玻璃化冷冻对猪体外成熟卵母细胞染色体与纺锤体的影响

以冷冻环为载体,探讨玻璃化冷冻对猪体外成熟卵母细胞染色体与纺锤体影响。单用40%乙二醇(ethyleneglycol,EG)或20%EG与20%二甲基亚砜(dimethylsulphoxide,DMSO)联合作冷冻保护剂,用直投液氮或使用玻璃化冷冻仪法制冷冷冻猪体外成熟卵母细胞;解冻2h后固定并免疫荧光法染色纺锤体及染色体;挑选各试验组形态正常卵母细胞进行体外受精实验。结果表明,与单用EG以及EG和DMSO联合直投液氮方案比较,EG和DMSO联合应用并采用玻璃化冷冻仪制冷方案卵母细胞染色体正常率为30.1%,纺锤体正常率为37.2%,可明显降低卵母细胞染色体及纺锤体结构损伤(P<0.05),并明显提高卵母细胞的激活效果(P<0.05)。采用联合冷冻保护剂及玻璃化冷冻仪高速冷冻可较好维持猪卵母细胞染色体与纺锤体形态,但玻璃化冷冻明显影响猪卵母细胞体外受精后的发育能力。     

用直接移植法移植猪冷冻受精卵成功并产仔

全国农业协同组合联合会(JA全农)饲料畜产中央研究所95年7月5日宣布使用直接移植法将猪冷冻受精卵移植给受卵猪生产仔猪获得成功。使用直接法生产仔猪是世界首例。作为与茨城大学生物生产学科助教授高坂哲也的合作以及农林水产省的家畜受精卵移植技术组合的课题提出了该项研究。该研究组合的课题在95年度完成。因这次使用直接法达到了50％的产率。所以该研究所开始了面向实用化的试验。 JA全农打算将猪冷冻受精卵移植技术用于JA全农进行系统构建的SPF猪“°SP”的生产、系     

猪胚胎开放式拉长细管玻璃化冷冻保存研究

从20头供体母猪获得的291枚可用胚胎(囊胚/桑葚胚),采用二步法开放式拉长细管(OPS,openpulledstraw)玻璃化冷冻技术进行保存,即胚胎首先在冷冻液I(TCM199 20?S 10%EG 10%DMSO)中平衡3min,然后立即转入冷冻液II(TCM199 20?S 20%EG 20%DMSO 0.4mol/LSUC)中并在1min内装管,直接投入液氮保存;3个月后解冻移植给8头受体母猪,其中1头怀孕产仔(8头活仔),在我国首次获得猪胚胎超低温(-196℃)冷冻后代。     

销售细胞冻结保存液

日本全药工业公司3月10日销售能简便地冻结培养细胞、长期保存的冻结保存液。该公司销售研究支援用试药还是第一次。将来的冷冻保存液冻结时必须使用程序冷冻仪,另外在-80℃冷冻期间细胞逐渐死亡,必需用液氮保存或在1年内融解细胞,经增殖后再次冻结。如果使用,可放在-80℃或-50℃冷冻仪中长期保存,不需要程序冷冻仪和液体氮,没有必要定期融解和重新增殖。日本全药工业公司没有试药的销售过程,所以销售是十慈科学工业公司进行的。这种冷冻保存液是按某种比例配合了氨基酸、无机物、DMSO、血清制成的。分布的数据保存30个     

