慢病毒载体的设计及应用进展

慢病毒载体是一类重组逆转录病毒载体,由于其结构和功能的特点作为一种重要的基因转移工具被应用于基因治疗和细胞分子生物学研究领域。目前,为进一步完善慢病毒载体的功能,研究者们从提高载体的生物安全性及增强外源基因的表达调控能力等方面对慢病毒载体进行了改建。本文对慢病毒载体的设计进展及应用进行了简要综述,展望了今后的研究前景。     

基于人免疫缺陷病毒-1的慢病毒载体系统研究进展

慢病毒能够感染分裂细胞和非分裂细胞,因而被发展成为重要的转基因载体。慢病毒载体已经发展到了第三代,其安全性已经大为提高。经过结构优化的慢病毒载体已经用于转基因动物生产和基因治疗研究,而稳定包装细胞系的建立使得慢病毒的生产更为简便。     

原位染色检测慢病毒载体转录通读方法的建立

慢病毒载体作为基因导入系统已被多次应用于基因治疗试验当中,近年来受到了广泛关注。转录通读是慢病毒载体应用过程中存在的潜在不安全因素之一。为了进一步完善慢病毒载体转录通读的检测方法,使检测结果更加直观准确,在已建立的在转录水平检测其转录通读的基础上,进一步模拟病毒载体整合入基因组的状态,于原病毒载体3'-LTR后插入经密码子优化的Lac Z报告基因。经转染细胞后进行原位染色,发生通读现象的细胞会被染成蓝色,从而在蛋白质水平直观地体现慢病毒载体的通读情况,说明所建立的方法是准确可行的。所得结论与q RTPCR方法在转录水平检测的结果是平行相一致。原位染色检测法的建立为慢病毒载体转录通读的检测、提高慢病毒载体生物安全性的研究提供了技术支持。     

慢病毒载体与造血干细胞介导的基因治疗

慢病毒载体不仅能感染造血干细胞 (HSCs) ,使携带的目的基因整合至HSCs基因组内 ,且能利用病毒携带的调控元件 ,使目的基因随HSCs细胞特异性表达 ,因此是一种有效的感染HSCs和进行基因治疗的工具。主要对慢病毒载体基因组特点、改建过程、慢病毒对干细胞的感染能力、慢病毒携带的目的基因在HSCs内的表达及调控等方面做了简要的综述     

腺病毒载体与慢病毒载体感染骨髓间充质干细胞的比较

随着基因治疗的发展,建立高效稳定表达目的基因的载体和靶细胞成为目前研究的热点.骨髓间充质干细胞具有自我复制,高度的增殖能力,多向或定向分化的潜能等优势,是细胞和基因工程中的理想靶细胞.而腺病毒载体和慢病毒载体作为基因载体均能将目的基因导入宿主细胞,因此对腺病毒载体和慢病毒载体的结构、分类、优缺点以及感染骨髓间充质干细胞的转染效率等方面做简要的分析.     

基因治疗慢病毒载体的转导增强策略*

基于慢病毒载体的体外基因治疗已在临床试验中取得良好的效果,有望治愈一些造血系统的单基因遗传病。通过提高靶细胞转导效率和减少转导中病毒载体量,基因治疗有效性、安全性和成本都可以得到改善。不同包膜糖蛋白伪型慢病毒载体通过与细胞膜表面的不同受体结合,促进病毒黏附和入胞,增强不同靶细胞的病毒转导效率。此外病毒转导增强剂可以在病毒进入细胞过程或进入后发挥作用,在提高转导效率的同时使靶转导基因在体内长期稳定表达。通过对这两类方法的总结回顾,旨在为慢病毒载体的转导效率提供新的优化策略,使基因治疗得到更广泛的应用。     

HIV-1缺损慢病毒载体的高滴度制备及其介导的高效基因转移

近来,慢病毒载体引起了极大关注,己成为转基因操作中重要的工具。用编码病毒组份的三质粒系统共转染293T包装细胞系,建立了大量制备HIV-1缺损慢病毒载体的方法,病毒载体的度可达到1.1×107IU/mL,离心浓缩可将载体滴度提高100倍以上。HIV-1缺损慢病毒载体可以高效转导人淋巴瘤等多种来源的细胞,RT-PCR检测显示外源基因GFP稳定表达达18个月以上,长期传代观测未检出p24抗原蛋白或可复制病毒。     

