赤点石斑鱼卵型芳香化酶基因启动子调控绿色荧光蛋白在斑马鱼早期生殖腺中的表达

P450芳香化酶(P450arom)是生物体内合成雌激素的关键酶。为研究赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)卵型芳香化酶基因(EaCyp19a1a)启动子的调控作用,构建了EaCyp19a1a启动子9个不同的5′端缺失片段与绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)组成的表达载体,分别命名为pEaCyp19a1a-EGFP1-9。在COS-7细胞中的瞬时转染实验证明载体pEaCyp19a1a-EGFP7具有很强的转录活性。通过显微注射,将线性化的pEaCyp19a1a-EGFP7载体注入斑马鱼单细胞期受精卵中,定期在荧光显微镜下观察GFP的表达。结果发现GFP在胚胎期(受精后约48h)开始表达,主要发生在斑马鱼早期生殖腺细胞中,具有明显的性腺特异性。这说明EaCyp19a1a的启动子序列中含有调控其性腺特异表达的顺势作用原件。研究为进一步探明芳香化酶在鱼类性别分化和性别转变过程中的作用奠定了基础。     

石斑鱼性反转相关基因 ECaM的克隆及表达特征分析

用甲睾酮片饲喂 2 ～ 4 龄赤点石斑鱼 (Epinephelus akaara) , 6 周后 90% 以上的雌鱼性逆转为功能性雄鱼 . 运用抑制性差减杂交技术 (SSH) ,结合 SMART cDNA 合成和 RACE-PCR 方法,从性反转雄鱼性腺中克隆到钙调蛋白基因 (ECaM). 该基因 cDNA 全长为 582 bp ,开放阅读框长 450 bp ,编码的蛋白质由 149 个氨基酸组成, 5 ′端非编码区 74 bp , 3 ′端非编码区 58 bp. 虚拟 RNA 印迹表明, ECaM 在性反转雄鱼性腺中表达,而在正常雌鱼性腺中表达微弱 . 各种组织的半定量 RT-PCR 显示, ECaM 在脑、心、肝、脾、肾都有转录,在精巢和下丘脑中表达水平较高,而在肌肉中表达甚弱 . 性反转不同时期性腺的半定量 RT-PCR 及蛋白质印迹表明,性逆转过程中性腺里 ECaM 的表达量逐渐增加 . 上述结果提示钙调蛋白可能在赤点石斑鱼性逆转过程中发挥着作用, ECaM 可能是促使石斑鱼由雌向雄转变的重要功能基因之一 .     

赤点石斑鱼两种芳香化酶cDNA的克隆及其表达的组织特异性

以赤点石斑鱼 (Epinephelusakaara)脑垂体中提取的RNA为模板 ,根据芳香化酶的保守序列设计引物 ,利用GeneRacerTM 技术 ,克隆出两种芳香化酶即脑芳香化酶 (P4 5 0aromB)和性腺芳香化酶 (P4 5 0aromA)的cDNA ,其全长分别为 190 1bp (编码 5 0 9aa)和 1833bp (编码 5 18aa)。序列分析结果表明 ,赤点石斑鱼两种芳香化酶cDNA序列的同源性为 5 1 6 % ,氨基酸序列之间同源性为 6 2 5 % ,与斜带石斑鱼两种芳香化酶氨基酸同源性分别为 94 7%和 97 9%。对 8个科的 10种鱼进行了分子系统进化树分析 ,结果与根据传统的形态学和生化特征分类进化地位基本一致。以特异性引物扩增雌、雄赤点石斑鱼各种组织 (垂体、嗅球、端脑、下丘脑、中脑、后脑、延脑、心脏、肾脏、肝脏、脾脏、性腺、鳃、胃、肠、皮肤、脂肪、肌肉、头肾、胸腺、鳔 ) ,以β actin作内标比较各组织芳香化酶基因表达量的差异 ,结果表明 ,赤点石斑鱼脑芳香化酶 (P4 5 0aromB)有广泛的组织分布 ,脑和垂体的表达量很高 ,各组织表达量有明显的雌、雄差异 ;而性腺芳香化酶 (P4 5 0aromA)表达主要集中于垂体和性腺 ,且不论雌雄 ,其性腺表达量均高于脑垂体 ,和P4 5 0aromB的表达模式明显不同 ,表现为在脑部 ,P4 5 0aromB表达量高于P4 5 0aromA ,而在性腺 ,     