活体肺癌组织玻璃化保存的研究

保存活体的肺癌组织将为肺癌发病基因筛查和靶向药物筛选等体外实验研究提供更完整的样本信息. 本文对活体肺癌组织的玻璃化保存方法进行研究，首先采用针浸法玻璃化保存单块肺癌组织，对所需低温保护剂的浓度和平衡时间进行了优化；其次采用冻存管对多块肺癌组织样本进行玻璃化保存，对低温保护剂溶液体积以及平衡时间进行了优化；最后对慢速冷冻、不加低温保护剂快速冷冻、玻璃化冷冻3种冷冻方法的冻存效果进行比较并通过低温显微分析其冰晶损伤机理.结果表明，20% EG+20% DMSO+0.5 mol/L海藻糖作为低温保护剂，在平衡溶液和玻璃化溶液分别加载3 min和1 min时，针浸法和0.25 ml冻存管内玻璃化冻存，复苏后组织活力最高，分别约为79.96%与80.44%. 免疫组化显示玻璃化保存肺癌组织经过复苏后，相比慢速冷冻和无保护剂快速冷冻，组织结构损伤较小，组织内细胞TUNEL阳性表达较少. 低温显微结果表明，玻璃化保存组织内部及周围只出现少量细小冰晶，而慢速冷冻、快速冷冻组织皆出现明显冰晶.     

玻璃化法超低温保存对大叶藻种子活力的影响

通过设置玻璃化法超低温保存的3个关键要素,即冰冻保护液处理、玻璃化溶液脱水时间和冷冻处理,研究了玻璃化法超低温保存对大叶藻种子活力的影响.结果表明:冰冻保护液处理和玻璃化溶液脱水时间对大叶藻种子活力无显著影响;冷冻处理组种子活力显著低于对照组,而冰冻保护液和玻璃化脱水处理对冷冻后种子活力的影响不显著,表明冰冻保护液和玻璃化溶液未对种子起到明显的保护作用;未冰冻保护液处理组玻璃化溶液脱水4h时种子活力显著低于其他脱水时间,而冰冻保护液处理组脱水4h时与其他脱水时间无明显不同,表明较长时间的玻璃化溶液脱水处理需使用冰冻保护液进行预处理.研究结果为超低温保存大叶藻种子提供了参考.     

玻璃化法与低温冷冻法保存兔关节软骨异体移植的实验对比研究

目的:观察玻璃化法保存同种异体软骨移植修复兔关节软骨缺损的效果,并与低温冷冻法作比较.方法:18只健康成年日本大白兔,其中6只用于异体骨软骨柱的制备,另外12只随机分成2组,每组各6只.软骨移植物标本取材后,采用低温冷冻法和玻璃化法保存2w.同种异体骨软骨移植物相应复温后移植于兔膝关节软骨缺损模型的相应软骨缺损区.移植术后12w处死动物,移植区软骨组织后固定、切片、脱钙及石蜡包埋.采用苏木精-伊红染色及蕃红-O染色后进行组织学观察及Mankin评分.结果:玻璃化组软骨移植区颜色与周围正常软骨组织基本一致,软骨完整,无坍陷及裂纹;镜下观察可见其组织深层透明软骨样组织,浅层软骨区可见纤维样软骨组织,细胞成熟,大量分泌软骨基质.低温冷冻组软骨移植区表面欠光整,存在裂隙及轻度坍陷;镜下观察可见少量纤维样软骨组织,大部分为纤维结缔组织,细胞排列相对紊乱,软骨基质分泌量少.两组的组织学Mankin评分分别为9.6± 2.4和3.0± 1.0,低温冷冻组显著高于玻璃化组(t=2.014,P=0.000).结论:采用玻璃化法保存兔同种异体软骨移植物是一种可行的方法.相比低温冷冻法,玻璃化法保存的同种异体软骨其移植术后,软骨修复区的组织更接近正常软骨.     

植物种质的玻璃化超低温保存

植物种质的玻璃化超低温保存技术已受到广泛重视。玻璃化法主要由装载、玻璃化保护液脱水、降温、复温、洗涤这5个环节构成。目前已对百余种植物进行过玻璃化冻存研究,但主要应用于高等植物,而用该法保存藻类获得成功的报道很少。将玻璃化法用于某些藻类种质的冻存将会有广阔的应用前景。     

