转石蒜凝集素基因烟草的抗蚜虫性

利用农杆菌介导法将质粒pBILRA转化烟草(Nicotianatabacum L.),该质粒含有由花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)引导的筛选基因新霉素磷酸转移酶基因(nptⅡ)及石蒜凝集素基因(lra).通过卡那霉素筛选获得了25株独立转基因烟草植株.Western blot分析表明,石蒜凝集素蛋白在不同转基因植株中表达量不同.对转基因T1代植株的遗传分析表明,lra基因在大多数独立转基因植株后代中以孟德尔3:1的分离比方式遗传.抗虫试验表明,表达较高水平石蒜凝集素蛋白的转基因烟草对桃蚜种群的生长具有明显的抑制作用.首次报道了表达石蒜凝集素基因的烟草对蚜虫具有抗性.石蒜凝集素基因可用于植物抗虫基因工程研究及应用.     

ipt基因促进矮牵牛遗传转化效率及热激启动子驱动基因删除

本研究主要探讨ipt基因对矮牵牛遗传转化不定芽诱导影响及拟南芥热激启动子hsp18.2驱动重组酶基因flp的热诱导外源基因删除表达载体在矮牵牛中的基因删除效果.本研究中将植物表达载体pBin-hsp18.2:flp-35S:ipt及对照载体pBin-hsp18.2:flp遗传转化矮牵牛,以获得转基因植株,分析比较不定芽的诱导和转基因植株进行的热激基因删除.研究结果表明,ipt基因可促进矮牵牛遗传转化过程中不定芽的诱导,其不定芽诱导率为21.5%,显著高于对照的8.7%.在44℃,6 h,热激6次的条件下,转基因矮牵牛植株表型恢复正常,经 GUS蛋白表达分析及PCR、RT-PCR检测,证明外源基因已经被删除.转基因矮牵牛基因删除效率最高可达43.8%.本研究为ipt基因在一些遗传转化困难植物转基因中的应用奠定了基础.     

转石蒜凝集素基因烟草的抗蚜虫性

利用农杆菌介导法将质粒pBILRA转化烟草(NicotianatabacumL.),该质粒含有由花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)引导的筛选基因新霉素磷酸转移酶基因(nptII)及石蒜凝集素基因(lra)。通过卡那霉素筛选获得了25株独立转基因烟草植株。Westernblot分析表明,石蒜凝集素蛋白在不同转基因植株中表达量不同。对转基因T1代植株的遗传分析表明,lra基因在大多数独立转基因植株后代中以孟德尔31的分离比方式遗传。抗虫试验表明,表达较高水平石蒜凝集素蛋白的转基因烟草对桃蚜种群的生长具有明显的抑制作用。首次报道了表达石蒜凝集素基因的烟草对蚜虫具有抗性。石蒜凝集素基因可用于植物抗虫基因工程研究及应用。     

绿色荧光蛋白基因作为报告基因在水稻基因转化中的应用研究

本研究中 ,构建了含有编码绿色荧光蛋白的改进型基因质粒pJPM5。用基因枪法分别把pJPM5和另一带有绿色荧光蛋白基因的质粒pSBG70 0转入水稻TNG6 7愈伤组织。用South ern杂交法证实了转基因的存在 ,而且表明多数转基因植株含有 1到 8个拷贝的转基因。取 2个月的转基因植株上的叶片用于分析绿色荧光蛋白基因表达。用SLM - 80 0 0荧光分析仪定量测定绿色荧光蛋白。多数转基因植株具有很高的绿色荧光蛋白信号。虽然水稻植株有少量自发荧光 ,但是绿色荧光蛋白基因表达出的绿色荧光蛋白信号比植株的自发荧光强得多 ,其测定不会受自发荧光的太大影响。在荧光显微镜下观察到了绿色荧光蛋白基因的表达。借助观察分析绿色荧光蛋白基因的瞬时表达 ,本研究还发现基因枪法转化中 ,如果两枪的气压为90 0psi& 135 0psi,比两枪的气压都为 90 0psi或者 135 0psi更好 ,因其能使质粒进入更多的细胞。研究结果表明 ,绿色荧光蛋白基因可以作为水稻 (甚至小麦、玉米 )转基因研究中的报告基因。研究还显示 ,MAR序列能明显增强绿色荧光蛋白基因的表达能力 (这一结果在另文讨论 ) .     

转金属硫蛋白αα突变体基因的矮牵牛对铅的抗性及积累的研究

利用农杆菌介导的方法将MT及αα基因导入矮牵牛中.转基因植株对铅(Pb)的抗性及吸收能力明显高于对照.转MT及αα基因的植株分别能在150及200 μmol/L Pb中正常生长，而对照只能在50 μmol/L Pb中正常生长.转MT及αα基因植株后代种子萌发与对照相比表现出明显的抗Pb优势.Pb的吸收实验表明转MT、αα基因的植株对Pb的吸收分别比对照提高了28%和35%.     