处于性腺不同发育阶段斜带石斑鱼垂体的EST表达差异分析

斜带石斑鱼是重要的海产经济鱼类,在其个体发育过程中存在先雌后雄的天然性反转现象。垂体是调节生长和生殖等生理过程的重要内分泌器官。构建了斜带石斑鱼分别处于卵巢发育起始和性反转后期的垂体SMARTcDNA的质粒文库,并通过测序分别筛选到232个和258个表达序列标签(expressed sequence tags,EST)。将所得EST与GenBank数据库中的序列进行比对,结果表明,处于卵巢发育起始和性反转后期斜带石斑鱼垂体EST中,激素所占比例均为最高,分别为40.5%和34.9%。进一步比较分析了这两个性腺发育时期斜带石斑鱼垂体EST中各种激素相对表达丰度,表明生长/催乳激素家族(GH、PRL和SL)和阿黑皮素原(POMC)表达水平下降;促性腺激素α亚基(GTHα)表达水平急剧上升,促滤泡激素β亚基(FSHβ)、促黄体激素β亚基(LHβ)表达水平上升。     

处于性腺不同发育阶段斜带石斑鱼垂体的EST表达差异分析

斜带石斑鱼是重要的海产经济鱼类，在其个体发育过程中存在先雌后雄的天然性反转现象。垂体是调节生长和生殖等生理过程的重要内分泌器官。构建了斜带石斑鱼分别处于卵巢发育起始和性反转后期的垂体SMART cDNA的质粒文库，并通过测序分别筛选到232个和258个表达序列标签(expressed sequence tags, EST)。将所得EST与GenBank数据库中的序列进行比对，结果表明，处于卵巢发育起始和性反转后期斜带石斑鱼垂体EST中，激素所占比例均为最高，分别为40.5%和34.9%。进一步比较分析了这两个性腺发育时期斜带石斑鱼垂体EST中各种激素相对表达丰度，表明生长/催乳激素家族（GH、PRL和SL）和阿黑皮素原（POMC）表达水平下降；促性腺激素α亚基（GTHα）表达水平急剧上升，促滤泡激素β亚基（FSHβ）、促黄体激素β亚基（LHβ）表达水平上升。     

金钱鱼Sox9 cDNA克隆及其表达分析

为了解Sox9基因在金钱鱼(Scatophagus argus)性腺分化中的作用,本研究利用c DNA末端快速扩增法(RACE)克隆了金钱鱼Sox9基因c DNA全长序列,同时研究了投喂芳香化酶抑制剂来曲唑(LE)(50 mg/kg)后该基因的表达及其性腺的组织学变化。金钱鱼Sox9 c DNA全长2 759 bp,包括5′非翻译区(5′-UTR)31 bp、3′非翻译区(3′-UTR)1 288 bp和开放阅读框(ORF)1 440 bp,编码479个氨基酸。该氨基酸序列104~172位为HMG保守盒,在该盒内存在一个特征性基序,两个核定位信号NLS及一个富含亮氨酸的核输出信号NES。该序列与赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)的相似性最高,为96.0%,与非洲爪蟾(Xenopus laevis)、人(Homo sapiens)、原鸡(Gallus gallus)、小家鼠(Mus musculus)等物种的相似性为61.5%~76.1%。Real-time PCR显示,金钱鱼Sox9基因在脑、鳍、精巢中表达量较高。组织学研究表明,芳香化酶抑制剂来曲唑能有效诱导金钱鱼发生不同程度的性逆转,性腺中卵母细胞退化,精原细胞增殖。Real-time PCR结果显示,金钱鱼Sox9基因在来曲唑处理20 d后开始不断上升,于处理后第40天时达到最高值,在第60天时表达量迅速下降。上述结果表明,金钱鱼Sox9基因高度保守,可能在金钱鱼性腺雄性化过程中起重要作用。     

