞和心肌细胞糖酵解能力和线粒体氧化磷酸化能力进行实时定量检测，探索分化过程中细胞能量代谢表型的转换机制.方法：用GSK3抑制剂CHIR99021和Wnt信号通路小分子抑制剂IWP2的方法定向分化人胚胎干细胞为心肌祖细胞和心肌细胞；细胞免疫荧光检测人胚胎干细胞标志物，流式细胞术检测人心肌祖细胞和心肌细胞标志物；应用细胞外流量分析（Extracellular Flux Analysis）方法检测人胚胎干细胞、心肌祖细胞和心肌细胞能量代谢情况.结果：人胚胎干细胞干性保持稳定，均表达Nanog、OCT4、SOX2细胞标志物；在向心肌分化过程中，第7d心肌祖细胞标志物Isl1表达99%以上，分化第15d心肌细胞标志物cTnT表达83%以上；人胚胎干细胞糖酵解代谢能力最强，心肌细胞线粒体功能最强，心肌祖细胞处于两种代谢方式的过度阶段.结论：在人胚胎干细胞向心肌细胞分化的过程中，细胞糖酵解能力逐渐减弱，线粒体氧化磷酸化能力逐渐增强，细胞的能量代谢类型发生转变.     

Se和V_E与克山病

以克山病病区粮配成基础饲料,另在基础饲料中分别补充Ｓｅ或ＶＥ,或Ｓｅ＋ＶＥ喂养大鼠,在细胞及亚细胞水平上以Ｃａ代谢为主研究并比较了Ｓｅ和ＶＥ在克山病病因中的作用。测量了心肌细胞和心肌线粒体的Ｃａ代谢及有关指标、心肌线粒体能量转换功能及心肌组织自由基含量。结果表明,在低Ｓｅ病区粮中补充Ｓｅ或ＶＥ均能在一定程度上预防病区粮中致病因素对心肌细胞及线粒体的损伤;并且补充Ｓｅ或ＶＥ均能使心肌组织中自由基含量减少。提示Ｓｅ和ＶＥ是通过清除体内过量自由基预防细胞和线粒体的损伤的。但值得注意的是,实验中所用病区粮ＶＥ含量不低于甚至高于非病区对照粮,在低Ｓｅ情况下,所补ＶＥ的量需要相当大（如本实验中补充２００μｇ／ｇ）才能较明显地预防心肌细胞和心肌线粒体的损伤。通过对这些结果的分析,进一步肯定低Ｓｅ是克山病形成的重要因素之一。     

大鼠双下肢骨折合并失血对心肌细胞损伤的作用及其机制

目的：探讨双下肢骨折创伤失血反应可否诱导心肌细胞发生凋亡反应,为深入研究骨折创伤后心肌损伤机制奠定基础。方法：SD大鼠20只,随机分为对照组及创伤组（n=10）,制备双下肢骨折创伤失血模型;原代心肌细胞培养复制创伤模型。ELISA检测血清IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α水平;心肌组织HE染色、Tunel试验观察心肌受损、凋亡;Western blot及RT-PCR检测心肌组织凋亡调控基因Bcl-2/Bax表达变化。结果：创伤后血清炎性因子时间依赖性改变,IL-2（8 h）、IL-6、IL-10（4 h）、TNF-α（1 h）达到峰值,随后逐步回落;心肌HE染色发现心肌细胞肿大,排列紊乱,炎细胞浸润;Tunel试验证实大量核染成棕褐色的心肌细胞,凋亡指数增加（P<0.05）;Western blot及RT-PCR检测表明,无论在体及心肌细胞培养中,促凋亡基因Bax表达上调（P<0.05）,而抑凋亡基因Bcl-2表达下调（P<0.05）。结论：大鼠双下肢骨折创伤失血反应通过诱导心肌细胞凋亡进而造成心肌损伤。     

微重力条件下心肌细胞在聚羟基乙酸纤维支架上的三维固定化培养

以 1d龄Wistar乳鼠的心室肌组织为心肌细胞的来源 ,采用胰蛋白酶消化及细胞差速贴壁分离心肌细胞 ,以未经修饰和经鼠尾胶原溶液浸泡修饰的聚羟基乙酸 (polyglycolicacid ,PGA)纤维支架作为心肌细胞体外三维 (3D)固定化培养的支架 ,比较心肌细胞在静置培养体系及微重力培养体系下的生长、形态和收缩状况。心肌细胞在未经处理的PGA纤维支架 3D固定化培养时 ,心肌细胞在其上的分布不均匀 ,大部分心肌相互连接形成球状聚集体 ;PGA纤维支架经鼠尾胶原溶液浸泡处理后 ,心肌细胞在其上的分布较为均匀 ,细胞形态多呈梭形或不规则状 ,心肌细胞自律性搏动的幅度加大。在模拟微重力培养条件下 ,心肌细胞在经鼠尾胶原溶液浸泡修饰的PGA纤维支架上的分布更为均匀 ,心肌细胞形成具有自律性同步收缩特性、面积约为 15mm2 的类组织样 3D结构     

