与圈卷产色链霉菌分化有关的一个新基因—sawD的研究

距链霉菌发育分化控制启动子 Ｐ Ｔ Ｈ４ 直接控制的下游基因 ｐｒｏ Ｘ 间隔２４ 个碱基处存在一个部分开放阅读框 （ Ｏ Ｒ Ｆ） , 根据序列分析推测为丝氨酸蛋白酶的一部分。以此部分 Ｄ Ｎ Ａ 序列为探针, 在构建的圈卷产色链霉菌７１００ 的 Ｄ Ｎ Ａ 文库中克隆到一个与链霉菌发育和分化有关的新基因, 称之为ｓａ ｗ Ｄ。序列测定及分析结果表明, 在１３２０ｂｐ 的 Ｄ Ｎ Ａ 序列中有一个完整的开放阅读框 （ Ｏ Ｒ Ｆ） , 翻译起始位点为２１０ 位碱基处的 Ｇ Ｔ Ｇ, 终止密码子 Ｔ Ｇ Ａ 位于序列的９９９ 位碱基处。在距翻译起始位点 Ｇ Ｔ Ｇ 上游４ 个碱基间隔处有典型的核糖体结合位点区域 Ｇ Ａ Ｇ Ｇ Ｇ Ａ。在计算机蛋白文库中进行了同源性比较研究, 结果表明２６３个氨基酸的蛋白产物与 Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ 的依赖于 Ａ Ｔ Ｐ 的丝氨酸蛋白酶有４４７ ％ 的同源性, 其中存在功能活性区的丝氨酸保守位点 （ Ｇ Ｐ Ｓ Ａ Ｇ） 。基因功能研究表明, ｓａｗ Ｄ 在圈卷产色链霉菌发育分化中与气生菌丝分隔和色素的合成有关。该基因被阻断或破坏后, 使野生型圈卷产色链霉菌的分化停止在气生菌丝阶段, 不能形成具有灰色色素的孢子, 而出现白色     

与圈卷产色链霉菌分化有关的一个新基因——sawD的研

距链霉菌发育分化控制启动子P_TH4直接控制的下游基因proX间隔24个碱基处存在一个部分开放阅读框(ORF),根据序列分析推测为丝氨酸蛋白酶的一部分。以此部分DNA序列为探针,在构建的圈卷产色链霉菌7100的DNA文库中克隆到一个与链霉菌发育和分化有关的新基因,称之为sawD。序列测定及分析结果表明,在1320bp的DNA序列中有一个完整的开放阅读框(ORF),翻译起始位点为210位碱基处的GTG,终止密码子TGA位于序列的999位碱基处。在距翻译起始位点GTG上游4个碱基间隔处有典型的核糖体结合位点区域GAGGGA。在计算机蛋白文库中进行了同源性比较研究,结果表明263个氨基酸的蛋白产物与Caulobacter crescentus的依赖于ATP的丝氨酸蛋白酶有447%的同源性,其中存在功能活性区的丝氨酸保守位点(GPSAG)。基因功能研究表明,sawD在圈卷产色链霉菌发育分化中与气生菌丝分隔和色素的合成有关。该基因被阻断或破坏后,使野生型圈卷产色链霉菌的分化停止在气生菌丝阶段,不能形成具有灰色色素的孢子,而出现白色气生菌丝的表型。     

圈卷产色链霉菌分化基因sawB的结构与功能

以Sau3AI部分酶切野生型圈卷产色链霉菌7100(Streptomyces ansochromogenes 7100)染色体DNA,回收3～6 kb的DNA片段,插入到链霉菌表达载体pIJ702的BglⅡ位点,转化圈卷产色链霉菌白色突变株W19,得到了近3 000个转化子,从中筛选到了两个具有硫链丝菌素抗性和野生型灰色表型的转化子.进行了质粒提取和酶切分析,两个重组质粒分别命名为pNL-1和pNL-2(分别含有约5.2和5.8 kb的外源片段).通过亚克隆及突变株互补实验,将互补W19的基因定位在了1.25 kb的Pst Ⅰ-Apa Ⅰ片段上.DNA序列分析结果表明,该DNA片段中含有一个完整的可读框(ORF1),编码一个由295个氨基酸组成的蛋白质,该基因命名为sawB.利用Blast程序在蛋白数据库中比较发现,SawB与天蓝色链霉菌的一个转录调控蛋白WhiH具有81%的一致性.利用基因破坏策略研究了sawB的功能,结果发现,野生型菌株的sawB基因破坏后,丧失了孢子形成能力,由灰色表型转变为白色表型.显微镜下观察sawB突变株的气生菌丝长而直,顶部略有波浪形卷曲,螺旋程度有所下降.由此可知,sawB是与圈卷产色链霉菌形态分化有关的一个重要基因,它与菌丝螺旋及孢子形成直接相关.sawB的异源表达分析表明,sawB可互补天蓝色链霉菌whiH突变株C119,使之恢复到野生型表型,产生紧密螺旋及丰富的灰色孢子.     