新型小发卡RNA慢病毒表达载体的构建及抗乙型肝炎病毒应用评价

目的:设计用于表达新型小发卡RNA(sh RNA)的慢病毒载体,并考察其用于抗乙型肝炎病毒(HBV)的可行性。方法:对慢病毒载体骨架SapⅠ位点进行突变,并将用于表达新型sh RNA的结构亚克隆到改造后的慢病毒载体;设计靶向HBV保守序列的sh RNA并克隆到该慢病毒载体,包装含有sh RNA序列的重组慢病毒并定量,考察单个及多个sh RNA结构串联对慢病毒滴度的影响;将重组慢病毒感染HBV稳定转染肝细胞系Hep G2.CW(MOI=3),用杀稻瘟菌素筛选稳定克隆1周后,将其重新消化,并以1×105/孔接种于24孔板,于铺板96 h后取细胞上清检测HBs Ag、HBe Ag表达水平和HBV DNA的含量。结果:构建了一种用于表达新型sh RNA的慢病毒载体,并通过设计靶向HBV保守序列的sh RNA实现了HBV复制的高效抑制;发现多个sh RNA串联效果优于单个sh RNA。结论:构建的新型sh RNA慢病毒表达载体可作为防治慢性病毒感染如HBV感染的潜在有效手段之一,值得进一步研究。     

慢病毒载体转录通读率检测方法的建立

慢病毒载体作为一种有效的生物研究和基因治疗载体,近年来正受到广泛关注,而转录通读现象则是限制其被使用的主要生物安全性瓶颈之一.为了评估慢病毒载体在整合入染色体后的转录通读的实际情况,需要建立一种有效的检测转录通读率的方法.文中运用分子生物学等手段,将相关质粒瞬时转染入293T细胞,模拟野生型和自灭活型慢病毒载体整合入染色体后的情况,利用实时荧光定量PCR分别定量转录通读和总转录本在慢病毒载体上的特征序列,并计算出转录通读率;同时使用流式细胞计数等技术,检测转录通读后的GFP蛋白产物.两种检测结果均与理论相符,即自灭活型载体具有更高的转录通读率.说明文中所建立的方法有效可靠,为进一步评估和降低慢病毒载体的转录通读率,提高慢病毒载体的生物安全性的研究提供技术支持.     

小鼠Smad6基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

构建小鼠Smad6基因RNA干扰（RNAi）慢病毒载体,有效沉默骨髓树突状细胞（BMDC）的Smad6基因表达,为构建骨髓致耐受DC用于哮喘等自身免疫疾病的研究。设计小鼠Smad6 shRNA序列,合成、退火,得到双链DNA,与经酶切后的Psih1-H1-copGFP shRNA Vector载体连接产生LV-shSmad6慢病毒载体,并测序鉴定。转染293TN细胞,包装产生慢病毒,测定滴度。感染小鼠骨髓树突细胞,检测Smad6基因的表达状况成功构建Smad6 shRNA的慢病毒载体LV-shSmad6。包装慢病毒,并显著抑制Smad6 mRNA水平及蛋白水平的表达。成功构建出小鼠Smad6基因shR-NA慢病毒载体,为后期研究Smad6基因在哮喘发病机制及新治疗方法提供了稳定的转染细胞载体。     

可诱导慢病毒载体的优化策略及应用

以1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)为基础构建的慢病毒载体具有可感染非分裂细胞、免疫反应小、携带的基因片段容量大和可整合进宿主基因组而长期表达等优点,因而成为最理想的基因转移载体之一。可诱导慢病毒载体介导的可诱导基因表达系统能够有效控制目的基因表达,扩大了慢病毒载体的临床应用潜能,成为很有前景的基因治疗载体。主要介绍带有四环素和其他几种诱导系统的可调控性慢病毒载体及其改进,以及可诱导慢病毒载体在RNA干扰中的应用。     

