小RNA分子与精子发生调控

近来研究发现小RNA(small RNAs)可作为转录后及翻译水平上基因表达调节的重要调节因子,利用小RNA来阐明调节精子发生的分子机制取得了显著进展。这些小RNA主要分为3类,即小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)以及与piwi蛋白相互作用的RNA(piRNA)。在减数分裂和精子发生过程中,小RNA具有多种生物学功能,如利用siRNA体外转染或体内注射来敲低特定基因从而研究该基因在精子发生过程中的作用;miRNA可能参与精子发生中有丝、减数及后减数分裂阶段的基因表达调节;piRNA主要参与调节雄性生殖细胞减数及后减数分裂的过程,在精子发生中起抑制反转录转座子(retrotransposons)的作用。文章对小RNAs合成、作用机制、功能及展望等最新进展进行了综述。     

siRNA核糖分子化学修饰对RNAi功能的影响

RNA干扰(RNAi)是基于正常RNA生理调节反应,主要由小干扰RNA(siRNA)引发的转录后基因沉默现象.RNAi技术是基因功能研究的重要手段.目前困扰siRNA进入临床的主要困难有siRNA分子易降解、稳定性差、转运效率低、存在靶外效应和免疫刺激反应等.siRNA分子骨架中核糖化学修饰能够一定程度克服上述障碍,降低siRNA给药剂量,减少副作用,是siRNA进入临床最可能的方式.对核糖分子常用位点尤其是2-′羟基化学修饰后siRNA分子的药动学性状及RNAi功能做了分析.     

核糖核酸干扰(RNAi)在生物医学研究中的应用

核糖核酸干扰(RNAi)是指一个由双链RNA诱导具有相同碱基序列的靶标RNA降解的现象,它是沉默基因表达的一个十分有效的手段．RNAi导致基因沉默的机制可分为以下两步：首先由核酸酶Dicer切割长的双链RNA形成小片段碱基(19—25)的siRNA．然后,这些siRNA组成一个RNA诱导沉默复合体(RISC),并且siRNA被一个内源激酶磷酸化,双链siRNA打开,让反义RNA引导RISC至其目的信使RNA(mRNA)．从而使其目的mRNA内切降解．RNAi技术可以应用到许多生命科学研究方面,如功能基因组以及医药研究．同时讨论了RNAi的一些最新进展如siRNA的设计和导入细胞的方法．     

piRNA的生物学功能

非编码小RNA（non-coding RNA, ncRNA）主要有siRNA（small interfering RNA）、miRNA(microRNA)和piRNA (piwi-interacting RNA)三类,其中piRNA是近年来新发现的一类小RNA分子,特异性地同Argonuat蛋白家族中的Piwi亚家族蛋白结合,主要在生殖细胞系中表达,对维持生殖系DNA完整、抑制转座子转录、抑制翻译、参与异染色质的形成、执行表观遗传调控和生殖细胞发生等均有重要作用．piRNA基因几乎遍布于整个基因组,但呈高度不连续性分布,大部分定位于20～90 kb的染色体基因簇上．与来自于双链RNA的siRNA和发卡结构miRNA不同之处是piRNA来自长单链RNA前体,或者是两股非重叠的反向转录前体,其生成与Dicer无关．作为调节RNA（riboregulator）,piRNA和miRNA可能在动物起源早期就已经出现了,帮助生命进入了一个多细胞动物的时代,产生了今天的生物体复杂性和多样性．piRNA成为ncRNA的研究热点,进展飞快,有很多综述及时介绍piRNA的研究进展,本文结合siRNA、miRNA的特点介绍了关于piRNA的形成机制和作用的最新研究成果．     

小分子G蛋白Rap1 shRNA表达载体的构建和鉴定

应用RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术抑制Rap1基因的表达,构建RaplshRNA（small hairpin RNA．shRNA）表达载体,观察其对小鼠肝脏细胞中RaplmRNA和蛋白表达的干扰作用．根据小鼠RaplmRNA的全序列．设计了3种Rap1 siRNA序列（Rap1 siRNA1、Rap1 siRNA2、Rap1 siRNA3）和阴性对照序列（HK）;采用克隆技术,将其插入带有报告基因绿色荧光（EGFP）的pGenesi1－3载体,构建RaplshRNA表达载体：经双酶切和测序证实Rap1 siRNA表达载体克隆构建成功,插入片段测序结果与合成的siRNA结果一致：昆明小鼠40只,体重18～20g,随机分成4组：I组（转染HK组）、Ⅱ组（转染RaplshRNAl组）、Ⅲ组（转染RaplshRNA2组）、Ⅳ组（转染Rap1 shRNA3组）．于0、16、24h腹腔内注射Rap1 shRNA2．0－2．5mg／kg（用PBS稀释至1mL）：48h后收集小鼠肝脏．用显微荧光、定量RT—PCT、免疫组化检测小鼠肝细胞中Rap1 shRNA的转染率、Rap1基因表达以及蛋白质表达水平．I组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组小鼠肝脏细胞体内转染率均大于60％．Ⅱ组、m组、Ⅳ组的RaMmRNA表达、Rap1蛋白表达均降低．其中Rao1 shRNA1干扰效果最佳．     