圈卷产色链霉菌分化相关基因samR调控的初步研究

在野生型的圈卷产色链霉菌中,增加单个或多个拷贝数的samR,观察该基因对野生株表型和形态的影响。结果表明,samR的拷贝数的增加会使孢子形成提前,但是增加单拷贝的菌株与增加多拷贝的菌株所表现的增效作用相同。在大肠杆菌中对samR进行了GST融合表达和纯化,通过凝胶阻滞实验证明,SamR蛋白可与其上游的调控区特异性结合。由此推测samR是一个自调控基因。     

圈卷产色链霉菌分化相关基因——saw1的结构和功能

用双脱氧链终止法进行了分化基因——saw1的双链测序.结果表明在1500bp的DNA片段中有一个完整的开读框架(ORF),其编码区是在419bp至1252bp处.其产物与已知的天蓝色链霉菌whiG的氨基酸序列有89%的同源性.当把1500bp的saw1DNA片段插入到链霉菌表达质粒载体pIJ702后,构建的重组质粒转化天蓝色链霉菌孢子形成缺陷突变株C71,可使C71形成孢子和灰色色素.用基因破坏的策略进一步研究了该基因的生物学功能,结果表明saw1在圈卷产色链霉菌气生菌丝到孢子形成的发育转变中有重要作用,是分化中控制孢子发育起始的一个重要基因.     

圈卷产色链霉菌7100分化相关基因——sawE的结构与功能

以天蓝色链霉菌的whiB基因为探针,从圈卷产色链霉菌7100的总DNA部分文库中克隆了含有whiB同源序列的28kb DNA片段,并对其中的14kb片段进行了序列测定。序列分析表明,该片段含有一个完整的开放阅读框—sawE。预测的蛋白质结构及同源性分析显示,sawE与天蓝色链霉菌孢子形成早期的关键基因whiB高度同源,编码产物为一个调控蛋白。sawE的破坏使圈卷产色链霉菌7100的分化终止在气生菌丝阶段,在延长培养时间的情况下仍保持白色的表型,菌丝不能分隔,不能形成成熟的灰色孢子,结果表明sawE基因是一个与圈卷产色链霉菌分化有关的重要基因。     

圈卷产色链霉菌分化及其特性的研究

链霉菌分化的分子生物学研究是一个饶有兴趣并富有挑战性的世界前沿研究课题.在原核生物的分化研究中,主要以枯草杆菌(Bacillus subtilis)作为模式系统,但枯草杆菌的生命周期尤其是分化过程远比链霉菌简单,不象链霉菌有基质菌丝、气生菌丝、菌丝螺旋和孢子分隔那样的发育分化过程[1].在真核生物中也有分化研究的报道,如构巢曲霉、酵母等.由于真核生物的基因结构比原核生物复杂得多,弄清分化中基因调控的关系就更加困难.因此,选用链霉菌作分化研究的材料有其独一无二的优越性.国际上有关链霉菌的分子生物学研究,近年来主要以链霉菌的抗生素生物合成基因和链霉菌的分化基因两个大的方面作为研究的热点和主攻方向,并展开了一些开拓性的研究.     

链霉菌形态分化基因——白基因的研究

白基因(ｗｈｉ)是一类在链霉菌形态分化过程中具有重要作用的基因。由于这些基因的突变阻断了气生菌丝到孢子形成这一形态分化过程,相应的突变株在延时培养条件下仍保持白色的表型而得名。1972年,Ｈｏｐｗｏｏｄ和Ｃｈａｔｅｒ将50多个天蓝色链霉菌(Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ)白色突变株分成9个形态类型(ｗｈｉＡ,Ｂ,Ｃ,Ｄ,Ｅ,Ｆ,Ｇ,Ｈ,和Ｉ),并通过遗传作图将它们定位在了8个不同的基因位点上[1]。1975年,Ｃｈａｔｅｒ等通过分析双突变株的表型确定了五个白基因(ｗｈｉＡ,Ｂ,Ｇ,Ｈ和Ｉ)的上位关系[2]。在上述已确定的8…     

圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成基因——sanH和sanI的研究

通过反向遗传学方法克隆到圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成基因簇中约7.0kb的DNA片段。该片段除含有尼可霉素生物合成基因sanF外,对sanF上游约22kb的BglⅡDNA片段进行序列测定及分析表明,还含有两个完整的开放阅读框(ORF)。ORF1由1233个核苷酸组成,ORF2由195个核苷酸组成,它们分别编码由410个氨基酸残基和64个氨基酸残基组成的蛋白质,依次命名为sanH和sanI。蛋白序列数据库比较结果表明,SanH和SanI与浅灰链霉菌(\%Streptomyces griseolus)\%中共转录的细胞色素P450(cytochrome P450)和铁氧还蛋白(ferredoxin)有较高的同源性,一致性分别为46%和56%,相似性分别为62%和70%。基因功能研究表明,sanH基因的破坏虽不影响圈卷产色链霉菌产生的尼可霉素的生物活性,但该基因可能参与了尼可霉素羟基化反应的生物合成。     

圈卷产色链霉菌san7324和san7324L基因阻断对形态分化和尼可霉素产生的影响

【目的】圈卷产色链霉菌全局性调控基因wblA阻断突变后,尼可霉素不再产生。RNA-seq和转录分析表明san7324基因在野生型菌株中可以正常转录,而在wblA阻断突变株(ΔwblA)中不能转录,为此本文旨在揭示san7324与尼可霉素产生的关系。【方法】利用同源双交换策略对san7324进行基因阻断,而后通过基因遗传回补及对尼可霉素生物合成相关基因的转录分析等方法研究san7324的功能。【结果】在相同培养条件下,阻断突变株Δsan7324与野生型菌株相比失去了合成尼可霉素的能力。我们通过同源比对发现圈卷产色链霉菌中还存在一个与san7324同源的基因san7324L,该基因的阻断导致尼可霉素产量降低。当san7324和san7324L两个基因同时被阻断后,得到的突变株Δsan7324-san7324L生长稀疏而且不能正常发育分化形成灰色表型的孢子或孢子链,只能形成白色表型的气生菌丝,同时也丧失了合成尼可霉素的能力。当这两个基因(san7324-san7324L)回补双突变株后,则恢复了野生型的表型(能形成孢子链并恢复尼可霉素的产生)。进一步的研究初步表明san7324和san7324L的阻断主要影响了尼可霉素生物合成基因簇中途径特异性调控基因sanG的转录水平,从而影响圈卷产色链霉菌的发育分化和尼可霉素的产生。【结论】该结果为链霉菌形态分化与生理代谢关系的研究提供了更多的证据,同时为多效调控基因wblA作用机制的阐明奠定了基础。     

天蓝色链霉菌中分化发育基因参与同源性重组

在天蓝色链霉菌中,ＳＣＰ２＾＊质粒接合转移频率的快增长,ＳＣＰ２＾＊质粒介导的质粒同源性重组频率的快增长与气生菌丝的形成同步。在１株ｂｌｄ基因突变株中,３株ｗｈｉ基因突变株中,测定ＳＣＰ２＾＊质粒接合转移及其介导的质粒同源性重组,结果表明,除ｗｈｉＡ基因突变导致质粒接合转移频率不稳定外,其余３个基因突变对质粒接合转移不产生影响,但在所测定的４个基因突变株中,质粒同源性重组的频率降低超过１０掊。     

圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成基因sanA的克隆、结构和功能

圈卷产色链霉菌是尼可霉素产生菌,经紫外线诱变后,以赤星灰霉为指示菌筛选到遗传稳定的尼可霉素生物合成阻断突变株,选择其中的NBB19为受体,以质粒pIJ702为克隆载体,从野生型圈卷产色链霉菌的DNA文库中克隆到了6kb的DNA片段,能互补NBB19使之恢复尼可霉素的产生能力.对6kbDNA片段中的部分片段进行了序列分析,结果表明2710bpDNA片段包含一个1365bp的完整开放阅读框架,编码一个由454个氨基酸残基组成的蛋白质,该基因命名为sanA.蛋白序列数据库比较结果表明,sanA编码的蛋白质氨基酸序列与Pyrococcus horikoshii的甲基转移酶有较高的同源性,353个氨基酸残基中有25%的一致性.用基因破坏策略研究了sanA的功能,野生型菌株sanA基因被破坏后导致失去合成尼可霉素的能力,表明sanA是尼可霉素生物合成中的一个新的重要基因.     

圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成基因sanK的克隆及功能研究

利用染色体步移策略,以尼可霉素生物合成相关的基因片段为探针,从圈卷产色链霉菌中克隆到了一个大约10kb的DNA片段。对其中1.8kb的PvuII-SacII片段进行了序列分析,结果表明：此片段中含有一个具有1170个核苷酸的完整开放阅读框,起始密码子为447位的ATG,终止密码子为1614位的TGA,推测其编码一个389个氨基酸的蛋白质产物。利用BLASTX程序进行的分析揭示,此基因编码一个肌氨酸单体氧化酶。基因功能研究结果表明,此基因与圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成直接相关,命名为sanK。     

圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成基因-sanK的克隆及功能研究

利用染色体步移策略,以尼可霉素生物合成相关的基因片段为探针,从圈卷产色链霉菌中克隆到了一个大约１０ｋｂ的ＤＮＡ片段。对其中１．８ｋｂ的ＰｖｕⅡ－ＳａｃⅡ片段进行了序列分析,结果表明：此片段中含有一个具有１１７０个核苷酸的完整开放阅读框,起始密码子为４４７位的ＡＴＧ,终止密码子为１６１４位的ＴＧＡ,推测其编码一个３８９个氨基酸的蛋白质产物。利用ＢＬＡＳＴＸ程序进行了分析揭示,此基因编码一个肌氨酸单体     

天蓝色链霉菌分化调控基因scrX的功能研究

克隆天蓝色链霉菌中一个新基因scrX并进行了序列分析, 利用基因破坏策略进行了该基因的功能研究. 结果表明, scrX基因由660个碱基组成, 编码产物是一个220个氨基酸残基的蛋白质;该基因含有3个在链霉菌中的稀有密码子--AAA, AAA和ATA, 是典型的在翻译水平上受到严紧调控的分化调控基因. 氨基酸序列同源性比较结果表明, scrX编码蛋白属于原核生物转录调控蛋白IclR家族.基因功能研究结果揭示, scrX基因在天蓝色链霉菌孢子形成中可能起正调控作用.     

圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成基因：—sanJ的克隆及功能研究

以尼可霉素生物合成相关的基因片段为探针,从圈卷产色链霉菌cosmid基因文库中筛选到１个大约７．５kb的ＤＮＡ片段,交ＤＮＡ片段克隆到载体pBluescripM13-的KpnⅠ位点,得到了重组质粒pNL2200.对pNL2200中外源ＤＮＡ片段进行了一系列的亚克隆及部分核苷酸序列分析。结果表明,２．３kb的SalⅠ－ＢaｍＨⅠＤＮＡ片段中含有１个完整的开放阅读框,起始密码子为２７１位的ＧＴＧ,终止密码子为１９５４位的ＴＧＡ,该基因的大小为１６８６bp,编码１个大小为５６１个氨基酸的蛋白质产物。利用blastx程序的蛋白质数据库中进行同源比较,结果揭示此基因产物与腺苷酸形成酶超家族的连接酶有４４％的一致性,此外,该基因的破坏导致圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成能力的丧失,证明它是尼可霉素生物合成所必需的,命名为其为sanＪ。     

与链霉菌发育分化有关的启动子——PTH4的调控研究

依赖于天蓝色链霉菌分化关键基因——whiG的发育调控启动子(P_TH4)所控制的下游基因被克隆了,用双脱氧链终止法进行了双链测序.结果表明在1597bp的DNA片段中含有一个完整的开读框架(ORF).在计算机的蛋白文库比较中未找到与该基因产物同源的已知蛋白,可能是一个新的蛋白产物.用基因破坏的策略初步研究了该基因的生物学功能,发现该基因的破坏影响了放线紫红素的产生,即与天蓝色链霉菌放线紫红素的生物合成有关.这进一步证明启动子——P_TH4在链霉菌分化中的多级调控作用.     

圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成基因一sanL的结构与功能

利用染色体步移策略,以尼可霉素生物合成相关的基因片段为探针,从圈卷产色链霉菌中克隆到了一个大约10kb的DNA片段.序列分析表明此片段中除含有sanK外,在sanK的上游还有一个完整开放阅读框——sanL.sanL与sanK的转录方向相同,具有1281个核苷酸,起始密码子为345位的ATG,终止密码子为1623位的TGA.利用Blastx程序进行的分析揭示,此基因可能编码一个赖氨酸-2-氨基转移酶.基因功能研究表明,该基因是圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成所必需的.     

圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成基因—sanL的结构与功能

利用染色体步移策略,以尼可霉素生物合成相关的基因片段为探针,从圈卷产色链霉菌中克隆到了一个大约10kb的DNA片段。序列分析表明此片段中除含有sanK外,在sanK的上游还有一个完整开放阅读框——sanL。sanL与sanK的转录方向相同,具有1281个核苷酸,起始密码子为345位的ATG,终止密码子为1623位的TGA。利用Blastx程序进行的分析揭示,此基因可能编码一个赖氨酸2氨基转移酶。基因功能研究表明,该基因是圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成所必需的。