团头鲂促性腺激素GtH Iβ亚基基因5′端启动子区克隆及表达载体构建

本研究利用改进的锚定PCR方法克隆了团头鲂(Megalobrama amblycephala)促性腺激素Iβ(GtH Iβ)亚基基因5′端侧翼序列,并在生物信息学方法分析的基础上构建了荧光素酶质粒表达载体。序列分析结果显示:克隆得到的GtHIβ亚基基因5′端侧翼序列长度为479bp,其中包括TATA盒、ARE、PRE、ERE、SF-1、Ptx1等可能对GtH Iβ亚基基因转录调控起重要作用的功能转录因子结合位点。利用PCR方法在基因组中扩增得到了3个缺失片段,并同全长片段一起分别连接至pGL3-Basic报告基因载体,成功构建了团头鲂GtH Iβ亚基基因5′端侧翼序列的表达载体,为进一步研究、分析其转录调控机制提供了基础。       

斜带石斑鱼TLR3基因的克隆及其在刺激隐核虫感染时的表达分析

TLR3(Toll like receptor 3)是Toll样受体家族的重要成员,通过识别病原相关分子模式,诱导宿主天然免疫应答。研究从斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)中克隆得到TLR3 cDNA序列,全长为2937 bp,包括107bp的5′非编码区、100 bp的3′非编码区和编码909个氨基酸的2730 bp的开放阅读框。TLR3全长氨基酸序列包含1个信号肽、18个富含亮氨酸的重复序列(Leucine-rich Repeat LRR)、1个跨膜结构域和1个胞内TIR结构域(IL-R1 homologous region)。同源比对显示,斜带石斑鱼TLR3与其他已报道硬骨鱼类的TLR3具有较高的同源性(52%—67%)。组织表达分析显示,TLR3在健康斜带石斑鱼的组织中具有较广的表达分布,其中在前脑、体肾和脾脏中表达量较高。刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)感染斜带石斑鱼后:在皮肤中TLR3的表达量呈现先降低后升高的趋势,从感染后第7天开始上调,并在第10天达到高峰;而在脾脏中,TLR3的表达量在感染6h时就显著上调并达到峰值。结果表明斜带石斑鱼TLR3在抗刺激隐核虫的免疫应答过程中可能发挥重要作用。     

岩原鲤促性腺激素基因的克隆和组织表达差异

通过RT-PCR技术从岩原鲤(Procypris rabaudi)卵巢组织中克隆了促性腺激素GtHα、FSHβ、LHβ3个亚基的mRNA序列。GtHα亚基开放阅读框长357 bp,编码118个氨基酸残基,第1～23个氨基酸为信号肽。FSHβ亚基开放阅读框长393 bp,编码130个氨基酸残基,第1～22个氨基酸为信号肽。LHβ亚基开放阅读框长444 bp,编码147个氨基酸残基,第1～28个氨基酸为信号肽。氨基酸序列比对结果表明,GtHα亚基在近缘物种间比较保守,其氨基酸序列的相似性要高于FSHβ和LHβ亚基。通过Real-time fluorescent quantitative PCR(FQ-PCR)分析发现,GtHα亚基在检测的6种组织中均有表达,卵巢中的表达量极高,肝、脑、心、垂体和肌肉中表达量依次降低;FSHβ亚基在除肌肉外的其余5种组织中均有表达,卵巢中的表达量最高,脑和心中表达量次之,肝和垂体的表达量明显偏低;LHβ亚基只在卵巢和垂体中表达,卵巢中的表达量要明显高于垂体。     