真核生物中的微小RNA及其功能研究进展

真核生物中存在两种主要的非编码RNA(non-coding RNA),在真核生物中发挥重要作用。一类为微小RNA(microRNA,miRNA),另一为小干扰RNA(siRNA)。miRNA大小为19～25nt,在体内与蛋白质形成核糖核蛋白复合体(miRNP),在真核基因的表达调控,生长发育中起重要作用。siRNA在RNA干扰(RNA地 interference,RNAi)途径中起定位特异mRNA的作用。miRNA与siRNA有联系也有区别。miRNA在真核生物中的调控机制具有保守性。     

VEGF特异的2’-脱氧修饰siRNA能够有效的抑制VEGF的表达和小鼠鼻咽癌异体移植瘤的生长

血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）在肿瘤血管生成中起重要作用,并在多数肿瘤中表达上调,为使用针对VEGF的小干扰RNA（VEGF siRNA）治疗肿瘤提供了重要的作用靶点,然而,不清楚VEGF表达的大幅上调是否会影响VEGF siRNA的干扰效率．本文研究VEGF siRNA能否在VEGF的表达大幅上调的鼻咽癌细胞（CNE）中有效抑制VEGF的表达,并进一步研究VEGF siRNA作为潜在的抗癌制剂的应用方法．为增加siRNA的稳定性,对VEGFsiRNA进行了2’-脱氧（2＇-deoxy）化学修饰,再将修饰后的VEGF siRNA导入经低氧诱导而高表达VEGF的CNE细胞,30h后用ELISA,Western blot结果分析和RT-PCR等方法鉴定其抑制CNE细胞表达VEGF的效果,结果证明VEGF的表达被明显抑制,用化学修饰的VEGF siRNA治疗裸鼠的鼻咽癌移植瘤,将VEGF siRNA与脂质体混合后,注射到肿瘤局部,然后进行超声照射,每周治疗2次,3周以后处死裸鼠、分离肿瘤并测量瘤重．结果显示上述治疗能明显抑制鼻咽癌移植瘤的生长．     

RNA干扰抑制SiHaB2细胞中Bcl-2基因的表达

Bcl-2基因作为细胞凋亡的一个潜在抑制剂调节细胞的死亡,抑制恶性肿瘤细胞中Bcl-2基因的表达可促进肿瘤细胞的凋亡。采用RNA干扰技术,合成了含有21个核苷酸的小双链干扰RNA（siRNA．Bcl-2）,并构建了含有19个核苷酸基因的质粒载体（pSilencer2．1-U6-Bcl-2）,把合成的siRNA．Bcl-2和pSilencer2．1-U．Bcl-2分别转导入Bcl-2高表达的细胞株SiHaB2中,通过Western印迹检测,免疫荧光法检测及DNA梯（ladder）检测,可观察到在导入siRNA．Bcl-2和pSilencer2．1-U．Bcl-2的SiHaB2细胞被培养72h后,可以明显抑制Bcl-2蛋白的表达。     

MicroRNA——关节炎治疗的新靶点

关节炎是一种较为常见的累及运动系统的慢性疾病,可分为骨性关节炎和风湿性关节炎等．我国北方地区冬季寒冷,该病发病率较高．小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）是一类长度约为21～23对核苷酸的双链小分子RNA,参与基因沉默,已经应用于关节炎治疗的研究中. MicroRNA(miRNA）是一类内源性小分子RNA．其常规作用方式是通过与靶基因的3′UTR结合抑制靶基因的表达．目前,已有研究表明miRNA与关节炎发病联系密切．通过局部注射等多种途径,向体内递送各种经过修饰的miRNA能够发挥改善关节炎症状等作用．这些研究提示miRNA将成为关节炎治疗的新靶点．     

TAK1siRNA对C2C12细胞内TAK1基因表达的影响

目的:高效下调TAK1基因表达的小干扰RNA(siRNA)分子的获得.方法:采用脂质体转染方法,将3对(siRNA ID#94455、siRNA ID # 94549、siRNA ID # 189006)人工合成的TAK1基因特异的小干扰RNA(siRNA)分子分别导入小鼠成肌细胞C2C12中,采用实时荧光定量PCR方法分析细胞内TAK1基因的相对表达.结果:和对照组相比,siRNA ID # 94455、siRNA ID # 94549和siRNA ID # 189006分别下调了细胞内TAK1基因的mRNA表达水平33.34%、46.73%和79.97%.结论:实验获得了能够高效下调TAK1基因表达的siRNA.     