玉米醇溶贮藏蛋白基因启动子PCR扩增及其驱动GUS基因在转基因烟草种子中的表达

以玉米(Zea mays L.)黄化苗为材料,利用PCR技术扩增了玉米19kDa醇溶贮藏蛋白基因(zein)起始密码子上游启动子片段,序列分析结果表明,克隆的-1～-694片段具有19kDa zein启动子特点,与同一家族中其它基因的对应区段同源性达90％以上。将此启动子插入pPKGT的GUS基因及NOS终止子上游构成表达载体。经农杆菌转化烟草(Nicotiana tabaccum Var.samsum),得到了转化植株。转化的烟草的PCR扩增及Southern杂交证明目的片段已整合到烟草基因组中。转基因植株的GUS活性检测表明,在叶、根中无GUS活性,GUS活性只存在于种子中。转基因植株烟草种子经冷冻切片,GUS底物Xgluc活体组织染色证明GUS活性只存在一层介于种子胚乳与种皮之间的细胞中。     

种子特异表达异源DGAT1基因提高大豆种子含油量和营养品质

为提高大豆Glycine max种子含油量和营养品质,文中以二酰甘油酰基转移酶1(Diacylglycerol acyltransferase 1,DGAT1)基因为遗传修饰靶标。将来自高油植物斑鸠菊Vernonia galamensis L.编码DGAT1酶蛋白的c DNA克隆Vg DGAT1A在大豆种子特异超表达。连续选择获得高代(T7)Vg DGAT1A转基因大豆株系。转基因株系表型鉴定显示,在大豆种子发育中期(30–45 DAF),Vg DGAT1A高表达,相应地DGAT酶活性是非转基因野生型和空载体转化对照的7.8倍。转基因成熟种子含油量比对照提高了5.1%,淀粉含量比对照减少2%–3%,蛋白质含量与对照无显著差异。此外,转基因大豆种子百粒重(14.5 g)和种子萌发率(95.6%)与对照亦无明显差异。种子油脂脂肪酸成分分析显示,转基因大豆种子油中抗氧化的油酸(C18:1Δ9)含量比对照提高8.2%,相应地易氧化的亚油酸(C18:2Δ9,12)和亚麻酸(C18:3Δ9,12,15)分别减少6%和2%。这些数据表明,种子特异超表达外源Vg DGAT1A基因,打破了大豆种子含油量和蛋白质含量的负连锁,显著提高种子含油量且未导致蛋白含量降低。转基因大豆种子重量和萌发率亦未显负效应,而且种子油脂抗氧化性和营养品质得以改善。研究表明应用这一高酶活性Vg DGAT1A的基因工程是提高种子含油量和改善油脂品质的一条有效途径。     

甘蓝型油菜Fad2基因的RNA干扰及无筛选标记高油酸含量转基因油菜新种质的获得

利用已获得的油莱种子贮存蛋白——十字花科蛋白（cruciferin）基因的启动子和终止子,构建了无选择标记基因且同时具有正义及反义结构的油酰去饱和酶基因（Fad2）种子特异表达RNAi载体,并通过农杆菌介导的转化,获得了只含有油菜原有基因且Fad2基因表达受抑制的转基因植株。RT—PCR分析结果表明,在油酸含量达到83.9％的转基因植株中未检测到在非转基因植株中普遍存在的Fad2基因转录mRNA——一种典型的RNA干扰现象。通过对植株生长发育状态的观察比较,该高油酸含量转基因株系并未表现出双突变体中由于Fad2基因的失活所引起的植株抗寒能力差、发育迟缓、花蕾死亡、结实率低等不利农艺学性状。     

水稻OsBP-73基因表达需要其内含子参与

该实验室以前的研究表明,水稻OsBP-73基因含有2个外显子和1个长度为2 471 bp的内含子.该文报告用OsBP-73基因ATG翻译起始密码子(在第1外显子中)上游序列(1- 818～ 215)与GUS基因构成嵌合质粒pRSSl,将该质粒转化水稻后,在抗性愈伤组织和转基因植株中未能检测到GUS基因的表达.只有用含有完整的内含子及其上游序列(1 818～ 2 844)与GUS基因构成嵌合质粒(p13GNF)时,才能在p13GNF的转基因抗性愈伤组织和植株中检测到GUS基因的表达.实验还证明,单是内含子序列并不能驱动GUS基因在转基因水稻中表达.由此推测:OsBP-73基因的启动子序列驱动基因表达时,需要基因内含子的参与.     