猪卵母细胞玻璃化冷冻的研究进展

配子冷冻保存技术在动物繁殖育种中具有重要的意义,但猪卵母细胞的冷冻保存目前还很困难,主要表现为冻后继续发育能力低。这与影响卵母细胞玻璃化冷冻效果因素众多有关,如脂滴的存在使猪卵母细胞对冷冻非常敏感。冷冻保护剂的使用同时也产生了毒性作用。针对猪卵母细胞冷冻保存的特点,研究人员已研究出了一些新的方法来提高冷冻效果,如细胞骨架稳定剂的使用减少了冷冻对猪卵母细胞造成的损伤,通过改进冷冻载体提高了冷冻速率,从而提高了冷冻效果。     

五种豆科药用植物种子超低温保存技术研究

以豆科药用植物降香檀、决明、含羞草、灰毛豆和猪屎豆的成熟种子为材料,探讨含水量对其发芽率的影响,以及超低温冷冻方式对种子超低温保存的影响。结果表明,降香檀、决明、猪屎豆和灰毛豆种子发芽率均随含水量的下降而从80%左右降至20%以下,而含羞草种子含水量低于10%时,其发芽率仍在75%以上。经超低温冷冻后,五种豆科药用植物种子发芽率较对照组均有显著差异;适宜的含水量下,种子经过超低温冷冻后其发芽率与对照组差异不显著,甚至高于对照组。三种冷冻方法中,玻璃化冷冻法更适合降香檀种子的超低温保存,缓慢冷冻法更适合猪屎豆种子的超低温保存,快速冷冻法适合于决明种子、灰毛豆种子和含羞草种子的超低温保存。由此可知,液氮超低温冷冻法保存降香檀等五种豆科药用植物种子是可行的。     

微流控法制备载卵母细胞水凝胶微球及其玻璃化保存

目的 通过微流控法制备载卵母细胞海藻酸钠微球,在低浓度保护剂下实现卵母细胞玻璃化保存。方法 采用流动聚焦型微流控芯片,通过调整芯片结构、海藻酸钠溶液浓度和流速比,制备大小均匀、空包率低、低温耐受的载卵母细胞海藻酸钠水凝胶微球。在低浓度低温保护剂下将微球玻璃化保存,复温后检测存活率,采用细胞松弛素B和氯化锶孤雌激活卵母细胞,与Cryotop玻璃化法对比卵母细胞存活率和卵裂率、囊胚率。结果 制备的海藻酸钠微球在冷冻复温前后的体积稳定且结构完整,在将卵母细胞包封在海藻酸钠水凝胶中后,空包率低,存活率、卵裂率和囊胚率与新鲜组相比无显著差异。在低浓度低温保护剂10% DMSO+10%乙二醇（EG）+0.5 mol/L海藻糖中玻璃化冻存后卵母细胞的存活率达到92.48%,卵裂率70.80%,囊胚率20.42%,与高浓度保护剂15% DMSO+15% EG+0.5 mol/L海藻糖中Cryotop玻璃化法相比无显著性差异。结论 本文设计制作了三通道内部交联芯片并用于卵母细胞玻璃化保存的微流控系统,可生成大小均匀、空包率低、低温耐受的载卵母细胞海藻酸钠水凝胶微球,在低浓度保护剂下实现玻璃化保存,为卵母细胞玻璃化保存方法提供新思路。     

小球藻的玻璃化超低温保存法

先用含0.5 m01·L-1甘油和0.4 mol·L-1蔗糖的预处理液处理20min,然后用含30%蔗糖 15%乙二醇 10%二甲基亚砜 BBMG培养液的玻璃化液处理,在0℃下预冻60min后,将小球藻投入液氮.此法存活率较高,可达到60.14%,小球藻种质保存效果较好.通过试验初步建立了小球藻玻璃化法超低温保存的技术程序.     