猪肌肉生长抑制素RNA干涉载体的构建与验证

目的:构建针对猪肌肉生长抑制素mRNA的RNA干涉载体,并体内验证其有效性。方法:分别体外转染化学合成4个19 bp的siRNA片段获取针对肌肉生长抑制素的序列,构建RNA干涉载体,将上述载体注射到猪股四头肌中,RT-PCR检测证明其表达有效性及生肌调节因子mRNA水平的变化。结果:获得了针对肌肉生长抑制素的2个小干涉RNA序列,构建了2个重组载体,股四头肌注射混合后的等量重组载体,RT-PCR显示注射重组RNA干涉载体可显著降低肌肉生长抑制素的mRNA水平(约降低了40%),生肌调节因子mRNA水平显著上调(分别约为对照组的2.1～3.9倍)。结论:该试验为在转基因动物的肌肉中表达外源基因奠定了基础。     

利用拟南芥杂交组合研究siRNA与等位基因DNA甲基化调控中的联系

近年来,越来越多的实验结果表明,表观遗传因子,如DNA甲基化、小RNA、组蛋白修饰等在杂种优势形成中起到重要作用,然而对于这些表观遗传因子在F。中遗传调控方式的认识仍很有限．本实验室先前工作曾以拟南芥C24和Ler两种生态型及其正反交子一代为材料,运用新一代测序方法获得该杂交组合中DNA甲基化及小RNA单碱基分辨率的全基因组图谱．本文进一步对这批数据中的等位基因DNA甲基化水平进行分析,区分DNA甲基化遗传过程中的顺式与反式调控方式,并发现这两种调控方式均有重要的贡献．研究发现,siRNA与DNA甲基化的两种调控方式有密切联系,尤其在DNA甲基化的反式调控中,Fl中DNA甲基化变化程度越大,该区域内siRNA富集程度越强,二者可能存在某种调控机制．通过等位基因表观遗传组的分析研究杂交过程中DNA甲基化和小RNA遗传调控的规律,为更好地理解杂种优势机制提供了帮助．     

小发夹RNA在稀有(鱼句)鲫胚胎中的表达

由小的干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)是近年来快速发展的一种转录后基因沉默方法,已被广泛的应用于基因功能的研究,基因网络调控的探讨以及疾病的治疗等方面.多数的siRNA表达载体依赖RNA聚合酶Ⅲ启动子中的一种,操纵一段短发夹结构RNA(Small hairpin RNA,shRNA)在细胞或体内表达.这一类启动子主要包括人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子等.为了探明鱼类自身的RNA聚合酶Ⅲ启动子是否能有效驱动shRNA在鱼体内表达,从而更好地利用RNAi进行鱼类基因功能和抗病毒研究,研究利用斑马鱼的H1和u6启动子以及草鱼的H1启动子,以草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)外衣壳蛋白VP7基因为靶基因,以增强型绿色荧光蛋白(eGFP)为报告基因,分别构建了三个shRNA表达载体:pZH1siGCRV-CMVeGFP、pZU6siGCRV-CMVeGFP和pCH1siGCRV-CMVeGFP.通过显微注射将三种表达载体分别导入稀有(鱼句)鲫(Gobiocypris rarus)受精卵中.由于siRNA片段很短,其表达检测非常困难,研究采用stem-loop RT-PCR方法,对稀有(鱼句)鲫胚胎发育不同时期的shRNA表达进行了检测.研究结果表明,采用的三种鱼类自身的RNA聚合酶Ⅲ启动子均能有效驱动GCRVsiRNA的表达;在取样的各个胚胎发育时期均能检测到GCRV siRNA的表达;stem-loop RT-PCR方法可以便捷检测siRNA的表达.研究构建的鱼类胚胎siRNA有效持续表达载体,建立的简易快捷siRNA检测方法,为进一步的抗GCRV转基因鱼研制以及siRNA的病毒复制干扰机制研究奠定了重要基础并提供有力的技术支撑.     

小RNA分子研究进展

在过去很长的一段时间内,RNA始终没有得到科学家足够的重视,直到非编码性小RNA（non—coding small RNA）的出现,使得研究者对RNA功能的传统观念发生了惊人的改变。生命体内存在着大量的miRNA、siRNA与piRNA,它们在不同水平上调节着基因的表达,影响生命活动。另外一些较长的非编码RNA广泛地参与到细胞内不同的生化过程中。发挥重要作用。随着小分子RNA的发现至今,RNA的研究领域进入炙手可热的状态,RNAi的机制在一步步被完善与深化．更多新类型的小分子RNA被发现。在应用方面,siRNA已经成为分子生物学实验中一种简单而有效的基因沉默工具,并且在人类疾病治疗方面初有成效。     