绿色荧光蛋白(ZsGreen)基因在长石莼细胞中的表达

主要研究绿色荧光蛋白(ZsGreen)基因在长石莼(缘管浒苔)细胞中的表述.应用绿色荧光蛋白基因、抗除草剂bar基因、CMV 35S启动子和SV40双启动子构建了质粒载体PSV-bar-ZsGeen,采用改进的PEG法将质粒载体PSV-bar-Zs-Geen导入到缘管浒苔原生质体中,经过细胞培养发育再生藻株,通过除草剂筛选出阳性藻株,且转化率达38.58％,进一步PCR分子检测和显微荧光检测表明,绿色荧光蛋白基因在转基因植株中得到表达,为今后转基因浒苔研究奠定基础.     

表达苏云金杆菌5－内毒素基因的转基因烟草的抗虫性

苏云金杆蓠(Bacillus thuringiensis)HD-1的δ-内毒索基因原始克隆THl2和TH48分别含有5．3kb和6．6kb型类同源异族基因。经定点突变改造其5’端,酶切对3’端进行缺失后,在大肠杆菌中仍能表达出有杀虫活性的被修饰的毒蛋白。将上述加工过的基因插入到双元载体pBin437(pBinl9的派生质粒)中,借助辅助Ti质粒(Pal,1404转人烟草,获得了抗卡那霉索的再生植株。经southern印迹和狭槽印迹(slot blot)杂交证明有1-5个拷贝的毒素基因整合至烟草染色体中。Northern印迹法分析结果表明这两类基医都在转基因植株中得到表达。育4株5．3kb类型,3株6．6kb类型的转基因植株对烟青虫有高抗性,与对照相比,这7株转基因烟草植株的杀虫率可达40一50％,并能显著抑制昆虫蜕皮和生长发育,表现明显的抗虫作用。结果表明这两类毒蛋白基因都可在植物中表达并赋予转基因植株以抗虫性。     

盐胁迫下过表达BoRACK1基因对羽衣甘蓝种子萌发的影响

蛋白激酶C1受体(RACK1)是一个高度保守的蛋白,它具有多种功能,对植物生长发育有重要的调控作用。本研究构建过表达BoRACK1转基因羽衣甘蓝植株,以阐明该基因在羽衣甘蓝中对盐胁迫的可能功能。转基因羽衣甘蓝对盐胁迫的耐受力比野生型高,表现在其种子发芽率显著高于野生型;活性氧产生比野生型活跃,H_2O_2也可能参与BoRACK1调控的种子萌发过程。实时定量PCR分析表明,在过表达BoRACK1转基因植株中,BoRbohs基因的转录水平显著增强。这些结果表明,在种子萌发过程中,过表达BoRACK1正调控植物耐盐胁迫。     

β-1,3-葡聚糖酶基因高效表达载体的构建及对小麦的转化

利用PCR方法设计引物,进行特异扩增,在得到的BG2基因片段的两端引入可以与表达载体多克隆位点相匹配的酶切位点,将该基因插入高效表达载体质粒pATC940中,获得表达质粒pATCBG2。通过基因枪转化法,将pATCBG2转化优质小麦品种龙辐麦10、龙辐麦3号,获得抗卡那霉素(Kanamycin)的再生植株,经PCR,PCR—Southern和Dot—blotting检测,结果表明,有5个转基因植株在以上各项检测中全为阳性,证明目的基因已整合人这些转基因小麦基因组中。田间接菌发病检测结果表明,转基因植株比对照的抗病性提高1～2级。     

水稻蜡质基因5'上游区中31 bp序列增强基因表达的作用

为研究水稻蜡质基因 (Wx) 5’上游区中一个与胚乳核蛋白结合的 31bp序列在基因表达中的作用 ,将一系列包含或不包含此序列的长度不同的Wx启动区与 β 葡萄糖苷酸酶基因 (GUS)编码区连接 ,构建成嵌合质粒。将这些质粒通过农杆菌介导转化水稻幼胚愈伤组织 ,并分化产生转基因植株。分别测定抗性愈伤组织中与转基因植株未成熟种子胚乳中的GUS酶活性。结果表明含有 31bp序列的比不含此序列的Wx启动区使GUS报告基因的表达水平高出 2～ 3倍     

通过共转化和花药培养快速获得直链淀粉含量降低且无抗性标记的转基因水稻

用根癌农杆菌共转化的方法将p13W8质粒(含反义蜡质基因)和pCAMBIA1300质粒(含潮霉素抗性基因)导入水稻.经PCR检测,发现在29个T1群体中发生抗潮霉素抗性基因和反义蜡质基因的分离;从1 264个T1单株中筛选到183个只带反义蜡质基因片段的转基因植株.选择了4个直链淀粉含量降低的T1单株进行花药培养,获得正常结实的花培苗34株;经PCR检测,有23株为只含反义蜡质基因而无潮霉素抗性基因的植株.从转化到获得直链淀粉含量降低、遗传稳定的转基因植株仅用了一年半时间.     