猪的冷冻精液试验

我们开展猪的冷冻精液试验,从1975年开始至1977年2月,已取得了实际产仔效果,14头母猪产了仔,平均每窝产仔9.57头,但授精效果颇不一致,初产母猪授精14头,情期受胎率50％,平均每窝产仔11.5头(8—14);经产母猪授精78头,情期受胎率14.1％,平均每窝产仔8.1头。目前正在继续开展提高冷冻精液授精效果的试验。现将试验的情况介绍如下。一、精液冷冻方法目前采取颗粒冷冻的主要操作程序,包括采精、过滤、稀释、降温、平衡、滴冻、保存等流程。 (一)采精用拳握法采集公猪精液,取其最浓稠部分,用灭菌的细纱布滤去精液中的胶状物质,然后检     

冰冻保存小新月菱形藻的包埋-玻璃化法

采用包埋-玻璃化法对小新月菱形藻进行冰冻保存,探讨玻璃化溶液(PVS)配方、装载液浓度和装载时间、脱水时间以及洗涤方法对冰冻保存存活率的影响。结果表明:小新月菱形藻在0℃预冷后50%PVS2装载60min,100%PVS2脱水60min,1mol·L-1蔗糖梯度洗涤30min的条件下存活率最高,为74.1%。包埋-玻璃化法不需要特殊的冷冻设备,冰冻程序操作简单,在藻类种质的超低温保存中有较大的应用潜力。     

海藻糖对猪精子冷冻真空干燥保存效果的影响

猪精子经冷冻干燥后,在光学显微镜和电子显微镜下观察其超微结构,并借助辅助生殖技术将其注入猪卵母细胞后,进一步观察受精卵的发育情况。结果表明：海藻糖组雄原核形成率 (68.52％)、卵裂率 (59.17％) 和囊胚率 (19.16％) 优于EDTA组 (64.59％、56.26％和15.62％) 和对照组 (35.36％、52.33％和8.60％) (P＜0.05);海藻糖组的冷冻真空干燥猪精子分别在4℃下保存60、120、180 d,雄原核形成率、卵裂率和囊胚率均无显著差异 (P＞0.05);海藻糖组的冷冻真空干燥猪精子复水化后孵育1 h和2 h,卵裂率、卵裂率和囊胚率均差异显著 (P＜0.05);海藻糖处理组与EDTA处理组中的冷冻真空干燥猪精子分别在4℃和?20℃下保存后各处理组间精子形态差异不显著 (P＞0.05);海藻糖组中B级冷冻真空干燥精子百分数显著多于EDTA处理组 (P＜0.05)。超微结构分析表明,冷冻真空干燥猪精子的损伤主要表现在顶体和颈部的肿胀与缺损、尾部断裂。     

猪卵母细胞玻璃化冷冻后细胞骨架的变化

为研究玻璃化冷冻后猪卵母细胞纺锤体、染色体和微丝的变化,从屠宰猪卵巢表面直径2—5mm卵泡中采集未成熟(GV)期卵母细胞,由GV期卵母细胞经成熟培养获得体外成熟(MⅡ)期卵母细胞。GV期和MⅡ期卵母细胞各分为3组对照组、冷冻保护剂处理组和玻璃化冷冻组。MⅡ期卵母细胞经分组处理后直接用于激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)观察样本;而GV期卵母细胞处理后先经44h成熟培养,再用作LSCM观察样本。供试卵母细胞经固定、免疫荧光染色后,于LSCM下观察。结果表明,冷冻保护剂处理组GV期卵母细胞经成熟培养后,其纺锤体结构、染色体排列与微丝分布正常率分别为42.9%、89.6%和28.6%;玻璃化冷冻组此3项指标的正常率分别为10.1%、36.4%和16.9%,两组间差异显著(P<0.05);除冷冻保护剂处理组染色体正常率与对照组无较大差异外,两试验组的其他指标均明显低于对照组(分别为79.5%、93.1%和72.3%,P<0.05)。MⅡ期卵母细胞冷冻保护剂处理组的纺锤体结构、染色体排列与微丝分布正常率分别为34.4%、61.3%和47.9%,而冷冻组分别为12.9%、56.7%和37.2%,两组均显著低于对照组(分别为78.3%、90.1%和72.8%,P<0.05)。结果表明,猪GV期和MⅡ期卵母细胞经冷冻保护剂处理或玻璃化冷冻保存后,均造成了纺锤体、染色体和微丝不可逆的损伤,这可能是影响卵母细胞成熟、受精与发育的重要原因。     