一种新型慢病毒载体制备方法的建立

为了建立新型、高产量的慢病毒载体制备体系,将构建好的主框架质粒pVECRNA、包装质粒pGAGPOL及包膜质粒pVSVG通过脂质体共转染至BHK21细胞,再用含有T7RNA聚合酶基因的重组痘苗病毒vTF-3感染细胞,培养4d后,收集培养上清,提取培养上清的RNA,进行RT-PCR反应;将培养上清进行免疫印迹鉴定;将培养上清感染正常的293T细胞、HepG2细胞、Vero细胞,荧光显微镜下观察细胞GFP的表达情况;采取3*3*3析因分析方法,优化系统产量,Real-time PCR方法测定细胞培养上清中病毒载体的拷贝数,利用流式细胞术检测病毒载体滴度。RT-PCR及p24免疫印迹结果均提示在细胞上清中存在慢病毒载体;通过荧光显微镜观察到感染组293T细胞、HepG2细胞、Vero细胞均表达绿色荧光蛋GFP,说明此系统制备出的慢病毒载体具有感染性;系统经优化后,培养上清中慢病毒载体拷贝数达到(11.71±0.80)×1011copies/mL,培养上清原始滴度达到(1.3±0.18)×108tu/mL,高出目前常用制备体系产量1个数量级。初步建立了新型慢病毒载体制备体系,为今后该系统的大规模应用提供客观的科学依据。     

用慢病毒载体制备转基因动物的研究进展

慢病毒是逆转录病毒的一种 ,具有逆转录病毒的基本结构 ,但也有不同于逆转录病毒的组份和特性 ,作为基因治疗载体发展起来 ,最近已用于转基因动物制备。慢病毒像其它逆转录病毒一样 ,其基因组经逆转录后能整合在宿主DNA上 ;由于病毒载体经改构后 ,不在宿主细胞增殖 ,不会导致寄主细胞的死亡 ,被它感染的或转化的动物细胞能够连续传代 ;这种载体的最大优势是能感染静止细胞和不产生嵌合体动物。详细介绍了慢病毒载体构建原理、近年慢病毒载体在转基因动物制备方法和应用研究的新进展。     

miR-455慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的：构建人源microRNA-455（miR-455）慢病毒载体,并鉴定成熟has-miR-455在细胞内的表达水平。方法：提取siHa细胞中的人基因组DNA,设计并合成人miR-455的上下游引物,PCR扩增目的基因,将其中表达miR-455的结构经酶切后插入慢病毒转移质粒pWPT-GFP,构建成pWPT-GFP-pri-miR-455,在293T细胞中与pMD2G、pSPAX2包装产生慢病毒,并用含慢病毒的上清感染SiHa细胞。结果：测序结果证明插入质粒载体中的miR-455前体序列完全正确,慢病毒载体构建成功并获得相应的慢病毒;重组慢病毒质粒pWPT-GFP-pri-miR-455感染SiHa细胞后上调miR-455的表达近40倍。结论：构建了miR-455的慢病毒载体,并能在293T细胞中表达,产生的慢病毒能成功感染SiHa细胞。为进一步研究miR-455的功能,以及利用慢病毒进行基因治疗奠定了基础。     

表达β-珠蛋白基因的安全性慢病毒载体的优化

目的:慢病毒载体(lentiviral vector,LVV)是一种有效的基因治疗导入系统。拟用已研发的携带人的β-珠蛋白基因自删除慢病毒载体,优化其表达有效性和提高其病毒颗粒数。方法:比较三款不同的启动子预测软件的分析结果,分别构建三种不同长度启动子的表达β-珠蛋白基因(β-globin)的LVV,并对其Ⅱ号内含子进行部分删减;用经优化的LVV转导β-地中海贫血(β-地贫)的小鼠诱导性多能性干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSC)后,用此iPSC制备嵌合体小鼠模型;经RT-PCR、血涂片瑞氏吉姆萨染色等观察分析其功能性代偿的潜能。研究结果:经优化后的自删除慢病毒载体病毒对其病毒颗粒数的滴度影响不大(2.3×10~(11)LPs/ml),可在嵌合体小鼠模型体内检测到正常人β-珠蛋白基因的功能性表达。结论:优化了表达人β-珠蛋白基因的自删除LVV。     