利用花青素可视化跟踪表达系统快速筛选表达Cry1Ab/c基因的转基因玉米

以草甘膦抗性基因Epsps为标记基因, 在原核Kan^r基因两侧引入Cre(环化重组酶)基因识别的Lox-P位点, 同时以编码花青素合成转录因子的Bi和Cl基因为可视化选择报告基因, 构建了Bt杀虫蛋白基因Cry1Ab/c的可视化跟踪表达载体pBAC9017。用PDS1000/He基因枪转化玉米(Zea mays)自交系501的幼胚和胚性愈伤组织, 获得147个草甘膦抗性的玉米再生植株。其中106棵植株获得了结实种子, 16棵植株的结实种子有紫红色花青素基因的表达。经PCR检测表明, 外源Cry1Ab/c基因已经整合到玉米的基因组中。转基因植株种子蛋白粗提物用BT-Cry1Ab/1Ac金标免疫检测试纸条和ELISA检测, 结果表明, Cry1Ab/c在部分转基因植株后代中表达。     

矮牵牛编码F3′5′H的蓝色基因表达载体构建及转化

类黄酮3',5'羟基化酶(Flavonoid-3',5'hydroxylase,F3'5'H)是花色苷代谢途径中的一个关键酶,能使花色素合成趋向于形成蓝色的飞燕草色素,从而使花色向蓝紫色偏移.本研究从蓝紫色矮牵牛(Petunia hybrida)花瓣中克隆了编码F3'5,H的蓝色基因Hf1,并通过PCR技术获得百合花特异表达启动子(PchsA),将百合PchsA与Hf1基因融合,构建了百合花特异表达启动子调控的Hf1基因植物表达载体,通过农杆菌介导的叶盘法转化粉红色矮牵牛.抗性筛选和PCR检测鉴定转基因植株,结果表明,成功地获得了转基因阳性植株.     

矮牵牛编码 F3'5'H的蓝色基因表达载体构建及转化

类黄酮3',5'羟基化酶(Flavonoid-3',5'hydroxylase,F3'5'H)是花色苷代谢途径中的一个关键酶,能使花色素合成趋向于形成蓝色的飞燕草色素,从而使花色向蓝紫色偏移.本研究从蓝紫色矮牵牛(Petunia hybrida)花瓣中克隆了编码F3'5,H的蓝色基因Hf1,并通过PCR技术获得百合花特异表达启动子(PchsA),将百合PchsA与Hf1基因融合,构建了百合花特异表达启动子调控的Hf1基因植物表达载体,通过农杆菌介导的叶盘法转化粉红色矮牵牛.抗性筛选和PCR检测鉴定转基因植株,结果表明,成功地获得了转基因阳性植株.     

甘蓝型油菜BcNA1基因启动子在转基因烟草中对GUS基因表达的调控

通过PCR扩增,从甘蓝型油菜（Brassica napus)品种H165中克隆了种子贮藏蛋白基因BcNAl的启动子,将此启动子与GUS基因相连构建了植物表达载体,利用农杆菌介导法将其导入烟草,对转基因烟划GUS基因检测分析表明,BcNAl基因启动子能特异地启动GUS基因在种子中的表达;而且GUS酶的活性随着转基因烟草种子的发育而变化。同时还间接证明BcNA1基因的启动子在转基因烟草中的遗传传递方式符合盂德尔遗传定律。     

转基因水稻胚乳中表达铁结合蛋白提高稻米铁含量

为提高我国稻米的铁含量,通过农杆菌介导将自行克隆的菜豆(Phaseolus limensis)铁结合蛋白(Ferritin)基因导入了一个高产粳稻(Oryaz sativa L.ssp．japonuica)品种中,获得17个独立的转基因水稻株系。分子检测证明,外源基因在多数转基因水稻植株基因组中有1～3个整合位点,并可稳定遗传。在水稻种子贮存蛋白谷蛋白基因GluB-1启动子的控制下,铁结合蛋白基因可在转基因水稻的种子中高效特异地表达,不同转化子中的表达量有明显不同。在转基因水稻种子中表达铁结合蛋白后对提高精米中的铁含量有明显的效果,相对于未转化对照最多可提高64％,而锌的含量并无明显变化。