超低温冷冻对羯布罗香种子结构和生理生化特性的影响

为长期、稳定、有效地保存羯布罗香(Dipterocarpus turbinatus Gaertn.F.)种子,探讨了低温冷藏对种子活力、结构和生理生化指标的影响。结果表明,45%的含水量是种子的安全储藏含水量;玻璃化冷冻和缓慢冷冻对种子结构损害较大,且冷冻后的种子活力下降幅度大;快速冷冻法是种子超低温保存的最佳冷冻方式;液氮冷冻降低了种子过氧化物酶、过氧化氢酶和脱氢酶活性,提高了α-淀粉酶活性,而对丙二醛含量无显著影响。因此,超低温保存羯布罗香种子是科学可行的。     

有无卵丘细胞对猪GV期卵母细胞玻璃化冷冻的影响

本研究探讨卵丘细胞对猪GV期卵母细胞玻璃化冷冻效果的影响。根据卵丘细胞层数将体外收集的猪卵母细胞分成对照组、A组(3层以上卵丘细胞)、B组(2~3层以上卵丘细胞)、C组(裸卵),研究卵母细胞玻璃化冷冻后的存活率、成熟率和孤雌激活后发育潜能的变化。结果表明:玻璃化冷冻后B组和A组的卵母细胞存活率显著高于C组(p0.01);冻融后的卵母细胞在成熟率方面的表现为:A、B、C三组的成熟率分别为22.17%、27.2%和18.15%,其中B组的成熟率显著高于C组(p0.05),但均明显低于对照组(p0.01)。通过进一步的孤雌激活发现,冻融后卵母细胞的卵裂率、4~8细胞卵裂率和囊胚率在3组中均无显著性差异(p0.05),均显著低于对照组(p0.01),但B组与其中两组相比具有上升趋势。综上所述,玻璃化冷冻时保留部分卵丘细胞可以降低冷冻对猪GV期卵母细胞造成的损伤。     

动物种质细胞的超低温冷冻保存

目前不少种类的动物种质细胞都可在超低温条件下保存,随着低温生物学和生殖生物学的不断发展,超低温保存技术也在不断发展,可以保存的动物种质细胞范围也在不断扩大。但目前超低温保存技术面临的困难和需要解决的问题是如何提高种质细胞冷冻保存的效果,寻求最佳冷冻方案,降低种质细胞的冷冻损伤,进而运用超低温冷冻技术保护物种的多样性。从目前的研究情况来看,动物种质细胞超低温保存的常用方法有程序降温法和玻璃化法。防冻     

小鼠原核胚玻璃化冷冻保存技术的研究

目的　原核胚是转基因等生物技术所必需的主要材料 ,其冷冻保存使操作不受时间和空间的限制。另外 ,冷冻保存还可以避免体外培养过程中的细胞发育阻断期。方法　在室温 (2 0℃或 2 5℃ )条件下 ,以乙二醇、DMSO为主体抗冻保护剂配制成的玻璃化溶液 (EFS、EDT、EDFS) ,不借助冷冻仪 ,对小鼠原核胚进行一步法和二步法玻璃化冷冻保存。结果　 2 0℃室温条件下 ,用EDFS4 0平衡 1min一步法冷冻解冻后的原核胚 ,经培养后囊胚发育率最高仅为 4 7% ,与新鲜原核体外培养的对照组 (75 % )的差异极显著 (P <0 0 1) ;当原核在 10 %E +10 %D溶液中预处理 5min ,移入EDFS30中平衡 30s二步法冷冻保存 ,解冻后的囊胚发育率达 6 8%。而室温升至 2 5℃ ,二步法冷冻保存后原核胚的囊胚发育率高达 77% ,与对照组差异无显著性 (P >0 0 5 )。用最佳冷冻组的原核胚或解冻后培养到囊胚移植给受体母鼠均获得产仔。结论　本研究对小鼠原核胚实施玻璃化冷冻保存 ,经体外培养和移植结果与对照组无显著性差异 ,证明了本方法的可行性