小RNA家族的新成员—piRNA

microRNA (miRNA)和small interfering RNA(siRNA)在真核生物生命活动的基本过程中发挥着重要的调节作用。随着对siRNA和miRNA研究的不断深入, 最近科学家在研究大鼠雄性精子时发现哺乳动物睾丸内存在另一种新型的小RNA分子, 该分子在精子发生过程中起着重要的生理调节作用, 该种小分子RNA被命名为piRNA, 在功能、分布和分子特征等方面piRNA较miRNA和siRNA存在着显著的不同, 对piRNA深入研究有望揭示出机体内在的基因表达调节机制。     

小RNA,大本领:22 nt siRNAs在植物适应逆境中的重要作用

RNA是传递生命遗传信息的重要介质。依据RNA是否编码蛋白质,可分为编码RNA和非编码RNA。作为非编码RNA的核心种类之一,小RNA在各种生命活动中均发挥重要调控作用,其产生及功能发挥依赖于不同的DCL、RDR和AGO蛋白。目前,植物中功能和调控方式较为明确的是以21 nt为主的miRNA和24 nt siRNA,其它长度和类型的小RNA由于积累水平通常较低,尚知之甚少。近日,南方科技大学郭红卫团队发现,拟南芥(Arabidopsis thaliana)在缺氮等逆境胁迫下可产生大量依赖于DCL2和RDR6的22 nt siRNA。22 nt siRNA与AGO1结合形成效应复合物,抑制硝酸还原酶基因(NIA1和NIA2)等mRNA的翻译效率,从而减少植物在营养缺失条件下的能量消耗。这意味着,当植物遇到不利环境时,虽然无法通过移动来逃避逆境,但可通过诱导产生小RNA,协调和平衡正常的生长发育与胁迫响应。     

番茄丛矮病毒p19蛋白抑制转录后基因沉默作用机制

RNA干扰（RNA interference,RNAi）是真核生物体内由双链RNA（double—stranded RNA）介导的同源RNA降解现象。在细胞内,长的dsRNA被Dicer酶切割成21～26核苷酸（nucleotide,nt）的小干扰RNA（small interfering RNA或short interfering RNA,siRNA）;siRNA与多种蛋白结合后形成RNA诱导沉默复合物（RNA—induced silencing complex,RISC）,同时解链;有活性的RISC可在siRNA的指引下与互补的转录物结合,并导致RNA的降解,     

哺乳动物细胞小干扰RNA库的建立和应用

双链小干扰RNA（siRNA）在多种类型细胞中介导特异性的基因沉默,这一现象的发现为深入研究单个基因的功能提供了重要的方法学基础,从而得到了广泛的应用.最近的文献报道了全基因组siRNA库的建立,为高通量基因功能分析和研究提供了新的方法,成为新的研究热点.小干扰RNA库可以用来筛选和研究介导细胞复杂表型和生物学过程的关键基因,通过建立一系列具有目的表型的细胞系,有可能对特定细胞信号调节通路进行更为全面的解析.本文综述了目前在siRNA建库方法方面的进展,并探讨了建立小干扰RNA库中的关键问题.     

小RNA, 大本领: 22 nt siRNAs在植物适应逆境中的重要作用

RNA是传递生命遗传信息的重要介质。依据RNA是否编码蛋白质, 可分为编码RNA和非编码RNA。作为非编码RNA的核心种类之一, 小RNA在各种生命活动中均发挥重要调控作用, 其产生及功能发挥依赖于不同的DCL、RDR和AGO蛋白。目前, 植物中功能和调控方式较为明确的是以21 nt为主的miRNA和24 nt siRNA, 其它长度和类型的小RNA由于积累水平通常较低, 尚知之甚少。近日, 南方科技大学郭红卫团队发现, 拟南芥(Arabidopsis thaliana)在缺氮等逆境胁迫下可产生大量依赖于DCL2和RDR6的22 nt siRNA。22 nt siRNA与AGO1结合形成效应复合物, 抑制硝酸还原酶基因(NIA1和NIA2)等mRNA的翻译效率, 从而减少植物在营养缺失条件下的能量消耗。这意味着, 当植物遇到不利环境时, 虽然无法通过移动来逃避逆境, 但可通过诱导产生小RNA, 协调和平衡正常的生长发育与胁迫响应。     

小RNA的组成和功能——三类内源小RNA的研究概况

生物体中存在许多非编码的小RNA,可通过与靶mRNA完全或不完全的碱基互补配对,致使mRNA断裂或翻译抑制,从而达到调节基因表达的目的。这些小RNA组成了细胞中高度复杂的RNA调控网络,在生物的各项生理活动、生长发育过程中发挥着十分重要的作用。内源小RNA主要包括miRNA、siRNA和piRNA三类,概述这3种小RNA的生物发生,作用机制及功能等方面的研究进展。