一种新型慢病毒载体制备体系的初步建立

为了建立新型、高产量的慢病毒载体制备体系,将构建好的主框架质粒pVECRNA、包装质粒pGAGPOL及包膜质粒pVSVG通过脂质体共转染至BHK21细胞.再用含有T7RNA聚合酶基因的重组痘苗病毒vTF-3感染细胞,培养4天后,收集培养上清.提取培养上清的RNA,进行RT-PCR反应,将培养上清进行免疫印迹鉴定,将培养上清感染正常的293T细胞、HepG2细胞、Vero细胞,荧光显微镜下观察细胞GFP的表达情况,采取3×3×3析因分析方法,优化系统产量,Real-timePCR方法测定细胞培养上清中病毒载体的拷贝数,利用流式细胞术检测病毒载体滴度.RT-PCR及p24免疫印迹结果均提示在细胞上清中存在慢病毒载体;通过荧光显微镜观察到感染组293T细胞、HepG2细胞、Vero细胞均表达绿色荧光蛋白GFP,说明此系统制备出的慢病毒载体具有感染性;系统经优化后,培养上清中慢病毒载体拷贝数达到1.1×1012/ml,培养上清原始滴度达到1.3×108tu/ml,高出目前常用制备体系产量1个数量级.上述结果表明,新型慢病毒载体制备体系已初步建立,为今后该系统的大规模应用提供客观的科学依据.     

慢病毒载体转录“通读”改进研究进展

自2002年以来,在用γ-逆转录病毒载体治疗X连锁重度复合性免疫缺陷病 (X-SCID) 的10例病人中已有4例因载体整合在原癌基因lmo2等附近而得了白血病。这一事件提高了人们对基因治疗载体安全性的关注。与γ-逆转录病毒载体相比,慢病毒载体因尚未发现有整合在lmo2附近的现象,被认为是安全性较好的基因治疗载体。然而自灭活慢病毒载体与γ-逆转录病毒载体一样存在着转录“通读”的现象。近些年来,科学家们在改善自灭活慢病毒载体的通读率上做了一些工作并取得了一些积极成果。以下对慢病毒载体转录“通读”现象的发生机理和解决途径作了综合描述。     

病毒载体与造血干细胞基因治疗

多种获得性和遗传性疾病累及造血细胞。造血干细胞是人类基因治疗的重要靶细胞。成功的造血干细胞基因治疗不仅需要高效基因转移,还需要治疗基因的长期、高水平表达。反转录病毒载体是造血干细胞基因治疗的常用载体,结合优化的造血干细胞转导条件,其介导的腺苷脱氨酶缺陷引起的严重联合免疫缺陷和X染色体连锁的严重联合免疫缺陷的基因治疗已经获得初步成功;其他整合型病毒载体如慢病毒和腺相关病毒载体,也在临床前造血干细胞基因治疗研究中得到广泛应用。从病毒载体、基因转移和基因表达等几个方面综述了造血干细胞基因治疗的临床前和临床研究的重要进展。     

血友病A基因治疗载体研究现状

血友病A是X染色体隐性遗传出血性疾病。其发病原因是患者血液中先天缺乏凝血因子FⅧ。用于血友病A基因治疗研究的载体有病毒载体和非病毒载体,目前研究较多的是病毒载体,主要有逆转录病毒载体和慢病毒载体,腺病毒载体及腺相关病毒载体等。非病毒载体主要有质粒、脂质体、转座子等。文章拟对血友病A基因治疗各载体的特点和研究进展作一综述。     

介导大鼠结缔组织生长因子基因沉默的慢病毒载体转移质粒的构建及鉴定

目的：构建介导大鼠结缔组织生长因子（CTGF）基因沉默的慢病毒载体转移质粒pGCL-CTGF,为进一步包装慢病毒载体奠定基础。方法：以大鼠CTGF基因为靶基因,根据RNA干扰（RNAi）序列设计原则,设计4对有小发夹结构的RNAi靶点序列,退火形成双链DNA,双酶切后定向克隆到慢病毒载体转移质粒pGCL-GFP中,构建4个含靶基因片段的重组慢病毒载体转移质粒pGCL-CTGF,并对质粒进行PCR及测序鉴定。结果：CTGF的短发夹RNA（shRNA）片段被成功克隆到慢病毒载体转移质粒pGCL-GFP中,4个插入序列与设计的靶基因片段完全一致。结论：构建了能够表达4个含CTGF靶基因片段的慢病毒载体转移质粒,为进一步包装介导CTGF基因沉默的慢病毒载体奠定了基础。