银鲫Greb1的克隆、表达及功能研究

为研究银鲫(Carassius gibelio)雌激素应答基因(Growth regulation by estrogen in breast cancer cell 1, Greb1)的表达特征和功能, 采用RACE方法克隆了银鲫Greb1的全长cDNA (CgGreb1)。CgGreb1的cDNA全长为954 bp, 其中包含一个765 bp的开放阅读框, 编码255个氨基酸。大多数脊椎动物有多个Greb1的变体, 长度为386—1988个氨基酸, 其中CgGreb1是最短的一个。序列比对结果表明脊椎动物Greb1蛋白的N端区域极为保守, 且CgGreb1位于Greb1蛋白的N端区域, 该区域与其他脊椎动物Greb1的同源性超过60%。qRT-PCR结果显示, 在成体组织中, CgGreb1主要在垂体、脑、性腺和肝脏中表达, 其中在垂体中CgGreb1的表达最高; 在注射促黄体生成素释放激素类似物和人绒毛膜促性腺激素后的雌鱼垂体中, CgGreb1的表达逐渐上升随后降低, 并在产卵时维持较高的表达; 在胚胎发育过程中, CgGreb1从50%外包开始表达, 其表达量随胚胎发育而升高, 在受精后24h达到峰值, 随后表达量下降, 在受精后48h不表达。原位杂交结果表明, 在原肠期, CgGreb1信号位于胚层的边缘; 在体节期, CgGreb1信号逐渐增强并出现在神经系统; 在受精后24h, CgGreb1信号在脑和脊髓等中枢神经系统增强; 从受精后30h开始, CgGreb1信号减弱; 在受精后48h, 检测不到CgGreb1信号。在注射CgGreb1 MO的银鲫胚胎中, tshβ、prl和gthα分别标记的3种垂体细胞减少, 证明CgGreb1参与早期银鲫垂体细胞的发育。研究结果为进一步揭示银鲫垂体发育和生长调控机制奠定了基础。     

吗啡和内啡素对生殖内分泌活动的影响

内源性鸦片样物质(endogenous opiate like substance)亦称内啡素(endorphins),主要分布在脑、垂体和胃肠道等处。在脑内,内啡素具有选择性的分布。在下丘脑正中隆起区域含量较高,提示它可能对垂体激素的分泌具有重要作用。许多作者报告,给动物脑室注射微量的β-内啡肽或脑啡肽,即可明显地促进垂体前叶促肾上腺皮质激素(ACTH)、生长激素(GH)和促甲状腺激素(TSH)的分泌,同时对垂体促性腺激素的分泌亦有明显的影响。因此内啡素是体内调制生殖内分泌活动的一个重要因素。     

斜带石斑鱼MyD88基因的克隆与表达

本研究运用RACE-PCR技术获得斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)髓样分化因子88 (myeloid differentiation factor 88,MyD88)基因,并对该基因进行生物信息学和表达模式分析.研究结果表明1 795 bp的cDNA全长序列,包括ORF 870 bp、5' UTR 243 bp和3' UTR 682 bp,3' UTR存在1个多聚腺苷酸加尾信号(AATAAA)和两个mRNA不稳定基序(ATTTA).SMART软件预测该蛋白N端和C端分别存在死亡结构域和TIR结构域(Toll/IL-1 receptor homology domain,TIR);与其它脊椎动物MyD88的序列同一性达57.1%～78.7%;用NJ法构建的系统进化树中,斜带石斑鱼MyD88和其它已报导的鱼类MyD88聚为一枝.qPCR检测结果显示MyD88基因mRNA主要表达于肝脏、脾脏、头肾和胸腺等组织.本研究为进一步探讨MyD88在斜带石斑鱼TLR信号传导中的作用奠定基础.     