MLP参与心肌肥大发生过程与Calcineurin/NFAT信号通路有关

心肌肥大是心肌细胞面对多种病理刺激时的共同反应,以心肌细胞体积增大和胚胎期基因的重新表达为标志.心肌发育调控基因肌肉LIM蛋白(muscle LIM protein,MLP)的表达异常与心肌肥大有关.为研究MLP参与心肌肥大发生的分子机制,采用去氧肾上腺素（phenylephrine, PE）刺激大鼠原代培养心肌细胞,建立心肌细胞肥大模型,采用RNAi技术敲减MLP的表达,分析MLP与肥大信号通路钙调神经磷酸酶（calcineurin）/活化T细胞核因子（nuclear factor of activated T-cells, NFAT）的关系.结果显示, 原代培养的心肌细胞经一定浓度的PE刺激后细胞表面积增加,肥大标志蛋白ANP、BNP表达增高,并伴有MLP表达上调. RNAi方法敲减MLP的表达则明显抑制PE诱导的心肌细胞表面积增加和BNP表达增高,并且直接 影响NFAT的转录激活活性,提示MLP与心肌肥大的发生密切相关,并且可能是通过calcineurin/NFAT信号通路而参与心肌肥大的发生.     

黄芪注射液对网腔钙结合蛋白基因沉默阿霉素损伤心肌细胞内质网应激伴侣蛋白GRP78,GRP94 mRNA的作用

目的：研究黄芪注射液对网腔钙结合蛋白（calumenin）基因沉默阿霉素损伤心肌细胞内质网应激伴侣蛋白GRP78,GRP94 mRNA的作用。方法：实验将体外培养的1~3 d乳鼠心肌细胞分为5组：对照组、模型组（正常细胞+3 mg/L阿霉素）、calumenin基因沉默模型组（慢病毒感染细胞+3 mg/L阿霉素）、黄芪组1（正常细胞+3 mg/L阿霉素+200 g/L黄芪）、黄芪组2（慢病毒感染细胞+3 mg/L阿霉素+200 g/L黄芪）。构建慢病毒-calumenin质粒,转染乳鼠培养心肌细胞,采用实时荧光定量分析（real-time PCR）检测各组心肌细胞calumenin及内质网应激伴侣蛋白GRP78、GRP94 mRNA表达。结果：①与对照组比较,模型组心肌细胞calumenin mRNA表达减少（P<0.05）,而calumenin基因沉默模型组及黄芪组2心肌细胞calumenin mRNA表达明显减少（P<0.01）;与模型组比较,黄芪组1心肌细胞calumenin mRNA表达增加（P<0.05）;与calumenin基因沉默模型组比较,黄芪组2心肌细胞calumenin mRNA表达明显增加（P<0.01）。②与对照组相比较,模型组及calumenin基因沉默模型组心肌细胞内质网应激伴侣蛋白GRP78、GRP94 mRNA表达明显增多（P<0.01）;与模型组比较,黄芪组1心肌细胞GRP78、GRP94 mRNA表达明显减少（P<0.01）;与calumenin基因沉默模型组比较,黄芪组2心肌细胞内质网应激伴侣蛋白GRP78、GRP94 mRNA表达明显减少（P<0.01）。结论：①阿霉素损伤可引起心肌细胞calumenin表达减少。②Calumenin可缓解阿霉素损伤所诱导心肌细胞内质网应激。黄芪注射液可抑制阿霉素损伤所诱导心肌细胞内质网应激,这种作用可能系通过calumenin介导实现的。     

模拟微重力条件下心肌细胞的体外三维固定化培养

观察心肌细胞体外培养形成三维(3D)组织结构的能力和过程及心肌细胞在模拟微重力状态下的3D固定化培养效果。应用酶消化法从新生的乳鼠心室肌组织获取心肌细胞,以Cytodex3为心肌细胞的3D固定化培养载体,将心肌细胞固定化培养于Spinnerflask中,用扫描电镜观察心肌细胞体外培养形成的3D组织结构;以心肌细胞的代谢效率和细胞搏动强度为观察指标,比较心肌细胞在Spinnerflask及HARV(highaspectratevessel)生物反应器中3D固定化培养的差异。结果显示,心肌细胞不仅能贴附于Cytodex3上生长,且形成了具有同步自律收缩的3D组织样结构;心肌细胞在两种不同培养体系中的细胞接种效率和细胞形态没有明显差异,培养于HARV中的心肌细胞的代谢效率和细胞搏动强度均明显高于Spinnerflask培养体系。体外培养的乳鼠心肌细胞具有形成同步自律收缩的3D组织结构的能力;模拟微重力的培养环境有利于改善心肌细胞3D组织样培养物的代谢和功能 。     

利用细胞化学染色方法辨别体外培养的心肌细胞

在一般的心肌细胞培养物中含有相当数量的非心肌细胞,故应用培养的心肌细胞进行研究,需要辨别培养物中的心肌细胞与非心肌细胞,我们试图用细胞化学染色方法结合活细胞观察及H.E染色的细胞形态学观察对乳鼠心肌培养物中的心肌细胞进行鉴别。