蚊浓核病毒介导的人工内含子在蚊体内外的初步应用

根据人β-球蛋白基因第一内含子5′-端供位序列与免疫球蛋白重链可变区基因3′-端受位序列构建人工内含子,将人工内含子插入重组蚊浓核病毒质粒载体p7NS1-GFP中GFP融合表达的病毒非结构蛋白NS1的编码框内,构建成载体p7NS1-Intron-GFP,与辅助载体pUCA共转染蚊C6/36细胞系,荧光显微镜下观察细胞内GFP的表达情况。纯化、回收共转染后形成重组病毒与野生病毒,共感染白纹伊蚊二龄幼虫并观察幼虫体内GFP的表达情况。结果在C6/36细胞与蚊幼虫体内均观察到GFP的高效表达,证实人工内含子无论在蚊细胞系内还是在活体幼虫内均可正常行使其自我剪切的功能,未影响到下游蛋白GFP的表达。本研究为人工内含子在蚊虫细胞内的应用奠定基础,为蚊虫及其病原体相关基因工程技术提供新的策略。     

抚仙金线鲃促性腺激素亚基基因克隆及组织表达分析

抚仙金线鲃Sinocyclocheilus tingi是云南抚仙湖特有种,虽然实现了人工繁殖,但在塘养环境下仍无法自然繁衍。鱼类的生殖活动受下丘脑-垂体-性腺轴的调控,其中促性腺激素在该过程中起重要作用。本实验利用实时荧光定量PCR和c DNA末端快速扩增技术从抚仙金线鲃垂体中克隆了GTHα、FSHβ和LHβ3种基因的c DNA序列,其中GTHα的开放阅读框(ORF)长度为357 bp,编码118个氨基酸,有10个半胱氨酸残基和2个N-糖基化位点;FSHβc DNA全长为856 bp,ORF长度为393 bp,编码130个氨基酸,有11个半胱氨酸残基和1个N-糖基化位点;LHβc DNA全长为930 bp,ORF长度为441 bp,编码146个氨基酸,有12个半胱氨酸残基和1个N-糖基化位点。实时荧光定量PCR结果显示,GTHα和LHβ都只在雄鱼和雌鱼的垂体中表达。FSHβ在垂体中表达量最高,在雌鱼和雄鱼的脂肪、肌肉和雄鱼的精巢和肝脏中有少量表达。本研究为抚仙金线鲃的人工繁育提供了重要的基础数据。     

中华鲟促性腺激素释放激素受体基因cDNA序列的克隆及表达分析

为了研究中华鲟(Acipenser sinensis)促性腺激素释放激素受体(Gonadotropin-releasing hormone receptor, GnRH-R)基因在中华鲟中的组织表达特征, 为中华鲟生长发育调控研究提供基础数据, 通过构建中华鲟(Acipenser sinensis)垂体的SMART cDNA质粒文库, 采用cDNA末端快速扩增(RACE), 克隆得到了中华鲟GnRH-R基因的cDNA全长序列。该序列全长1530 bp, 有478 bp的5′非翻译区, 579 bp的开放阅读框和473 bp的3′非翻译区, 共编码192个氨基酸, 其成熟多肽含有5个Ｎ连糖基化位点。通过和已知其他鱼类的GnRH-R基因进行氨基酸序列多重比对, 发现其与真鲷(Pagrus major)的同源性最高, 为76%, 与米氏叶吻银鲛(Callorhinchus milii)的同源性最低, 为39%。采用实时荧光定量PCR (Real time PCR)方法, 检测了GnRH-R的mRNA在中华鲟心、肝、脾、肾、肠道、精巢、肌肉及脑组织中的表达状况, 发现其在精巢中大量转录, 而在其他组织中则表达微弱。以上结果表明中华鲟GnRH-R基因在性腺发育特别是精子发生过程中可能起重要作用。     

斜带石斑鱼(♀)×鞍带石斑鱼(♂)受精细胞学的组织切片观察

人工诱导雌核发育二倍化的关键是掌握极体排出和卵裂的时机,掌握该规律最直接的方式即进行受精细胞学的研究。以鞍带石斑鱼(Epinephelus lanceolatus)为父本,斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)为母本,通过人工授精获得受精卵,收集受精后不同时刻的卵子,经Smith′s液固定、石蜡包埋、切片、苏木精-伊红染色和显微组织观察。结果表明:受精后第30~60 s精子入卵;第3 min精子星光出现;第5 min卵子排出第二极体;第7~15 min雌雄原核相互靠近,并最终融合;第15 min以后合子核开始分裂。鞍带石斑鱼精子进入斜带石斑鱼卵子的时间与多数硬骨鱼类比较没有显著差别;但是,第二极体排出及第一次卵裂的时间较早。研究展示了斜带石斑鱼与鞍带石斑鱼杂交的受精细胞学的基本发育过程,并为后续的人工诱导石斑鱼雌核发育研究提供了理论依据。     

GnRH相关肽在大鼠垂体前叶的细胞学定位

本研究应用特异性抗GnRH相关肽(GAP)N端11个氨基酸的抗血清和六种垂体前叶激素的抗血清,通过免疫组织化学双重染色技术观察GAP在大鼠垂体前叶细胞的定位。结果发现,GAP样免疫反应性物质存在于LH细胞和FSH细胞,而未见于GH、PRL、TSH和ACTH细胞。本文首次证明GAP存在于正常大鼠垂体促性腺激素细胞,为GAP调节LH和FSH的分泌提供了形态学证据;也支持GAP的功能序列在其分子的N端,或GAP进一步裂解出N端片段而发挥作用。     

斜带石斑鱼阿片黑素促皮质素原全长cDNA克隆及序列分析

通过构建斜带石斑鱼垂体cDNA库和随机测序,克隆了其阿片黑素促皮质素原(Proopiomelanocortin,POMC)全长cDNA。斜带石斑鱼POMC全长cDNA为863bp(含Poly(A)),编码的POMC多肽前体为219aa。氨基酸序列比较分析表明：斜带石斑鱼POMC前体包含有促肾上腺皮质激素(Adrenocorticotropin,ACTH),α—促黑素(α—melanocyte stim—datinghormone,α—MSH),β—促黑素(β—MSH),γ—促脂素(γ-lipotrophic hormone,γ-LPH),β—内啡肽(β-endorphin)等,但缺失了γ—促黑素(γ-MSH)和大部分连接区。斜带石斑鱼POMC与哺乳动物POMC的同源性为39％—42％左右,与鸟类的同源性为42％左右,与两栖类的同源性为36％—41％,与其他鱼类POMC的同源性为38％—77％。斜带石斑鱼和罗非鱼的POMC的ACTH功能区都为40个氨基酸残基,而其他脊椎动物为39个氨基酸残基。     

拟南芥未知功能基因At4g22890 编码蛋白的叶绿体定位

蛋白质的亚细胞定位信息对于深入了解该蛋白质的功能具有重要意义。本文对一个预测的拟南芥叶绿体未知功能基因At4g22890 编码蛋白进行了叶绿体定位研究。我们克隆了该基因5′端长208 bp 的DNA 片段, 与绿色荧光蛋白(GFP) 基因构建重组表达载体pMON530-cTP-GFP, 经农杆菌介导转化拟南芥。转基因植株经激光共聚焦显微镜观察, GFP 荧光仅在叶绿体中观察到, 表明所克隆的DNA 序列编码的多肽能够将At4g22890 编码蛋白质引导进入叶绿体, 由此推测该蛋白质为叶绿体蛋白质。     

拟南芥未知功能基因At4g22890编码蛋白的叶绿体定位

蛋白质的亚细胞定位信息对于深入了解该蛋白质的功能具有重要意义。本文对一个预测的拟南芥叶绿体未知功能基因At4g22890编码蛋白进行了叶绿体定位研究。我们克隆了该基因5′端长208bp的DNA片段,与绿色荧光蛋白(GFP)基因构建重组表达载体pMON530-cTP-GFP,经农杆菌介导转化拟南芥。转基因植株经激光共聚焦显微镜观察,GFP荧光仅在叶绿体中观察到,表明所克隆的DNA序列编码的多肽能够将At4g22890编码蛋白质引导进入叶绿体,由此推测该蛋白质为叶绿体蛋白质。